KR101311412B1

KR101311412B1 - 당 동정을 위한 새로운 생물정보처리 분석 방법

Info

Publication number: KR101311412B1
Application number: KR1020110042607A
Authority: KR
Inventors: 박건욱; 안현주; 김재한; 레브릴라 칼리토; 유종신
Original assignee: 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2011-05-04
Filing date: 2011-05-04
Publication date: 2013-09-25
Also published as: KR20120124767A

Abstract

본 발명은 혈액내 당단백질에 당(N-glycan)의 동정을 위해 고분해능 질량분석기(MALDI FT-ICR)를 이용한 질량 스펙트럼 검색 결과를 분석하는 방법에 대한 것으로, 구체적으로 당 절단 효소에 의해 분리된 당을 고분해능 질량분석기(MALDI FT-ICR)로 분석하여 질량 스펙트럼을 얻는 단계(단계 1); 상기 질량 스펙트럼에서 노이즈를 제거하고, 피크를 선택하여 피크의 리스트를 작성하는 단계(단계 2); 상기 피크 리스트에서 동위원소들을 그룹화하는 단계(단계 3); 상기 피크 리스트에서 당 데이터베이스로부터 이론적으로 가능한 동위원소 분포를 모델링하는 단계(단계 4); S-스코어를 계산하고, S-스코어가 4.5 이상인 당을 동정하는 단계(단계 5); 상기 동정된 당을 기본으로 하여 상관관계 분석을 통하여 추가적으로 당(Branching N-glycan)을 동정하는 단계(단계 6); 상기 동정된 당들을 확인하고, 프로파일링 및 상관관계 맵을 작성하는 단계(단계 7)를 포함하는 생물정보처리 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명은 고분해능 질량분석기(MALDI FT-ICR)로부터 얻은 질량 스펙트럼의 결과를 이용하여 상대적으로 낮은 감도(또는 농도)로 존재하는 당을 효율적이고 정확히 동정 및 정량화하여, 질병 표지자(Biomarker)인 당을 발견하여 효과적으로 암을 예측, 진단할 수 있는 기술에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

당 동정을 위한 새로운 생물정보처리 분석 방법{New Bioinformatics Platform for High-Throughput Profiling of N-Glycans}

본 발명은 질량 스펙트럼의 결과로부터 당 동정을 위한 새로운 생물정보처리 분석 방법에 관한 것이다.

인간 혈액 시료는 수많은 단백질들의 혼합체이며, 이 중에서 50% 이상이 당단백질이라고 알려져 있다. 하지만 당단백질은 당의 다양성 때문에 정성, 정량 분석이 단백체 또는 유전체 분석에 비하여 상대적으로 어렵다. 하지만 고분해능 질량분석기의 도입으로 당 및 당단백질의 분석이 빠른 속도로 발전하였다. 그럼에도 불구하고 당을 분석할 수 있는 생물정보처리 기술이 아직까지 미약하다.

일반적으로, 당단백질의 당을 분석하기 위하여 단백질 레벨에서 농축단계를 거친다. 그리고 당 절단 효소(PNGase F)를 이용하여 당을 분리한 뒤에 질량 분석기를 이용하여 분석을 수행한다. 이 경우 전체 질량 스펙트럼(MS)을 이용하거나, 또는 탄뎀 질량 스펙트럼(MS/MS)의 패턴 비교로부터 당을 동정할 수 있다.

현재 질량 스펙트럼 또는 탄뎀 질량 스펙트럼을 이용하여 당을 검색하는 소프트웨어에는 GlycoMod(http://expasy.org/tools/glycomod/), GlycospectrumScan(http://137.111.165.44/glycoSpectrumScan_REFINED/query_page), SimGlycan(http://glycotools.qa-bio.com/SimGlycan) 등의 프로그램이 개발되어 사용되고 있다.

그러나 탄뎀 질량 스펙트럼은 전체 질량 스펙트럼에서 상대적인 농도가 높은 것부터 분석을 수행하기 때문에, 탄뎀 질량 스펙트럼으로 당을 프로파일링 할 경우 낮은 감도(또는 농도)(Low-abundant)의 당을 찾는 것에는 어려움이 있다.

