CN110632289A - 一种曼氏无针乌贼衰老过程中的代谢生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种曼氏无针乌贼衰老过程中的代谢生物标志物，属于基因工程技术领域，该代谢生物标志物包含尿酸，其筛选方法包括：采集不同生殖阶段个体的血清样本；将血清样本进行预处理；对血清样本依次进行液相色谱‑质谱联用分析；对LC‑MS数据处理进行筛选，筛选出代谢生物标志物；对代谢生物标志物进行对比和指认；构建生物标志物的代谢通路并进行分析。本发明通过高效液相色谱‑串联质谱技术对不同生殖阶段曼氏无针乌贼的血清进行微量代谢组学分析，经过筛选，相比产卵前，尿酸的含量在产卵后有大幅的下降，产卵前含量/产卵后含量＝2.16，VIP＝1.5385，是一种潜在的代谢生物标志物。

Description

一种曼氏无针乌贼衰老过程中的代谢生物标志物
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种曼氏无针乌贼衰老过程中的代谢生物标志物。
背景技术
曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)属于软体动物门、头足纲、十腕目、乌贼科、无针乌贼属，是东海重要的经济种，有很高的食用、药用及经济价值。曼氏无针乌贼生命周期一般只有一年，其资源量是由当年的补充群体所组成。但是自20世纪70年代中期以来，由于环境条件的恶化、渔民过度捕捞，我国曼氏无针乌贼的资源遭到极大的破坏甚至已趋于枯竭。为了迅速恢复我国的曼氏无针乌贼资源、开展资源修复工作，加大人工养殖曼氏无针乌贼力度、实行苗种增殖放流，使这一宝贵的自然资源得到一定的恢复就成为当前的重要任务。曼氏无针乌贼在性腺发育成熟后会进行交配、产卵，产卵后的雌体消瘦而虚弱，不久即陆续死亡，有些死亡的雌体卵巢中尚存留不少大小不等的未成熟卵子。在养殖的曼氏无针乌贼的产卵期中发现，雌性乌贼由于产卵能量消耗巨大，死亡速度更快，死亡时腹中遗留有大量卵未产出。曼氏无针乌贼较鱼虾类怀卵量较低，平均怀卵量仅为1800粒，并且产卵量只有40％，亲本死亡时卵巢中还残留大量卵没有产出，造成了卵的巨大浪费，使产卵量严重降低，对乌贼资源的繁衍造成了严重的阻碍，也使乌贼群体不能得到有效的补充。如果可以延期乌贼的衰老，确保乌贼受精卵顺利孵化，使其可以至少在排完卵后死亡，就可达到提高乌贼养殖产量以及养护乌贼资源的目的。在当前曼氏无针乌贼资源衰竭的情况下，保护和修复曼氏无针乌贼变得刻不容缓，如何提高曼氏无针乌贼产卵量及延缓其衰老、延长其寿命，是最为亟需解决的问题。然而，目前国内外尚无曼氏无针乌贼的相关研究报道。如能对提高曼氏无针乌贼产卵量及其衰老机制进行研究，将必然会在曼氏无针乌贼养殖产业中产生巨大影响，对于人工选育和增殖放流事业的发展都将有重大的意义。在曼氏无针乌贼衰老的不同阶段中，血清中的某些代谢物含量会发生显著的变化，这种变化就预示着衰老程度的大小，那些代谢物也可以作为衰老过程中潜在的生物标志物。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种曼氏无针乌贼衰老过程中的代谢生物标志物。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种曼氏无针乌贼衰老过程中的代谢生物标志物，其包含尿酸。
优选的，曼氏无针乌贼衰老过程中尿酸的产卵前含量/产卵后含量＝2.16。
优选的，尿酸的VIP(权重变异重要性排序)＝1.5385。权重变异重要性排序(VIP)值是一种变量重要性因子。VIP值越高，代谢物的贡献率就越高，一般情况下VIP＞1则认为其具有统计学意义，说明尿酸是曼氏无针乌贼衰老过程中的代谢生物标志物。
本发明的又一目的，在于提供一种上述代谢生物标志物的筛选方法，包括：
采集衰老过程中不同生殖阶段曼氏无针乌贼个体的血清样本；
将所述血清样本进行预处理；
对血清样本依次进行液相色谱-质谱联用分析；
