CN112147266B - 一种基于lc-ms技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法 - Google Patents

一种基于lc-ms技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于LC‑MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法，属于生物信息学技术领域。本发明采用LC‑MS技术分别对患脂肪肝病罗非鱼和正常罗非鱼的肝脏样品进行分析，并筛选鉴定患脂肪肝病罗非鱼与正常罗非鱼之间肝脏的差异代谢物，通过对差异代谢物进行通路分析及关联性分析，能够全面且综合的分析患脂肪肝病罗非鱼肝内营养物的转化及代谢路径，确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征。本发明的方法能为阐明患脂肪肝病罗非鱼肝内异常代谢机制提供有力的理论支撑，并为鱼类营养性疾病的代谢组学研究及作用机制的阐明提供示范。

Description

一种基于LC-MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特 征的方法
技术领域
本发明涉及生物信息学技术领域，尤其涉及一种基于LC-MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法。
背景技术
罗非鱼原产于非洲，其生长性能佳，抗逆能力强，肉品质好。近年来，随着罗非鱼养殖规模的扩大，集约化程度的提高，由于环境因素引发的非寄生性鱼病日趋严重，尤其是由于饵料营养失衡，如长期投喂高糖高脂饲料，易造成鱼类肝、肾、心等代谢调控组织损伤，引起肝细胞内脂肪沉积，继而导致营养性疾病，这其中以脂肪肝的危害最为严重。虽然脂肪肝病不具有传染性但其出现常常是大规模和全面性的。脂肪肝病影响罗非鱼生长、肉质与抗病力，严重时引发传染性疾病与其他综合症，给生产造成巨大的损失，挫伤养殖户的积极性。
脂肪肝病的成因多样。目前认为过量投喂或饲料营养素搭配不平衡是导致罗非鱼脂肪肝形成的主因。然而，各种营养物在罗非鱼肝内的转化及代谢机制仍不甚明确。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于LC-MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法，本发明的方法能够明晰患脂肪肝病罗非鱼肝内营养物异常的转化及代谢路径。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于LC-MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法，包括以下步骤：
1)利用LC-MS技术分别对患脂肪肝病罗非鱼的脂肪肝脏组织样品、正常罗非鱼的正常肝脏组织样品及质控样品进行检测，分别得到脂肪肝脏组织样品、正常肝脏组织样品及质控样品的LC-MS检测结果，利用所述LC-MS检测结果分别构建得到脂肪肝脏代谢物文库、正常肝脏代谢物文库及质控样品代谢物文库；
2)以所述质控样品代谢物文库作为参照，去除所述脂肪肝脏代谢物文库和正常肝脏代谢物文库中的低质量数据，得到脂肪肝代谢高质量数据和正常肝脏代谢高质量数据；
3)采用PLS-DA建模分析所述脂肪肝代谢高质量数据和正常肝脏代谢高质量数据，筛选变量重要性投影VIP值>1、每个物质在脂肪肝组和正常组间的倍数变化FC>2或FC<0.5且校正p值<0.05的物质为潜在差异代谢物；
4)利用在线代谢物数据库及本地质谱图库进一步识别和注释所述潜在差异代谢物，得到差异代谢物，所述本地质谱图库通过检测标准品代谢物获得；所述差异代谢物的注释条件为：与在线代谢物数据库中化合物理论质量的质量误差<10ppm且与本地质谱图库中标准品二级质谱图匹配的得分>0.95；
5)对所述差异代谢物进行通路分析，得到通路影响值，若所述通路影响值>0.01，表示该代谢通路为患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢的关联通路；
6)对所述差异代谢物进行关联分析，绘制代谢物网络关联图，明确各差异代谢物之间的相互关联。
优选的，在步骤1)所述检测前，还包括对所述患脂肪肝病罗非鱼的脂肪肝脏组织样品和正常罗非鱼的正常肝脏组织样品进行前处理；所述前处理包括：将脂肪肝脏组织样品和正常肝脏组织样品分别和体积百分含量为45％～55％的甲醇水溶液混合后，依次进行震荡破碎、静置、离心，收集上清液，分别得到脂肪肝脏前处理样品和正常肝脏前处理样品。