따라서, 질량 스펙트럼의 결과로부터 상대적으로 감도(또는 농도)가 낮은(Low abundant) 당들에 대해서도 효율적이고 정확히 동정할 수 있는 새로운 분석 방법이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제를 해결하고, 질량 스펙트럼의 결과로부터 상대적으로 감도(또는 농도)가 낮은(Low abundant) 당들에 대해서도 효율적이고 정확히 동정할 수 있는 분석 방법을 연구하던 중, 탄뎀을 수행하지 않고, 고분해능의 질량 분석기(MALDI FT-ICR)를 이용하여 전체 질량 스펙트럼을 얻은 다음, 정확한 질량 뿐 아니라, 피크의 강도(Intensity)까지 고려하여 피크의 동위원소 분포를 그룹화하고, 데이터베이스로부터 당 동위원소 모델링 결과와 비교하여 스코어를 계산함으로써 보다 상대적으로 낮은 농도(Low-abunsant)의 당을 정확히 동정할 수 있음을 알아내고, 이를 통해 암을 예측, 진단할 수 있는 질병 표지자 후보를 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 질량 스펙트럼의 결과로부터 상대적으로 감도(또는 농도)가 낮은(Low abundant) 당들에 대해서도 효율적이고 정확히 동정할 수 있는 생물정보처리 분석 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법에 의해 분석된 악성 종양의 질병 표지자 후보를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

당 절단 효소(PNGase F)에 의해 분리된 당을 고분해능 질량분석기(MALDI FT-ICR)로 분석하여 질량 스펙트럼을 얻는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 얻은 질량 스펙트럼에서 노이즈를 제거하고, 피크(Peak)를 선택하여 피크의 리스트를 작성하는 단계(단계 2);

상기 단계 2에서 작성된 피크 리스트에서 동위원소들을 그룹화(Isotope Grouping)하는 단계(단계 3);

상기 단계 2에서 작성된 피크 리스트에서 당 데이터베이스로부터 이론적으로 가능한 동위원소 분포를 모델링하는 단계(Isotopic Modeling)(단계 4);

상기 단계 3 및 4로부터 S-스코어를 계산하고, S-스코어가 4.5 이상인 당을 동정하는 단계(단계 5);

상기 단계 5에서 동정된 당을 기본으로 하여 상관관계 분석을 통하여 추가적으로 당(Branching N-glycan)을 동정하는 단계(단계 6);

상기 단계 5 및 단계 6에서 동정된 당들을 확인하고, 프로파일링 및 상관관계 맵을 작성하는 단계(단계 7)를 포함하는 혈액시료로부터 당 동정을 위한 새로운 생물정보처리 분석 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법에 의해 분석된 악성 종양의 질병 표지자 후보를 제공한다.

본 발명은 고분해능 질량분석기(MALDI FT-ICR)로부터 얻은 질량 스펙트럼의 결과를 이용하여 상대적으로 낮은 감도(또는 농도)로 존재하는 당을 효율적이고 정확히 동정 및 정량화하여, 질병 표지자(Biomarker)인 당을 발견하여 효과적으로 암을 예측, 진단할 수 있는 기술에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 인간 혈액 시료로부터 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법을 도식화한 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 단계 2의 다수 반복 분석된 질량 스펙트럼로부터 작성된 전체 피크를 나타내는 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 단계 2의 다수 반복 분석된 질량 스펙트럼로부터 피크들을 비교하여 리스트로 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 ACN-10% 분치 시료의 단계 5의 S-스코어의 분포도를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 ACN-20% 분치 시료의 단계 5의 S-스코어의 분포도를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 ACN-40% 분치 시료의 단계 5의 S-스코어의 분포도를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 단계 7의 당을 프로파일링한 결과를 벤다이어그램으로 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 ACN-10% 분치 시료의 단계 7의 상관관계 맵을 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 ACN-20% 분치 시료의 단계 7의 상관관계 맵을 나타내는 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 ACN-40% 분치 시료의 단계 7의 상관관계 맵을 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 당 동정을 위한 생물정보처리 분석 방법을 통해 악성종양의 당을 프로파일링한 결과를 벤다이어그램으로 나타낸 도면이다.