对液相色谱-质谱联用数据处理进行筛选，筛选出代谢生物标志物；
对代谢生物标志物进行对比和指认；
构建生物标志物的代谢通路并进行分析。
优选的，曼氏无针乌贼个体选自性成熟产卵前、产卵时和产卵后濒死时。
优选的，预处理的具体步骤为：将血清样本中加入2-4倍体积的乙腈，混合1-3min，4℃下静置5-15min，然后在10000-15000r/min下离心5-15min，取上清，真空干燥。
优选的，液相色谱条件为：采用Waters公司ACQUITYUPLC液相色谱系统；色谱柱：WatersACQUITYTMUPLCHSST3柱，2.1mm×100mm，1.8μm，40℃；流动相A为0.1％甲酸水溶液，B为0.1％甲酸-乙腈溶液。
优选的，质谱条件为：采用Waters公司SYNAPT G2-S质谱仪；采集质量范围：100-1500Da；采集模式：正负离子都测；毛细管电压：3(ESI+)；2.5(ESI-)；锥孔电压：100V；碰撞能量：6-45eV；电离源温度：120℃；脱液剂温度：500℃；锥孔气流速：60L/h。
优选的，尿酸的相对浓度在性成熟产卵前为4333.277；产卵时为2188.035；产卵前后为2001.929。
本发明的又一目的，在于提供一种上述代谢生物标志物的在预测和/或评估曼氏无针乌贼衰老中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过高效液相色谱-串联质谱技术对不同生殖阶段曼氏无针乌贼的血清进行微量代谢组学分析，寻找曼氏无针乌贼衰老过程中的代谢生物标志物，经过筛选，相比产卵前，尿酸(Uric acid)的含量在产卵后有大幅的下降，产卵前含量/产卵后含量＝2.16，VIP(权重变异重要性排序)＝1.5385，是一种潜在的代谢生物标志物，可用于在预测曼氏无针乌贼衰老。
本发明采用了上述技术方案提供一种曼氏无针乌贼衰老过程中的代谢生物标志物，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1是本发明实施例1中LC-MS数据归一化处理结果；
图2是本发明实施例1中单因素方差分析结果；
图3是本发明实施例1中聚类分析的树状图；
图4是本发明实施例1中聚类分析的热图；
图5是本发明实施例1中PCA分析的得分图；
图6是本发明实施例1中PLS-DA分析的得分图；
图7是本发明实施例1中代谢通路图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。
实施例1：
一种曼氏无针乌贼衰老过程中的代谢生物标志物的筛选方法
1.采集不同生殖阶段个体的血清样本：
所用曼氏无针乌贼从福建省福鼎市沙埕镇曼氏无针乌贼苗种繁育和养成示范基地获取，采集不同生殖阶段的个体(性成熟产卵前；产卵时；产卵后濒死时)的血清样本，分别标记为A，B，C三个组，每个组有6个重复。另外为了得到高灵敏度、高分辨率的高通量数据，取所有待测样品的等量混合物设置为质量控制组(QC组)。
2.将血清样本进行预处理：
取血清100μL，加入3倍体积的乙腈，涡旋震荡混合1-3min，4℃下静置10min，在离心机中使用13000r/min的转速离心10min，取上清，真空干燥。利用乙腈作为化合物提取及蛋白沉淀的试剂，能够提取较多的色谱峰，可一定程度上增加色谱的重现性与稳定性。
3.对血清样本依次进行液相色谱-质谱联用分析：
液相色谱条件如表1和表2(为了保证分析体系的稳定性，质量控制组样本分析被用于每次分析的初始及终末)，从表2可以看出，该梯度总时间仅为16min，可以保证大样本量代谢组学的高通量分析。质谱条件如表3。代谢组学的研究依赖于各种高通量的技术平台，如核磁共振(NMR)、液/气质联用(LC-MS；GC-MS)等，其技术线路就是先把代谢物通过色谱分离，再使用质谱进行鉴定。其中LC-MS的原理为：液相色谱以溶有样品的液体为流动相，以色谱柱为固定相，由于样品溶液中的各组分有着不同的分配系数，故在移动速度上会有明显的不同，从而达到分离的目的；质谱则将分离得到的物质离子化，按照离子的质荷比(m/z)进行分离，然后测量各种离子谱峰的强度进行分析鉴定。本实施例建立了稳定、可靠的曼氏无针乌贼血清代谢组学技术平台，之后的血清大规模代谢轮廓分析及组织极性代谢轮廓分析都将采用该技术平台来开展高通量数据的采集。