优选的，在步骤1)所述检测前，还包括质控样品的制备；所述质控样品的制备方法包括：分别吸取脂肪肝脏前处理样品和正常肝脏前处理样品各10μL置于1.5mL的EP管中，充分混匀后，得到质控样本。
优选的，步骤1)中所述脂肪肝脏组织样品的数量为9个；所述正常肝脏组织样品的数量为9个；所述质控样品的数量为7个；在步骤1)所述检测前，还包括待测样品上机排序；所述排序方法包括：9个脂肪肝脏组织样品和9个正常肝脏组织样品上机时进行随机排序，在这18个组织样品的前、中、后分别插入5个、1个、1个质控样品用于评估实验操作的可靠性。
优选的，步骤1)中所述LC-MS中液相色谱柱的规格为：ACQUITY UPLC BEH Amide，100mm×2.1mm，1.7μm；
所述LC-MS的流动相包括流动相A和流动相B；
所述流动相A由50mmol/L乙酸铵和50mmol/L氨水按体积比1：1混合配制而成；
所述流动相B为异丙醇和乙腈的混合溶液；所述混合溶液中异丙醇和乙腈的体积比为9：1；所述混合溶液中还包括体积百分含量为0.1％的甲酸；所述异丙醇和乙腈均为色谱纯试剂，纯度>99.9％；
所述LC-MS的洗脱程序为：
0～0.5min，所述流动相B的体积百分含量为95％；所述流动相A的体积百分含量为5％；
0.5～9.5min，所述流动相B的体积百分含量由95％匀速降低到65％；所述流动相A的体积百分含量由5％匀速升高到35％；
9.5～10.5min，所述流动相B的体积百分含量由65％所述流动相B的体积百分含量由40％；所述流动相A的体积百分含量由35％匀速升高到60％；
10.5～12min，所述流动相B的体积百分含量为40％；所述流动相A的体积百分含量为60％；
12～12.2min，所述流动相B的体积百分含量由40％匀速升高到95％；所述流动相A的体积百分含量由60％匀速降低到5％；
12.2～15min，所述流动相B的体积百分含量为95％；所述流动相A的体积百分含量为5％。
优选的，步骤1)中所述LC-MS的质谱程序包括正模式和负模式；
所述正模式的条件为：帘气为30PSI，雾化气为60PSI，辅助气为60PSI，加热器温度为650℃，离子喷雾电压为5500V，扫描范围为60～1200da；
所述负模式的条件为：帘气为30PSI，雾化气为60PSI，辅助气为60PSI，加热器温度为650℃，离子喷雾电压为-4500V，扫描范围为60～1200da。
优选的，所述对脂肪肝脏代谢物文库，正常肝脏代谢物文库及质控样品代谢物文库中的数据进行获取的方法包括：将所述脂肪肝脏代谢物文库和正常肝脏代谢物文库的数据分别转换为mzXML格式，使用XCMS软件对mzXML格式的数据进行峰比对，提取和定量峰值数据。
优选的，步骤2)中所述低质量数据包括：在少于3个质控样本或少于14个试验样本中检测到的数据及在7个质控样品中的变异系数>30％的数据。
优选的，步骤5)中所述通路分析采用MetaboAnalyst在线分析软件进行。
优选的，步骤6)中所述关联性分析采用Metamapp在线分析软件进行，并采用CytoScape软件进行绘制。
本发明的有益效果：本发明提供了一种基于LC-MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法，本发明采用LC-MS技术分别对患脂肪肝病罗非鱼和正常罗非鱼的肝脏样品进行分析，并筛选鉴定患脂肪肝病罗非鱼与正常罗非鱼之间肝脏的差异代谢物，通过对差异代谢物进行通路分析及关联性分析，能够全面且综合的分析患脂肪肝病罗非鱼肝内营养物的转化及代谢路径，确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征。本发明的方法能为阐明患脂肪肝病罗非鱼肝内异常代谢机制提供有力的理论支撑，并为鱼类营养性疾病的代谢组学研究及异常代谢路径的阐明提供示范，为今后治疗和缓解罗非鱼脂肪肝病提供了新的靶点，为患脂肪肝病罗非鱼肝内异常代谢调控机制的研究提供切入点。
附图说明
图1为吉富罗非鱼应激模型，其中A是摄食对照饲料吉富罗非鱼腹腔脂沉积状况，B是摄食高脂饲料吉富罗非鱼腹腔脂沉积状况，C是摄食对照饲料吉富罗非鱼肝脏，D是摄食高脂饲料吉富罗非鱼肝脏；
图2是LC-MS数据，其中A为正离子模式下的TIC图，B为负离子模式下的TIC图；
图3为PCA得分图；其中A为正离子模式下的PCA得分图，B为负离子模式下的PCA得分图；