본 발명을 명확하게 설명하기 위하여 본 명세서에 기재된 용어의 정의를 아래와 같이 설명한다.

"PNGase F(peptide-N-glycosidase F)"는 당단백질로부터 당만을 분리하는 당 절단 효소를 말한다.

"MALDI FT-ICR(Matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance)"는 MALDI 이온화 방법을 이용한 소스(source)와 7T FT-ICR의 고분해능 질량분석기를 의미한다.

탄뎀 질량분석은 전체 질량 스펙트럼(MS)으로부터 관심있는 이온 또는 상대적으로 감도가 높은 이온들을 선택하여 분석한 스펙트럼(MS/MS)의 질량을 분석하는 방법이다.

"동위원소(Isotopic)"는 원자 번호가 같지만 원자량이 다른 화학 원소를 말한다.

"동위원소 그룹화(Isotope Grouping)"는 실험적으로 얻은 피크 리스트로부터 확인된 동위원소를 그룹화하는 것을 말한다.

"N-glycan Isotopic Modeling"은 데이터베이스로부터 이론적으로 가능한 당의 동위원소 분포를 의미한다.

"S-스코어(Similarity Score)"는 실험에서 얻은 동위원소 피크 분포와 데이터베이스에서 유추한 이론적인 동위원소 피크 분포의 유사 정도를 수치로 나타낸 것을 의미한다.

"델타(Delta)"는 이론적인 질량과 실험적으로 확인한 질량의 차이의 절대값을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은

이하, 본 발명을 도 1을 참조로 하여, 단계별로 상세하게 설명한다.

먼저, 단계 1은 당 절단 효소(PNGase F)에 의해 분리된 당을 고분해능 질량분석기(MALDI FT-ICR)로 분석하여 질량 스펙트럼을 얻는 단계이다.

상기 단계에서는 혈액시료에 당 절단 효소(PNGase F)를 첨가하여 당을 분리하고 이를 고분해능 질량분석기에 넣고 질량분석함으로써 질량 스펙트럼을 얻을 수 있다.

이때, 당 분리가 좀 더 용이하게 일어나도록 상기 혈액시료에 당 절단 효소를 첨가시 혈액시료를 100 ℃ 내외에서 반응시켜 당단백질을 변성시키는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

또한, 상기 단계에 있어서, 당 절단 효소에 의해 분리된 당을 정제하기 위하여 다수의 분획물을 제조하는 것이 바람직하며, 상기 분획물은 3개 이상인 것이 바람직하고, 크로마토그래피를 이용하여 분리 분치할 수 있다. 이때, 분획 용매(이동상)으로서는 10% 아세토니트릴(ACN)/물(H₂0), 20% ACN/H₂0 및 40% ACN/H₂0를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다.

나아가, 상기 단계에 있어서, 질량분석시 상기 분치 시료는 질량분석기의 포지티브 모드 또는 네가티브 모드로 분석할 수 있으며, 예를 들면, 10% ACN/H₂0 및 20% ACN/H₂0 분치 시료는 고분해능 질량분석기(MALDI FT-ICR)의 포지티브(Positive) 모드로 분석을 하고, 40% ACN/H₂0 분치 시료는 네가티브(Negative) 모드로 분석을 수행할 수 있다. 각 분치 시료마다 5번 이상 반복 분석을 수행함으로써 재현성을 검정하는 것이 바람직하다.

다음으로, 단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 질량 스펙트럼에서 노이즈를 제거하고, 피크(Peak)를 선택하여 피크의 리스트를 작성하는 단계이다.

구체적으로, 상기 단계에서는 단계 1에서 얻은 질량 스펙트럼에서 먼저 베이스 라인을 수정하여 노이즈를 제거하고, 피크를 선택하여 리스트를 작성한다.

