CN106324115A - 一种基于二级质谱的全离子监测定量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于二级质谱的全离子监测定量方法,该方法包括质谱数据采集和质谱数据处理两部分。质谱数据采集是通过将肽段液相分级和质谱气相分级技术相结合,并采用无动态排除的数据依赖性质谱扫描模式进行质谱数据的采集,从而实现对所有肽段的碎片离子的质谱全采集。完成质谱数据采集后,将归属于同一条肽段的多重标记肽段的二级谱子离子的质谱峰强度进行比较,进而实现不同样品间蛋白质的定量分析。该方法具有检测灵敏度高、噪音干扰低、重现性好、定量准确度高的优点,并在蛋白质组学的规模化定性和定量分析方面有着广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于二级质谱的全离子监测定量方法及其应用,能够实现蛋白质样品的高准确度定量,具有检测灵敏度高、噪音干扰低、重现性好的优点,在蛋白质组学的规模化定性和定量分析方面有着广阔的应用前景。
背景技术
近年来,随着高精度生物质谱技术的发展和基于生物信息学的海量数据处理技术的进步,基于生物质谱的蛋白质组定量方法成为定量蛋白质组的主流技术。基于鸟枪法的蛋白质组分析中,目前质谱数据的采集主要是采用数据依赖性模式,其中低丰度蛋白质的肽段母离子容易被高丰度肽段母离子抑制,无法进行二级质谱的采集,从而丢失低丰度蛋白质的定性和定量信息,降低了蛋白质定性和定量分析的灵敏度和准确度。同时,动态排除的设置虽然可以显著性地提高蛋白质的鉴定数目,但大多数肽段仅能触发一次碰撞碎裂,从而只能采集肽段在某一特定时刻的二级谱离子进行定量分析,降低了蛋白质组,尤其是其中低丰度蛋白质定量的灵敏度和准确度(Zhang,Y.Y.,et al.(2013)."Protein Analysis by Shotgun/Bottom-up Proteomics."ChemicalReviews 113(4):2343-2394)。此外,超过4个以上氘标标签的引入会引起轻、重标记肽段保留时间的偏移,动态排除的设置会导致定量准确度的降低。近年来,发展的基于非数据依赖性模式质谱采集的定量方法(SWATH18、PRM19),虽然能有效地解决二级谱定量信息丢失的问题,但产生的二级质谱图复杂度成倍增加(Rost,H.L.,et al.(2014)."OpenSWATH enables automated,targeted analysis ofdata-independent acquisition MS data."Nature Biotechnology 32(3):219-223.)。此外,该方法无法实现在单次实验中同时完成蛋白质的定性和定量分析,并且背景噪音对低丰度肽段的碎片离子干扰严重,影响低丰度蛋白质的定量灵敏度。因此,如何在不降低蛋白质定量数目的前提下,采用无动态排除的质谱数据依赖性模式,检测肽段的所有二级质谱图,从而发展基于全离子监测的二级谱定量方法,对于提高蛋白质定性和定量分析的灵敏度和准确度,进而实现蛋白质组的深度解析具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的在于发展一种基于二级质谱的全离子监测定量方法,通过该方法能够有效地提高蛋白质定性和定量分析的灵敏度、准确度和精密度,从而实现蛋白质组高准确度的深度解析。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:使用液相分级和质谱气相分级技术相结合的方法对肽段进行处理,并采用无动态排除的数据依赖性质谱扫描模式进行质谱数据的采集,从而实现对所有肽段的子离子质谱数据的全采集;完成质谱数据采集后,将归属于同一条肽段的多重标记肽段的二级谱子离子的质谱峰强度进行比较,进而实现不同样品间蛋白质的定量分析。
具体为:
1、将蛋白质样品的酶解肽段采用反相液相色谱法、离子交换液相色谱法、疏水液相色谱法分级、亲和液相色谱法分级、体积排阻液相色谱法分级、亲水液相色谱法分级、超临界流体液相色谱法分级、液相等电聚焦分级、毛细管电泳法分级、自由流电泳法进行分级,以降低蛋白质样品的复杂程度;
2、将液相分级得到的各组份分别进行质谱气相分级和质谱检测。其中采用的质谱仪按其质量分析器的类型为四极杆质谱仪、离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪和傅里叶变换离子回旋共振质谱仪、傅里叶变换静电场轨道阱质谱仪、磁质谱仪中的任意一种或多种组合;其中质谱气相分级方法为:1)将母离子质谱采集的窗口,质荷比300-6000m/z范围内的任意区间分为等间隔或不等间隔的若干连续窗口,每个窗口大小为5m/z(质荷比)-1500m/z(质荷比);2)液相色谱分离-质谱检测分析中,单次进样,质谱数据采集仅针对上述分割后的一个小窗口中的母离子进行碎裂以及子离子二级谱的采集,其中质谱的采集模式设置为无动态排除的数据依赖性模式;3)下一次进样,采用与上述2)步骤相同的方法对新的分割窗口进行质谱数据采集,直到完成了对母离子所有分割区间的质谱数据采集。
3、完成质谱数据采集后,将归属于同一条肽段的多重标记肽段的二级谱子离子的质谱峰强度进行比较,其中二级谱子离子质谱峰强度为:多重标记肽段中共同鉴定到的所有二级谱子离子的质谱峰强度的累加和;或多重标记肽段中共同鉴定到的质谱峰强度最高的前N个子离子的质谱峰强度的累加和,其中N为1-20中任意整数。进而将归属于同一蛋白质的多重标记的同一条肽段的质谱峰强度进行比较,得到肽段的定量比值后,再将归属于该蛋白的所有共同鉴定到的肽段的定量比值取平均值或中位数或加权平均值,最终的结果为该蛋白质的相对定量结果;或将多重标记样品中,归属于同一蛋白质的共同鉴定到的肽段的质谱峰强度进行累加,累加和作为该蛋白质的质谱峰强度,再将不同标记样品中该蛋白质的质谱峰强度进行比值计算,最终的结果为该蛋白质的相对定量结果,从而实现不同样品间蛋白质的定量分析。
4、本发明提供的方法能够用于不同生理或病理状态下的生物体蛋白质样品的定性和定量分析、单细胞系的蛋白质组定性和定量分析、或生物体不同亚细胞器间的蛋白质组定性和定量分析、或基因组高度相似的生物体间的蛋白质组定性和定量分析。
本发明具有如下优点:
1.定性和定量分析灵敏度高。基于二级谱的全离子监测定量方法,较基于动态排除的二级谱定量方法,能够在不降低蛋白质鉴定能力的基础上,有效地解决质谱数据采集过程中低丰度蛋白质酶解肽段的定量信息丢失严重且易被背景噪音干扰等问题,提高了蛋白质组定性和定量分析的灵敏度。
2.定性和定量分析准确度高。基于二级谱的全离子监测定量方法,能够采集所有的二级谱离子进行定性和定量分析,提高了蛋白质定性和定量分析准确度。
具体实施方式
实施例1
1、蛋白质酶解:将经SILAC试剂盒培养且分别赖氨酸轻、重标记的两份Hela细胞按1:1混合,采用8mol/L的尿素溶液(溶于50mM碳酸氢铵溶液,pH 8)对蛋白质进行超声破碎提取后,采用BCA试剂盒测定蛋白质浓度,测定得到的蛋白质浓度为1mg/mL。取1mL浓度为1mg/mL的蛋白溶液,加入10μL浓度为10mM二硫苏糖醇(DTT)溶液,56℃下,反应2h进行蛋白质的变性和还原处理。随后,通入10μL浓度为25mM碘乙酰胺(IAA)溶液,室温下避光反应30min进行蛋白质的烷基化处理。最后,加入25μg的胰蛋白酶(溶于50mM碳酸氢铵溶液,pH 8)进行蛋白质的酶解。37℃酶解12小时后,加入10μL甲酸溶液终止酶解。