图4为PLSDA分析及置换检验结果；其中A为正离子模式下的PLSDA得分图，B为正离子模式下的PLS-DA模型的置换检验结果，C为负离子模式下的PLSDA得分图，D为负离子模式下的PLS-DA模型的置换检验结果；
图5为差异代谢物的代谢通路分析图；
图6为差异代谢物的关联性分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于LC-MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法，包括以下步骤：
1)利用LC-MS技术分别对患脂肪肝病罗非鱼的脂肪肝脏组织样品、正常罗非鱼的正常肝脏组织样品及质控样品进行检测，分别得到脂肪肝脏组织样品、正常肝脏组织样品及质控样品的LC-MS检测结果，利用所述LC-MS检测结果分别构建得到脂肪肝脏代谢物文库、正常肝脏代谢物文库及质控样品代谢物文库；
2)以所述质控样品代谢物文库作为参照，去除所述脂肪肝脏代谢物文库和正常肝脏代谢物文库中的低质量数据，得到脂肪肝代谢高质量数据和正常肝脏代谢高质量数据；
3)采用PLS-DA建模分析所述脂肪肝代谢高质量数据和正常肝脏代谢高质量数据，筛选变量重要性投影VIP值>1、每个物质在脂肪肝组和正常组间的倍数变化FC>2或FC<0.5且校正p值<0.05的物质为潜在差异代谢物；
4)利用在线代谢物数据库及本地质谱图库进一步识别和注释所述潜在差异代谢物，得到差异代谢物，所述本地质谱图库通过检测标准品代谢物获得；所述差异代谢物的注释条件为：与在线代谢物数据库中化合物理论质量的质量误差<10ppm且与本地质谱图库中标准品二级质谱图匹配的得分>0.95；
5)对所述差异代谢物进行通路分析，得到通路影响值，若所述通路影响值>0.01，表示该代谢通路为患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢的关联通路；
6)对所述差异代谢物进行关联分析，绘制代谢物网络关联图，明确各差异代谢物之间的相互关联。
本发明基于所述差异代谢物及关联通路使患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢途径可视化。
本发明首先利用LC-MS技术分别对患脂肪肝病罗非鱼的脂肪肝脏组织样品、正常罗非鱼的正常肝脏组织样品及质控样品进行检测，分别得到脂肪肝脏组织样品、正常肝脏组织样品及质控样品的LC-MS检测结果，利用所述LC-MS检测结果分别构建得到脂肪肝脏代谢物文库、正常肝脏代谢物文库及质控样品代谢物文库。
在本发明中，用于LC-MS检测的所述脂肪肝脏组织样品的数量优选为9个；所述正常肝脏组织样品的数量优选为9个；所述质控样品的数量优选为7个。
在本发明中，所述利用LC-MS技术检测前，优选的还包括待测样品上机排序；所述排序方法包括：9个脂肪肝脏组织样品和9个正常肝脏组织样品上机时进行随机排序，在这18个组织样品的前、中、后分别插入5个、1个、1个质控样品用于评估实验操作的可靠性。
在本发明中，所述患脂肪肝病罗非鱼和正常罗非鱼优选的通过构建动物模型得到；所述患脂肪肝病罗非鱼动物模型的构建方法包括：饲喂罗非鱼高脂饲料50～60d；所述饲喂的时间优选为55d；所述高脂饲料中脂质的质量百分含量优选为18％～19％，进一步优选为18.5％；所述高脂饲料中蛋白的质量百分含量优选为30％～34％，更优选为32％。
本发明具体实施过程中，所述高脂饲料优选包括以下重量份的原料：鱼粉100份、酪蛋白76份、凝胶19份、玉米淀粉4.8份、豆油170份、豆粕120份、棉粕150份、菜粕150份、维生素预混料5份、矿物质预混料5份、氯化胆碱5份、Vc磷酸酯2份、磷酸二氢钙15份和α-纤维素178.2份；所述高脂饲料的粗蛋白的含量为32.87％；所述高脂饲料的粗脂肪的含量为18.41％；所述高脂饲料的总能量为150.5KJ/g。
在本发明中，所述正常罗非鱼动物模型的构建方法包括：饲喂罗非鱼常规饲料50～60d；所述饲喂的时间优选为55d；所述常规饲料中脂质的质量百分含量优选为7％～9％，进一步优选为8％；所述常规饲料中蛋白的质量百分含量优选为30％～34％，更优选为32％。
本发明具体实施过程中，所述常规饲料优选包括以下重量份的原料：100份、酪蛋白76份、凝胶19份、玉米淀粉237.7份、豆油68份、豆粕120份、棉粕150份、菜粕150份、维生素预混料5份、矿物质预混料5份、氯化胆碱5份、Vc磷酸酯2份、磷酸二氢钙15份和α-纤维素47.3份；所述常规饲料的粗蛋白的含量为32.68％；所述常规饲料的粗脂肪的含量为8.07％；所述常规饲料的总能量为147.7KJ/g。