이때, 상기 피크는 S/N(signal to noise) 3.0 이상 및 상대적인 강도(Relative intensity)가 0.3 이상인 피크를 선택하는 것이 바람직하다.

상기 피크의 선택은 공지된 소프트웨어 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들면, 프리웨어인 mMass(http://www.mmass.org/, by Martin Strohalm, PhD) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

선택된 피크 중에서 5번의 반복 분석에서 질량 허용치(Mass tolerence)가 0.03 Da 이하에서 3번 이상 발견된 피크들의 강도(Intensity)를 고려하여 하기 수학식 1에 나타낸 바와 같이 평균 질량 값을 계산하여 피크 리스트를 엑셀 파일로 작성할 수 있다.

상기 평균 질량 값은 강도를 고려하여 계산한 것이므로 보다 정확한 질량 값을 나타낼 수 있고, 따라서 대표값으로서 활용될 수 있다.

<수학식 1>

(M_i: 반복분석에서 i번째 질량 값

I_i: 반복분석에서 i번째 강도 값

M_Avg: 강도를 고려한 피크의 대표의 질량 평균값)

다음으로, 단계 3은 상기 단계 2에서 작성된 피크 리스트에서 동위원소들을 그룹화(Isotope Grouping)하는 단계이다.

구체적으로, 상기 단계에서는 상기 단계 2에서 작성된 피크 리스트에서 가장 강도(Intensity)가 큰, 즉 상대적인 강도(Relative intensity)가 100인 피크를 선택하고 이후, 1 Da 차이 나는 피크를 순차적으로 찾아가면서 그룹화함으로써 동위원소 그룹(Isotope Grouping)으로 묶을 수 있다. 그 결과는 분치 시료별로 각각 엑셀파일로 생성할 수 있다.

다음으로, 단계 4는 상기 단계 2에서 작성된 피크 리스트에서 당 데이터베이스로부터 이론적으로 가능한 동위원소 분포를 모델링하는 단계(Isotopic Modeling)이다.

상기 단계에서는 문헌(Scott R. Kronewitter et al. Proteomics. 2009, 9, 2986-2994)에 공지된 331개의 당 데이터베이스를 사용하여 이론적으로 가능한 당의 동위원소 분포를 모델링 하는 단계이다. 상기 모델링은 공지된 소프트웨어 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들면, mMass 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 모델링은 [M+Na]⁺, [M-H]^-의 두 가지 경우로 당의 모델링을 수행하는 것이 바람직하다.

다음으로, 단계 5는 상기 단계 3 및 4로부터 S-스코어를 계산하여 당을 동정하는 단계이다.

상기 단계는 상기 단계 3에서 측정된 실제 동위원소 분포와 상기 단계 4에서 모델링 한 이론적인 동위원소 분포를 비교하는 단계로서, 상기 S-스코어는 하기 수학식 2로부터 계산될 수 있다.

<수학식 2>

(X₀, Y₀: 질량 차이와 강도 차이가 제로인 점. 즉 원점으로 정의한다.

X_n = 동위원소 피크들 중 n 번째의 피크의 질량 차이

Y_n = 동위원소 피크들 중 n 번째의 피크의 강도 차이
Exp_Mass = 실제 동위원소 피크의 질량
Cal_Mass= 이론적인 동위원소 피크의 질량
Exp_Intensity= 실제 동위원소 피크의 강도
Cal_Intensity= 이론적인 동위원소 피크의 강도).

상기 수학식 2에서 S-스코어 값이 작으면 작을수록 실제 동위원소 분포가 데이터베이스의 당과 유사도가 낮은 경우이며, 값이 높을수록 유사도가 높은 경우이다. 따라서 손수 검정을 통하여(Manual validation) 4.5 이상이면 당업계에서 정확성이 높은 결과이라고 인정하므로, S-스코어가 4.5 이상인 것들을 선택하여 당을 정확히 동정하는 것이 바람직하다.

다음으로, 단계 6은 상기 단계 5에서 동정된 당을 기본으로 하여 상관관계 분석을 통하여 추가적으로 당(Branching N-glycan)을 동정하는 단계이다.