表1液相色谱条件表
仪器 Waters公司ACQUITY UPLC I-Class with FTN Sample Manger
色谱柱 Waters公司ACQUITY UPLC HSS T3，2.1*100mm，1.8μm，40℃
样品室温度 7℃
流动相A 水(Fisher Scientific，LC-MS级)；0.1％甲酸(纯度98％)
流动相B 乙腈(Fisher Scientific，LC-MS级)；0.1％甲酸(纯度98％)
表2液相色谱梯度条件设置
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 0.5 95 5
1 0.5 90 10
8 0.5 55 45
12 0.5 45 55
13 0.5 5 95
15 0.5 95 5
16 0.5 95 5
表3质谱条件表
Figure BDA0002217237510000041
Figure BDA0002217237510000051
4.LC-MS下机数据的筛选：
根据四分位数的间距(IQR)对质谱中检测到的所有片段质荷比(m/z)进行筛选，过滤掉质量不佳的片段；然后再以平均值/标准偏差作为条件，进行数据归一化处理，归一化的结果如图1所示，得到的归一化后的数据进行下一步分析。
5.生物信息学分析：
包括单因素方差分析；聚类分析；主成分(PCA)分析；偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)；权重变异重要性排序(VIP)分析；Chemspider数据库比对指认化合物；KEGG代谢通路分析。
6.结果分析：
单因素方差分析：以质荷比/保留时间(mz/rt)为横坐标，以P值的负对数为纵坐标，作图(如图2)，黑色点为有显著差异的代谢物，浅色点为非显著差异的代谢物。
聚类分析：对所有数据进行聚类分析，得到树状图(图3，图中GBY-10为A组性成熟产卵前个体，GBY-11代表B组产卵时个体，GBY-12代表C组产卵后濒死时个体，GBY-QC代表QC组质量控制组个体)和热图(图4)，根据树状图的分支情况可以看出同一个组的不同重复之间距离很近，基本都处于同一个分支，说明数据重复性良好。热图的结果显示了代谢物在不同组别中的含量。
主成分分析(PCA分析)：将多个指标或多个变量通过线性变换为少数主成分，第一个主成分是原始的n个描述符合适当的加权系数的线性组合，并且含有数据中最大的方差。第二个主成分各变量的第二个线性组合，和第一个主成分不相关的，对数据的描述的完整性居于第二位，以后的主成分则依次含有比第一第二主成分相对少的方差数，再通过算法进行统计分析。因此，在对一组n个描述符里有d个主要成分，可仅用最前面的2个主成分作为坐标而做出的得分图(score plot)，理论上能在二维内得出所有数据中最大的信息量。正负离子分析的PCA得分图如图5所示。在PCA得分图中每个点代表一个样品，A组、B组、C组、QC组的样本点分散于不同的区域，各组代谢图谱具有明显差异趋势，说明本实施例中的造模方法是可行的。
偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)：用一组结果已知的样品或分类建立数学模型，再用几组相互独立的有效的数据加以评估。PLS用隐变量建模的方法来导出不同数据块之间的关系，PLS中用到的隐变量在每个数据块中是相互正交的，并且是原始变量的线性组合。正负离子的PLS-DA得分结果如图6所示。由PCA分析和PLS-DA分析可以看出，各组之间有着明显的分离趋势和差异性，且PLS-DA的模型有较好的区分，存在较多的差异代谢物。