在构建患脂肪肝病罗非鱼动物模型和正常罗非鱼动物模型的过程中，饲养条件相同，饲养条件优选的包括：采用循环流水进行养殖；饱食投喂；水温优选为27～29℃，更优选为28℃；水中溶氧优选的≥5mg/L；饲喂饲料的次数优选为2次/d，分别优选的是8：00和16：00各1次；每三天换水三分之一以保证水质清洁。
在本发明中，所述罗非鱼的品种优选的包括吉富罗非鱼。
本发明对所述肝脏组织的采集方法没有特殊限制，采用本领域常规采集方法即可。
在本发明中，所述利用LC-MS技术检测前，优选的还包括对所述患脂肪肝病罗非鱼的脂肪肝脏组织样品和正常罗非鱼的正常肝脏组织样品进行前处理；所述前处理包括：将脂肪肝脏组织样品和正常肝脏组织样品分别和体积百分含量为45％～55％的甲醇水溶液混合后，依次进行震荡破碎、静置、离心，收集上清液，分别得到脂肪肝脏前处理样品和正常肝脏前处理样品。在本发明中，所述甲醇水溶液的体积浓度优选为50％。在本发明中，所述患脂肪肝病罗非鱼的脂肪肝脏组织样品和正常罗非鱼的正常肝脏组织样品分别优选的经过冷冻处理；所述冷冻的温度优选为-80℃；所述震荡破碎的震荡频率优选为60Hz，时间优选为200s；所述静置的过程优选为冰上静置，所述静置的时间优选为8～12min，更优选为10min；所述离心的离心力优选为4000g，时间优选为20min。
在本发明中，所述利用LC-MS技术检测前，优选的还包括质控样品的制备；所述质控样品的制备方法包括：分别吸取脂肪肝脏前处理样品和正常肝脏前处理样品各10μL置于1.5mL的EP管中，充分混匀后，得到质控样本。
在本发明中，所述LC-MS中液相色谱柱的规格为：ACQUITY UPLC BEH Amide，100mm×2.1mm，1.7μm；
所述LC-MS的流动相包括流动相A和流动相B；
所述流动相A由50mmol/L乙酸铵和50mmol/L氨水按体积比1：1混合配制而成；
所述流动相B为异丙醇和乙腈的混合溶液；所述混合溶液中异丙醇和乙腈的体积比为9：1；所述混合溶液中还包括体积百分含量为0.1％的甲酸；所述异丙醇和乙腈均为色谱纯试剂，纯度>99.9％；
所述LC-MS的洗脱程序为：
0～0.5min，所述流动相B的体积百分含量为95％；所述流动相A的体积百分含量为5％；
0.5～9.5min，所述流动相B的体积百分含量由95％匀速降低到65％；所述流动相A的体积百分含量由5％匀速升高到35％；
9.5～10.5min，所述流动相B的体积百分含量由65％所述流动相B的体积百分含量由40％；所述流动相A的体积百分含量由35％匀速升高到60％；
10.5～12min，所述流动相B的体积百分含量为40％；所述流动相A的体积百分含量为60％；
12～12.2min，所述流动相B的体积百分含量由40％匀速升高到95％；所述流动相A的体积百分含量由60％匀速降低到5％；
12.2～15min，所述流动相B的体积百分含量为95％；所述流动相A的体积百分含量为5％。
在本发明中，所述LC-MS的质谱程序包括正模式和负模式；
所述正模式的条件为：帘气为30PSI，雾化气为60PSI，辅助气为60PSI，加热器温度为650℃，离子喷雾电压为5500V，扫描范围为60～1200da；
所述负模式的条件为：帘气为30PSI，雾化气为60PSI，辅助气为60PSI，加热器温度为650℃，离子喷雾电压为-4500V，扫描范围为60～1200da。
本发明在得到脂肪肝脏代谢物文库和正常肝脏代谢物文库及质控样品代谢物文库后，优选的还包括提取脂肪肝脏代谢物文库，正常肝脏代谢物文库及质控样品代谢物文库中的数据，采用的方法优选的包括：将所述脂肪肝脏代谢物文库，正常肝脏代谢物文库及质控样品中的原始数据用Proteowizard中的MSConvert软件转换为可读的mzXML格式数据，使用XCMS软件对mzXML格式的数据进行峰比对，提取和定量峰值数据；所述峰值数据为离子的强度信息。
在提取脂肪肝脏代谢物文库，正常肝脏代谢物文库及质控样品代谢物文库中的数据后，本发明以所述质控样品代谢物文库中的数据作为参照，去除所述脂肪肝脏代谢物文库和正常肝脏代谢物文库中的低质量数据，得到脂肪肝代谢高质量数据和正常肝脏代谢高质量数据。
在本发明中，优选的采用metaX数据分析软件对脂肪肝脏代谢物文库和正常肝脏代谢物文库中的数据进行处理，去除低质量数据；以参与检测的脂肪肝脏组织样品、正常肝脏组织样品和质控样品的数量分别为9个、9个、7个为例，所述低质量数据优选的包括：在少3个质控样品或少于14个试验样品(即脂肪肝脏组织样品和正常肝脏组织样品)中检测到的数据及在7个质控样品中的变异系数>30％的数据。