구체적으로, 상기 단계에서는 단계 5에서 S-스코어가 4.5 이상인 동정된 당으로부터 상관관계 분석을 통하여 새롭게 확인된 추가 당(Branching N-glycan)들의 목록을 만들고, 이것이 만약 상기 단계 3의 동위원소 그룹화에서 당(Branching N-glycan)이 존재하지 않고, 상기 단계 2의 피크 리스트에서 하기 수학식 3에 따라 계산된 Delta 값이 0.01 Da보다 작은 피크가 존재한다면, 이 당(Branching N-glycan)을 동정 리스트에 추가한다. 상기 작업을 반복하여 새롭게 확인된 당(Branching N-glycan)이 없을 때까지 반복하여 이 과정을 수행한다.

<수학식 3>

다음으로, 단계 7은 상기 단계 5 및 단계 6에서 동정된 당들을 확인하고, 프로파일링 및 상관관계 맵을 작성하는 단계이다.

이때, 상기 당의 프로파일링은 도 7 및 11에 나타낸 바와 같이, 벤다이어그램 형태로 도식화할 수 있고, 이를 바탕으로 도 8~10에 나타낸 바와 같이, 상관관계 맵을 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들면, Cytoscape(http://www.cytoscape.org/) 등을 사용하여 작성할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

이때, 상기 당의 상관관계 맵에서 각 노드들의 테두리 칼라는 목적에 맞게 다양한 색깔로 표시할 수 있으며, 예를 들면, 초록, 주황, 빨강, 파랑, 검정으로 각각 High Mannose, Complex/Hybrid, Complex, Hybrid, 데이터베이스에 없는 경우로 표시를 할 수 있다. 그리고 노드들의 색깔을 동정된 당의 확인된 시료 개수에 따라 다양한 색깔로 표시할 수 있으며, 예를 들면 상기 동정된 당의 확인된 시료 개수가 많으면 검정색, 적으면 흰색으로 표시할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 생물정보처리 분석 방법에 의해 상기 악성 종양의 질병 표지자 후보를 제공한다.

상기 질병 표지자 후보는 본 발명에 따른 생물정보처리 분석 방법에 의해 양성종양(Benign)과 악성종양(Ovarian Cancer)에서 동정된 당에 각각 F-Test를 수행하여 P-value가 0.05 이하인 당들을 선택할 수 있다.

구체적으로, 상기 질병 표지자 후보로는 다음과 같은 당사슬(glycoform) 중에서 선택될 수 있다.

1. 3Hex 4HexNac

2. 6Hex 4HexNac

3. 3Hex 3HexNac 1DxyHex

4. 4Hex 3HexNac 1DxyHex

5. 6Hex 5HexNac

6. 3Hex 4HexNac 1DxyHex

7. 7Hex 6HexNac 1NeuAc

8. 6Hex 5HexNac 1DxyHex 2NeuAc

9. 7Hex 6HexNac 1DxyHex 1NeuAc

10. 4Hex 5HexNac 1DxyHex 1NeuAc

11. 13Hex 3HexNac 0DxyHex 0NeuAc

12. 6Hex 5HexNac 1DxyHex 1NeuAc

13. 6Hex 5HexNac 0DxyHex 2NeuAc

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 24개의 인간 혈액 시료로부터 당의 프로파일링 분석

단계 1: 인간 혈액 시료로부터 당을 분리하여 MS 스펙트럼 획득

24명의 인간 혈액시료를 100 ℃에서 2분 정도 방치하여 당단백질을 변성시키고, 여기에 당 절단 효소(PNGage F)를 첨가하고, 37 ℃에서 12시간 동안 반응시켜 당단백질에서 당을 분리하였다. 당이 분리된 혈액 혼합물을 이동상으로서 10% 아세토니트릴(ACN)/물(H₂0), 20% ACN/H₂0 및 40% ACN/H₂0를 사용하여 크로마토그래피로 분리 분치한 다음, 고분해능 질량분석기(MALDI FT-ICR; HiResMALDI, IonSpec, Irvine, CA)에 넣고 질량분석하여 MS 스펙트럼을 얻었다.