权重变异重要性排序(VIP)分析：VIP值是一种变量重要性因子。VIP值越高，代谢物的贡献率就越高，一般情况下VIP＞1则认为其具有统计学意义。
7.在筛选出差异代谢物后，在Chemspider数据库进行代谢物的对比和指认。
8.在KEGG在线数据库进行差异代谢物的代谢通路查找与分析。
经过上述的差异代谢物的筛选和生物信息学分析之后，得到一种差异代谢物尿酸(Uric acid/Urate)，其含量在产卵后有大幅度的下降，可能是曼氏无针乌贼产卵后死亡的一种潜在代谢生物标志物，其信息如表4所示。
表4曼氏无针乌贼血清尿酸(Uric acid/Urate)信息表
代谢物名称 尿酸
质荷比(m/z) 167.994313
性成熟产卵前相对浓度 4333.277
产卵时相对浓度 2188.035
产卵后濒死时相对浓度 2001.929
产卵前后相对浓度比值 2.16
VIP值 1.5385
KEGG数据库编号 C00366
所属代谢通路 Purine metabolism(图7)
Chemspider数据库链接 http://nonlinear.com/redirect/outbound？p＝chemspider&param＝1142
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.一种曼氏无针乌贼衰老过程中的代谢生物标志物，其特征在于：其包含尿酸。
2.根据权利要求1所述的代谢生物标志物，其特征在于：所述曼氏无针乌贼衰老过程中尿酸的产卵前浓度/产卵后浓度＝2.16。
3.根据权利要求1所述的代谢生物标志物，其特征在于：所述尿酸的VIP＝1.5385。
4.一种权利要求1或2或3所述的代谢生物标志物的筛选方法，其特征在于：包括：
采集衰老过程中不同生殖阶段曼氏无针乌贼个体的血清样本；
将所述血清样本进行预处理；
对血清样本依次进行液相色谱-质谱联用分析；
对液相色谱-质谱联用数据处理进行筛选，筛选出代谢生物标志物；
对所述代谢生物标志物进行对比和指认；
构建所述生物标志物的代谢通路并进行分析。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：所述曼氏无针乌贼个体选自性成熟产卵前、产卵时和产卵后濒死时。
6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：所述预处理的具体步骤为：将血清样本中加入2-4倍体积的乙腈，混合1-3min，4℃下静置5-15min，然后在10000-15000r/min下离心5-15min，取上清，真空干燥。
7.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：所述液相色谱条件为：采用Waters公司ACQUITYUPLC液相色谱系统；色谱柱：WatersACQUITYTMUPLCHSST3柱，2.1mm×100mm，1.8μm，40℃；流动相A为0.1％甲酸水溶液，B为0.1％甲酸-乙腈溶液。
8.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：所述质谱条件为：采用Waters公司SYNAPT G2-S质谱仪；采集质量范围：100-1500Da；采集模式：正负离子都测；毛细管电压：3(ESI+)；2.5(ESI-)；锥孔电压：100V；碰撞能量：6-45eV；电离源温度：120℃；脱液剂温度：500℃；锥孔气流速：60L/h。
9.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：所述尿酸的相对浓度在性成熟产卵前为4333.277；产卵时为2188.035；产卵前后为2001.929。
10.一种权利要求1或2或3所述的代谢生物标志物的在预测和/或评估曼氏无针乌贼衰老中的用途。
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