2.蛋白质酶解产物的液相分级:将1mL浓度为1mg/mL的Hela细胞蛋白质酶解产物溶液经高pH反相色谱分级,流动相A为2%(v/v,体积比)乙腈及氨水,pH 10,流动相B为98%(v/v,体积比)乙腈及氨水,pH 10用于进行梯度分离。梯度为2-8%B(0-2min),8%-18%B(2-19min),18-30%B(19-33min),30%-35%B(33-34min)。35-80%B(34-35min),80%-80%B(35-36min)。自动馏分收集器以1min的时间间隔收集馏分,将相隔9min的间隔组分进行混合(馏分1、10、19和28,馏分2、11、20和29等),最终得到9个混合馏分进行冻干后,用150μL 0.1%(v/v,体积比)的甲酸水溶液进行重溶。
3.液相分离、质谱气相分级与质谱检测:将母离子质谱采集的质荷比(300-1250m/z)窗口分为质荷比为300-500、494-600、594-700、694-800、794-900、894-1050、1044-1250七个连续窗口;2)单次进样,经液相色谱分离后,质谱数据采集仅针对上述分割后的一个小窗口中的母离子进行碎裂以及子离子二级谱的采集,其中质谱的采集模式设置为无动态排除的数据依赖性模式;3)下一次进样,采用与上述2)步骤相同的方法对新的分割窗口进行质谱数据采集,直到完成了对母离子所有分割区间的质谱数据采集。
3.数据分析:完成质谱数据采集后,将多重标记肽段中共同鉴定到的所有二级谱子离子的质谱峰强度的加和,进而将归属于同一蛋白质的多重标记的同一条肽段的质谱峰强度进行比较,得到肽段的定量比值后,再将归属于该蛋白的所有共同鉴定到的肽段的定量比值分别取平均值、中位数或加权平均值,最终的结果为该蛋白质的相对定量结果,三种算法下,所有重标与轻标蛋白质的定量平均值依次为1.1、1.3和1.2,定量到的蛋白质丰度范围为7个数量级,结果显示我们发展的定量方法具有很高的定量准确度和分析灵敏度。
实施例2
1、蛋白质酶解:将经SILAC试剂盒培养且分别赖氨酸轻、重标记的两份老鼠肝癌高、低转移细胞按1:1混合,采用8mol/L的尿素溶液(溶于50mM碳酸氢铵溶液,pH 8)对蛋白质进行超声破碎提取后,采用BCA试剂盒测定蛋白质浓度,测定得到的蛋白质浓度为1mg/mL。取1mL浓度为1mg/mL的蛋白溶液,加入10μL浓度为10mM二硫苏糖醇(DTT)溶液,56℃下,反应2h进行蛋白质的变性和还原处理。随后,通入10μL浓度为25mM碘乙酰胺(IAA)溶液,室温下避光反应30min进行蛋白质的烷基化处理。最后,加入25μg的胰蛋白酶(溶于50mM碳酸氢铵溶液,pH 8)进行蛋白质的酶解。37℃酶解12小时后,加入10μL甲酸溶液终止酶解。
2.蛋白质酶解产物的液相分级:将1mL浓度为1mg/mL的细胞蛋白质酶解产物溶液经高pH反相色谱分级,流动相A为2%(v/v,体积比)乙腈及氨水,pH 10,流动相B为98%(v/v,体积比)乙腈及氨水,pH 10用于进行梯度分离。梯度为2-8%B(0-2min),8%-18%B(2-19min),18-30%B(19-33min),30%-35%B(33-34min)。35-80%B(34-35min),80%-80%B(35-36min)。自动馏分收集器以1min的时间间隔收集馏分,将相隔9min的间隔组分进行混合(馏分1、10、19和28,馏分2、11、20和29等),最终得到9个混合馏分进行冻干后,用150μL 0.1%(v/v,体积比)的甲酸水溶液进行重溶。
3.液相分离、质谱气相分级与质谱检测:将母离子质谱采集的质荷比(300-1250m/z)窗口分为质荷比为300-400、394-500、494-600、594-700、694-800、794-900、894-1050、1044-1250八个连续窗口;2)单次进样,经液相色谱分离后,质谱数据采集仅针对上述分割后的一个小窗口中的母离子进行碎裂以及子离子二级谱的采集,其中质谱的采集模式设置为无动态排除的数据依赖性模式;3)下一次进样,采用与上述2)步骤相同的方法对新的分割窗口进行质谱数据采集,直到完成了对母离子所有分割区间的质谱数据采集。