이때, 10% ACN/H₂0 및 20% ACN/H₂0 분치 시료는 고분해능 질량분석기(MALDI FT-ICR)의 포지티브(Positive) 모드로 분석을 하고, 40% ACN/H₂0 분치 시료는 네가티브(Negative) 모드로 분석을 수행하였다. 각 분치 시료마다 5번씩 반복 분석을 수행함으로써 재현성을 검정하였으며, 24명의 인간 혈액시료에서 모두 355개의 질량 스펙트럼을 획득하였다.

단계 2: 질량 스펙트럼에서 피크( Peak )를 선택하여 피크의 리스트를 작성

상기 단계 1에서 얻은 질량 스펙트럼에서 프리웨어 소프트웨어 mMass(http://www.mmass.org/, by Martin Strohalm, PhD)를 사용하여 베이스 라인을 수정하고, S/N(signal to noise) 3.0 이상 그리고 상대적인 강도(Relative intensity)가 0.3 이상인 피크들만 선택하였다.

선택된 피크 중에서 5번의 반복 분석에서 질량 허용치(Mass tolerence)가 0.03 Da 이하에서 3번 이상 발견된 피크들의 강도(Intensity)를 고려하여 하기 수학식 1에 나타낸 바와 같이, 피크들의 질량 총합을 구하고 강도의 총합으로 나누어서 대표 피크의 평균값을 계산함으로써, 하나의 피크 리스트를 엑셀 파일로 작성하여 도 2 및 도 3에 나타내었다.

<수학식 1>

(M_i: 반복분석에서 i번째 질량 값

I_i: 반복분석에서 i번째 강도 값

M_Avg: 강도를 고려한 피크의 대표의 질량 평균값)

도 2는 5번의 반복 분석된 질량 스펙트럼로부터 작성된 전체 피크를 나타내는 스펙트럼이다.

도 3은 상기 도 2의 전체 피크를 분치 시료별로 비교하여 리스트로 나타낸 도면이다.

상기 수학식 1과 같이 계산한 평균 질량 값은 강도를 고려하여 계산한 것이므로 보다 정확한 질량 값을 나타낼 수 있고, 따라서 대표값으로서 활용될 수 있다.

단계 3: 동위원소 그룹화

상기 단계 2에서 얻은 피크 리스트에서 동위원소 그룹화(Isotope Grouping)를 수행하였다. 구체적으로 상기 피크 리스트에서 가장 강도(Intensity)가 큰, 즉 상대적인 강도(Relative intensity)가 100인 피크를 선택한 다음 1 Da씩 차이 나는 피크를 순차적으로 찾아가면서 그룹화함으로써 분치 시료별로 각 동위원소 그룹화를 수행하고, 그 결과를 각각 엑셀파일로 생성하였다.

단계 4: 이론적인 동위원소 분포 모델링

문헌(Scott R. Kronewitter et al. Proteomics. 2009, 9, 2986-2994)에 기재되어 있는 331개의 당 데이터베이스를 이용하여 상기 단계 2에서 얻은 피크 리스트에서 이론적으로 가능한 당의 동위원소 분포를 모델링하였다. 상기 모델링은 소프트웨어(mMass)를 이용하여 수행하였으며, [M+Na]⁺, [M-H]^-의 두 가지 경우로 당의 모델링을 수행하였다.

단계 5: S-스코어 계산

하기 수학식 2에 따라 상기 단계 3에서의 실제 동위원소 분포와 상기 4에서의 모델링을 통한 이론적인 동위원소 분포를 비교하여 분치 시료별로 S-스코어를 계산하여 그 분포도를 도 4~6에 나타내었다.

<수학식 2>

X_n = 동위원소 피크들 중 n 번째의 피크의 질량 차이

상기 수학식 2의 계산에서 S-스코어 값이 작으면 작을수록 실제 동위원소 분포가 데이터베이스의 당과 유사도가 낮은 경우이며, 값이 높을수록 유사도가 높은 경우이다. 따라서 손수 검정을 통하여(Manual validation) 4.5 이상이면 정확성이 높은 결과이라고 할 수 있으므로, S-스코어가 4.5 이상인 것들을 선택하여 당을 동정하였다.