得到脂肪肝代谢高质量数据和正常肝脏代谢高质量数据后，本发明采用PLS-DA建模分析脂肪肝代谢高质量数据和正常肝脏代谢高质量数据，筛选变量重要性投影VIP值>1、每个物质在两组间的倍数变化FC>2或<0.5且校正p值<0.05的物质为潜在差异代谢物。
在确认潜在差异代谢物后，本发明利用在线代谢物数据库及本地质谱图库进一步识别和注释所述潜在差异代谢物，得到差异代谢物，所述本地质谱图库通过检测标准品代谢物获得；所述差异代谢物的注释条件为：与在线代谢物数据库中化合物理论质量的质量误差<10ppm且与本地质谱图库中标准品二级质谱图匹配的得分>0.95。
在本发明中，所述在线数据库优选的包括KEGG或HMDB；所述KEGG对应的网址为：http://www.genome.jp/kegg/；所述HMDB对应的网址为：http://www.hmdb/ca。本地质谱图库通过检测标准品代谢物获得。
得到差异代谢物后，本发明对所述差异代谢物进行通路分析，得到通路影响值，若所述通路影响值>0.01，表示该代谢通路为患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢的关联通路。在本发明中，所述通路分析优选的采用MetaboAnalyst在线分析软件进行。
得到差异代谢物后，本发明对所述差异代谢物进行关联分析，绘制代谢物网络关联图，明确各差异代谢物之间的相互关联，以更好地可视化通路信息以及明确不同的代谢物之间的潜在联系。在本发明中，优选的采用Metamapp在线分析软件对所述差异代谢物进行通路分析，采用CytoScape软件绘制代谢物网络关联图。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)基于LC-MS技术检测罗非鱼肝脏样品
配置两种不同脂肪水平的颗粒饲料：对照组(饲料蛋白含量32％，脂质含量8％)和高脂组(饲料蛋白含量32％，脂质含量18.5％)，饲料成分见表1。
表1饲料配方及营养成分
Figure BDA0002701057610000101
Figure BDA0002701057610000111
注：
Figure BDA0002701057610000112
维生素预混料每千克含:VA 10mg，VD 0.05mg，VE 400mg，VK 40mg，VB1 50mg，VB2200mg，VB3 500mg，VB6 50mg，VB7 5mg，VB11 15mg，VB12 0.1mg，VC 1000mg，肌醇2000mg，胆碱5000mg；§矿物质预混料每千克含:FeSO4·7H2O 372mg，CuSO4·5H2O 25mg，ZnSO4·7H2O120mg，MnSO4·H2O 5mg，MgSO4 2475mg，NaCl 1875mg，KH2PO4 1000mg，Ca(H2PO4)22500mg。
吉富罗非鱼幼鱼自渔场购得后，放入室内养殖桶内暂养。暂养期间采用循环流水进行养殖，水温保持在28±1℃，充氧泵增氧保持水中溶氧≥5mg/L。每三天换水三分之一以保证水质清洁。每天饱食投喂对照组饲料两次(8:00和16:00)。经一周暂养后，选取180尾体质健康，大小均一的吉富罗非鱼(5.02±0.01g)，分为两组，分别为高脂组和对照组，每组90尾，各随机放入3个循环养殖桶内，每桶30尾。试验期间每日饱食投喂试验饲料两次(8:00和16:00)，其他饲养条件与暂养期间相同。
本实验共分了两组，分别为高脂组和对照组，每组设置了三个平行(即每组分三个养殖桶养殖，共6桶)。养殖实验结束后，从这6桶中随机捞出3条，剖取肝脏组织，从而获得了上述9个高脂组样品和9个对照组样品。
养殖56d构建吉富罗非鱼高脂应激模型(图1)。采样前禁食24h，每次随机从桶中取出3尾鱼，用浓度100mg/LMS-222预先麻醉，快速剖取肝脏，经液氮速冻后置于-80℃冰箱中低温保存。
取低温保存后的肝脏样本于研钵中，经液氮低温研磨后取50mg置于1.5mL的EP管中。加入120μL预冷到4℃的50％甲醇水溶液，组织破碎机震荡(60Hz，200s)，将溶液取出放在冰上静置10min，然后以4000g离心20min。收集上清液，得到待测样品。
分别吸取各组待测样品10μL置于1.5mL的EP管中，充分混匀后，以20μL/管快速分装，制备7个质控样本，用于评估实验的可靠性。