3.数据分析:完成质谱数据采集后,将多重标记肽段中共同鉴定到的质谱峰强度最高的前5个子离子的质谱峰强度加和,进而将多重标记样品中,归属于同一蛋白质的共同鉴定到的肽段的质谱峰强度进行累加,累加和作为该蛋白质的质谱峰强度,再将不同标记样品中该蛋白质的质谱峰强度进行比值计算,最终的结果为该蛋白质的相对定量结果,共定量到1046个蛋白质。定义重标和轻标比值在[0.5-2]之间的蛋白质含量无显著性差异。重标和轻标比值小于0.5的蛋白质含量发生显著性下调,而重标和轻标比值大于0.5的蛋白质含量发生显著性上调。最终鉴定到9个蛋白质发生显著性下调,12个蛋白质发生显著性上调。
Claims (7)
1.一种基于二级质谱的全离子监测定量方法,其特征在于:使用液相分级和质谱气相分级技术相结合的方法对肽段进行处理,并采用无动态排除的数据依赖性质谱扫描模式进行质谱数据的采集,从而实现对所有肽段的子离子质谱数据的全采集;完成质谱数据采集后,将归属于同一条肽段的多重标记肽段的二级谱子离子的质谱峰强度进行比较,进而实现不同样品间蛋白质的定量分析。
2.根据权利要求1所述的定量方法,其特征在于:所述液相分级的方法为:反相液相色谱法分级、离子交换液相色谱法分级、疏水液相色谱法分级、亲和液相色谱法分级、体积排阻液相色谱法分级、亲水液相色谱法分级、超临界流体液相色谱法分级、液相等电聚焦分级、毛细管电泳法分级或自由流电泳法分级中的一种或二种以上。
3.根据权利要求1所述的定量方法,其特征在于:所述质谱气相分级方法为:1)将母离子质谱采集的质荷比窗口分为若干连续窗口,其中母离子的质谱采集的质荷比窗口为质荷比300-6000m/z范围内的任意区间;2)液相色谱分离-质谱检测分析中,单次进样,质谱数据采集仅针对上述分割后的一个小窗口中的母离子进行碎裂以及二级谱的采集,其中质谱的采集模式设置为无动态排除的数据依赖性模式;3)下一次进样,采用与上述2)步骤相同的方法对新的分割窗口进行质谱数据采集,直到完成了对母离子所有分割区间的质谱数据采集。
4.根据权利要求1所述的定量方法,其特征在于:质谱检测所采用的质谱仪按其质量分析器类型为四极杆质谱仪、离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪、傅里叶变换离子回旋共振质谱仪、傅里叶变换静电场轨道阱质谱仪或磁质谱仪中的任意一种或其中二种以上的组合。
5.根据权利要求1所述的定量方法,其特征在于:所述“将归属于同一条肽段的多重标记肽段的二级谱子离子的质谱峰强度进行比较”中所涉及到的用于比较的二级谱子离子质谱峰强度为:多重标记肽段中共同鉴定到的所有二级谱子离子的质谱峰强度的累加和,或多重标记肽段中共同鉴定到的质谱峰强度最高的前N个子离子的质谱峰强度的累加和,其中N为1-20中任意整数。
6.根据权利要求1所述的定量方法,其特征在于:所述“将归属于同一条肽段的多重标记肽段的二级谱子离子的质谱峰强度进行比较,进而实现不同样品间蛋白质的定量分析”中由肽段水平的质谱峰强度比较得到蛋白质的相对定量结果方法为:将归属于同一蛋白质的多重标记的同一条肽段的质谱峰强度进行比较,得到肽段的定量比值后,再将归属于该蛋白的所有共同鉴定到的肽段的定量比值取平均值或中位数或加权平均值,最终的结果为该蛋白质的相对定量结果;或将多重标记样品中,归属于同一蛋白质的共同鉴定到的肽段的质谱峰强度进行累加,累加和作为该蛋白质的质谱峰强度,再将不同标记样品中该蛋白质的质谱峰强度进行比值计算,最终的结果为该蛋白质的相对定量结果。
7.根据权利要求3所述的定量方法,其特征在于:所述将母离子质谱采集的质荷比窗口分为若干连续窗口,分割后得到的质谱采集窗口大小为等间隔或不等间隔的,每个窗口大小为质荷比5m/z-1500m/z。
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