단계 6: 추가적인 당의 동정

단계 5에서 S-스코어가 4.5 이상인 동정된 당으로부터 상관관계 분석을 통하여 새롭게 확인된 추가 당(Branching N-glycan)들의 목록을 만들고, 이것이 만약 상기 단계 3의 동위원소 그룹화에서 당(Branching N-glycan)이 존재하지 않고, 상기 단계 2의 피크 리스트에서 하기 수학식 3에 따라 계산된 Delta 값이 0.01 Da보다 작은 피크가 존재한다면, 이 당(Branching N-glycan)을 동정 리스트에 추가하였다. 상기 작업을 반복하여 새롭게 확인된 당(Branching N-glycan)이 없을 때까지 반복하여 이 과정을 수행하였다.

<수학식 3>

당을 동정한 결과, 10% ACN/H₂0 분치 시료에서 36개, 20% ACN/H₂0 분치 시료에서 25개, 및 40% ACN/H₂0 분치 시료에서 87개의 당을 동정하였다.

각 분치 시료에서의 동정한 당의 중복 정도를 벤다이어그램으로 도식화하여 도 7에 나타내었다.

단계 7: 당의 프로파일 및 상관관계 맵 작성

상기 단계 6에서 동정된 당에 대하여 Cytoscape(http://www.cytoscape.org/) 소프트웨어를 이용하여 10% ACN/H₂0, 20% ACN/H₂0 및 40% ACN/H₂0 분치 시료에 대하여 당의 상관관계 맵을 작성하여 도 8~10에 나타내었다.

이때, 도 8~10에서 각 노드들의 테두리 칼라는 초록, 주황, 빨강, 파랑, 검정으로 각각 High Mannose, Complex/Hybrid, Complex, Hybrid, 데이터베이스에 없는 경우로 표시를 하였다. 그리고 노드들의 색깔을 동정된 당의 확인된 시료 개수가 많으면 검정색, 적으면 흰색으로 표시하였다.

< 비교예 1> 종래 방법에 따른 당의 동정

종래 방법(구체적인 종래 방법을 기재하여 주시기 바랍니다-예: 탄뎀 질량분석 등)에 따라 동일한 혈액 시료에서 정확한 질량 값을 비교하여, 즉 Delta가 0.01 Da보다 작을 때 당을 동정한 결과는 10% ACN/H₂0 분치 시료에서 26개, 20% ACN/H₂0 분치 시료에서 17개, 및 40% ACN/H₂0 분치 시료에서 39개의 당을 동정하여 총 82개의 당을 동정하였다.

그러나, 본 발명은 10% ACN/H₂0 분치 시료에서 36개, 20% ACN/H₂0 분치 시료에서 25개, 및 40% ACN/H₂0 분치 시료에서 87개의 당을 동정하였다. 따라서 전체 121개의 고유한 당을 동정함으로써 종래 방법에 비해 56% 이상의 당을 추가로 더 찾을 수 있으므로 당의 동정시 유용하게 사용될 수 있다.

< 실시예 2> 악성과 양성 환자의 혈액 시료로부터 당의 프로파일링 맵 및 질병 표지자의 발굴

24개의 인간 혈액 시료 중에 11개의 양성종양(Benign)과 10개의 악성종양(Ovarian Cancer)에서 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 10% ACN/H₂0 분치 시료에서 35개, 20% ACN/H₂0 분치 시료에서 25개, 및 40% ACN/H₂0 분치 시료에서 71개의 당을 동정하였으며, 각 분치 시료에서의 동정한 당의 중복 정도를 벤다이어그램으로 도식화하여 도 11에 나타내었다.

동정된 전체 103개의 당을 각각 F-Test를 수행하여 P-value가 0.05 이하인 13개의 당사슬(glycoform)을 질병 표지자의 후보로 선택하여 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

선택된 악성종양(Ovarian cancer) 질병 표지자(N-glycan)들은 다음과 같은 당사슬(glycoform)이다.