对上述所提取的待测样品进行上机排序，样品进行随机排序，在样品前、中、后分别插入质控样品以评估本次实验的可靠性。采用高效液相色谱系统(SCIEX，英国)对肝脏样品中的小分子物质进行分离。LC-MS分析参数如表2所示
表2 LC-MS分析条件
Figure BDA0002701057610000121
所述LC-MS的洗脱程序即为：
0～0.5min，所述流动相B的体积百分含量为95％；所述流动相A的体积百分含量为5％；
0.5～9.5min，所述流动相B的体积百分含量由95％匀速降低到65％；所述流动相A的体积百分含量由5％匀速升高到35％；
9.5～10.5min，所述流动相B的体积百分含量由65％所述流动相B的体积百分含量由40％；所述流动相A的体积百分含量由35％匀速升高到60％；
10.5～12min，所述流动相B的体积百分含量为40％；所述流动相A的体积百分含量为60％；
12～12.2min，所述流动相B的体积百分含量由40％匀速升高到95％；所述流动相A的体积百分含量由60％匀速降低到5％；
12.2～15min，所述流动相B的体积百分含量为95％；所述流动相A的体积百分含量为5％。
使用高分辨率串联质谱仪TripleTOF5600plus(英国SCIEX)进行质谱数据采集。质谱仪分别在正和负模式下进行质谱数据采集，具体参数见表3。
表3高分辨率串联质谱仪参数
参数 正模式 负模式
帘气 30PSI 30PSI
雾化气 60PSI 60PSI
辅助气 60PSI 60PSI
加热器温度 650℃ 650℃
离子喷雾电压 5500V -4500V
扫描范围 60～1200da 60～1200da
得到LC-MS检测结果，如图2所示，其中A为正离子模式下的TIC图，B为负离子模式下的TIC图。
(2)差异代谢物的筛选与鉴定
①质谱数据的转换与过滤
LC-MS检测后得到的结果为图2所示的质谱图，在质谱图中每个质谱峰表示一种荷质比的离子，峰值数据即代表一种化合物离子，它指的是该物质在9个高脂组，9个对照组和7个质控样品中的离子强度。这里指的是在两种模式下检测获得了多少种化合物信息。每种模式下一共是有25列(9，9，7)数据信息。在获得LC-MS数据(图2)后，采用ProteoWizard中的MSConvert软件将原始数据转换为可读的mzXML格式数据。然后，使用XCMS软件(http://xcmsonline.scripps.edu)进行峰比对，提取和定量，在正离子和负离子模式下分别检测到10142和5826种峰值数据。峰值数据基于R语言的metaX数据分析软件(版本3.5.1)进一步处理以去除那些低质量的数据，低质量数据指在3个质控样品或14个的试验样品中检测到的数据及在7个质控样品中的变异系数>30％的数据。经处理与过滤后，在正离子和负离子模式分别有8977和4933种峰值数据被视为高质量数据，可以用于下一步分析。
②高脂组与对照组肝脏样本的PCA分析
用非监督的主成分PCA模型来考察高脂组与对照组的分类趋势，观察在非监督的情况下，两组代谢谱数据的分布状况。PCA得分图见图3，其中A为正离子模式下的PCA得分图，B为负离子模式下的PCA得分图；从图中可以看到QC样品聚类紧密，表明这些代谢谱质谱数据具有良好的稳定性。在正离子和负离子模式下，对照组和高脂组样本点区分度高，说明高脂饲喂导致吉富罗非鱼正常代谢受到了干扰。
③高脂组与对照组肝脏样本的PLSDA分析
相对于无监督的PCA模型，有监督的PLSDA模型更关注对分类做出显著贡献的化合物。因此本申请采用PLSDA建模来筛选对照组与高脂组间的差异代谢物。置换检验(n＝200)被用来评估PLSDA模型的有效性，PLSDA分析及置换检验结果见图4，其中A为正离子模式下的PLSDA得分图，B为正离子模式下的PLS-DA模型的置换检验结果，C为负离子模式下的PLSDA得分图，D为负离子模式下的PLS-DA模型的置换检验结果；正离子模式下PLSDA模型判别系数R2＝0.996，Q2＝0.980，负离子模式下PLSDA模型判别系数R2＝0.997Q2＝0.973，这说明采用PLSDA模型解释及预测性好。对PLSDA模型进行200次的置换检验，在正离子模式下得到的参数R2＝0.698，Q2＝-0.850，在负离子模式下得到的参数R2＝0.783，Q2＝-0.746，这说明本申请中PLSDA模型具有良好的可靠性。
根据PLSDA模型中变量重要性投影VIP值，BH(Benjaminiand Hochberg)法校正的p值以及每个物质在两组间的倍数变化(FC)筛选差异物质。同时满足VIP值>1，FC>2或<0.5且校正p值<0.05被视为潜在差异代谢物。根据以上原则，在正离子模式下筛选到了1922个潜在差异代谢物，在负离子模式下筛选到了980个潜在差异代谢物。
④差异代谢物的鉴定
根据化合物的分子质量，将潜在差异代谢物与KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)和HMDB(http://www.hmdb/ca)在线数据库进行比对。注释那些与在线数据库中化合物理论质量相比，质量误差<10ppm的差异代谢物，另外，采用本地质谱图库标准品二级质谱图对注释结果进行验证，筛选以获得与标准品二级质谱图匹配得分>0.95的差异代谢物。最终本申请在正离子模式和负离子模式分别鉴别得到了13和25个差异代谢物。其详细信息见表4。
表4肝脏差异代谢物
Figure BDA0002701057610000151
Figure BDA0002701057610000161
(3)差异代谢物的通路分析及关联性分析
①差异代谢物的通路分析
本申请将筛选得到的差异代谢物导入MetaboAnalyst4.0(http://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/)在线分析软件进行代谢通路分析，分析结果如图5所示。代谢通路分析后可得通路影响值(impactvalue)，当影响值大于0.01时，认为该条代谢通路在代谢网路中具有重要的影响，图5结果表明，患脂肪肝病罗非鱼共有13条代谢途径发生了变化，包括α-亚麻酸代谢；亚油酸代谢；苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成；谷胱甘肽代谢；戊糖和葡萄糖醛酸酯相互转化；果糖和甘露糖代谢；氨基糖和核苷酸糖代谢；嘧啶代谢；嘌呤代谢；酪氨酸代谢；泛酸和CoA生物合成；脂肪酸生物合成；淀粉和蔗糖代谢。
②差异代谢物关联性分析
最后，为了更好地可视化通路信息以及明确不同的代谢物之间的潜在联系，本申请将筛选得到的差异代谢物导入Metamapp(http://metamapp.fiehnlab.ucdavis.edu/)在线分析软件进行代谢物物关联分析后，利用CytoScape3.7.1软件制成代谢网络图(图6)。图6展示了不同差异代谢物之间的代谢关联性，不同类别的代谢物，例如氨基酸，脂肪酸，糖核苷酸等，都得到了清楚的聚类。
基于LC-MS对肝脏样本进行检测，同时结合正负离子模式识别的方法对样本进行代谢组学研究，结合代谢通路分析及代谢物关联性分析，对患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征进行探讨。我们发现患脂肪肝病罗非鱼不仅仅只有脂代谢发生了变化，氨基酸代谢，能量代谢等其他代谢过程也出现了显著的变化。基于此代谢组学的方法，推测过量的营养物(脂质)摄入会造成了三羧酸循环的拥塞，肝脏脂质、蛋白质及能量代谢的失调，肝脏代谢负担加重，导致了脂肪肝的形成。同时，通过此代谢组学的方法筛选得到的差异代谢物及代谢通路，也为今后治疗和缓解罗非鱼脂肪肝病提供了新的靶点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于LC-MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法，包括以下步骤：
1）利用LC-MS技术分别对患脂肪肝病罗非鱼的脂肪肝脏组织样品、正常罗非鱼的正常肝脏组织样品及质控样品进行检测，分别得到脂肪肝脏组织样品、正常肝脏组织样品及质控样品的LC-MS检测结果，利用所述LC-MS检测结果分别构建得到脂肪肝脏代谢物文库、正常肝脏代谢物文库及质控样品代谢物文库；
2）以所述质控样品代谢物文库作为参照，去除所述脂肪肝脏代谢物文库和正常肝脏代谢物文库中的低质量数据，得到脂肪肝代谢高质量数据和正常肝脏代谢高质量数据；
3）采用PLS-DA建模分析所述脂肪肝代谢高质量数据和正常肝脏代谢高质量数据，筛选变量重要性投影VIP值>1、每个物质在脂肪肝组和正常组间的倍数变化FC>2或FC<0.5且校正p值<0.05的物质为潜在差异代谢物；
4）利用在线代谢物数据库及本地质谱图库进一步识别和注释所述潜在差异代谢物，得到差异代谢物，所述本地质谱图库通过检测标准品代谢物获得；所述差异代谢物的注释条件为：与在线代谢物数据库中化合物理论质量的质量误差<10ppm且与本地质谱图库中标准品二级质谱图匹配的得分>0.95；
5）对所述差异代谢物进行通路分析，得到通路影响值，若所述通路影响值>0.01，表示该代谢通路为患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢的关联通路；
6）对所述差异代谢物进行关联分析，绘制代谢物网络关联图，明确各差异代谢物之间的相互关联；
在步骤1）所述检测前，还包括对所述患脂肪肝病罗非鱼的脂肪肝脏组织样品和正常罗非鱼的正常肝脏组织样品进行前处理；所述前处理包括：将脂肪肝脏组织样品和正常肝脏组织样品分别和体积百分含量为45%~55%的甲醇水溶液混合后，依次进行震荡破碎、静置、离心，收集上清液，分别得到脂肪肝脏前处理样品和正常肝脏前处理样品；
步骤1）中所述LC-MS的质谱程序包括正模式和负模式；所述正模式的条件为：帘气为30PSI，雾化气为60 PSI，辅助气为60 PSI，加热器温度为650℃，离子喷雾电压为5500V，扫描范围为60~1200da；所述负模式的条件为：帘气为30 PSI，雾化气为60 PSI，辅助气为60PSI，加热器温度为650℃，离子喷雾电压为-4500V，扫描范围为60~1200da；
步骤1）中所述LC-MS中液相色谱柱的规格为：ACQUITY UPLC BEH Amide，100 mm×2.1mm，1.7 µm；所述LC-MS的流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A由50 mmol/L乙酸铵和50 mmol/L氨水按体积比1：1混合配制而成；所述流动相B为异丙醇和乙腈的混合溶液；所述混合溶液中异丙醇和乙腈的体积比为9：1；所述混合溶液中还包括体积百分含量为0.1％的甲酸；所述异丙醇和乙腈均为色谱纯试剂，纯度>99.9%；
所述LC-MS的洗脱程序为：
0~0.5 min，所述流动相B的体积百分含量为95%；所述流动相A的体积百分含量为5%；
0.5~9.5min，所述流动相B的体积百分含量由95％匀速降低到65％；所述流动相A的体积百分含量由5%匀速升高到35%；
9.5~10.5min，所述流动相B的体积百分含量由65％所述流动相B的体积百分含量由40％；所述流动相A的体积百分含量由35%匀速升高到60%；10.5~12min，所述流动相B的体积百分含量为40％；所述流动相A的体积百分含量为60％；
12~12.2min，所述流动相B的体积百分含量由40％匀速升高到95％；所述流动相A的体积百分含量由60%匀速降低到5%；
12.2~15min，所述流动相B的体积百分含量为95%；所述流动相A的体积百分含量为5%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1）所述检测前，还包括质控样品的制备；所述质控样品的制备方法包括：分别吸取脂肪肝脏前处理样品和正常肝脏前处理样品各10μL置于1.5mL的EP管中，充分混匀后，得到质控样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述脂肪肝脏组织样品的数量为9个；所述正常肝脏组织样品的数量为9个；所述质控样品的数量为7个；在步骤1）所述检测前，还包括待测样品上机排序；所述排序方法包括：9个脂肪肝脏组织样品和9个正常肝脏组织样品上机时进行随机排序，在这18个组织样品的前、中、后分别插入5个、1个、1个质控样品用于评估实验操作的可靠性。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对脂肪肝脏代谢物文库，正常肝脏代谢物文库及质控样品代谢物文库中的数据进行获取的方法包括：将所述脂肪肝脏代谢物文库和正常肝脏代谢物文库的数据分别转换为mzXML格式，使用XCMS软件对mzXML格式的数据进行峰比对，提取和定量峰值数据。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述低质量数据包括：在少于3个质控样本或少于14个试验样本中检测到的数据及在7个质控样品中的变异系数>30%的数据。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）中所述通路分析采用MetaboAnalyst在线分析软件进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6）中所述关联性分析采用Metamapp在线分析软件进行，并采用CytoScape软件进行绘制。
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