JP5855264B2 - Ｎ−型糖ペプチドの高スループット同定および定量のためのバイオインフォマティックスプラットフォーム - Google Patents
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Description
本発明は、質量分析法に基づいて、Ｎ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための新規なバイオインフォマティクスプラットフォームに関するものである。
ヒトの血液は様々なタンパク質の混合物であり、その中で、少なくとも５０％が糖タンパク質である。しかしながら、糖タンパク質試料が非常に複雑で多様性があること、および非糖ペプチドと比較して、糖ペプチドの質量分析強度が相対的に低いことから、試料中のすべての糖ペプチドの特性を明らかにすることは不可能であることが多い。高分解能質量分析計が導入されて以来、グリカンおよび糖タンパク質の分析が急速に進展している。それにもかかわらず、糖タンパク質の同定および定量のために必要なバイオインフォマティクス技術は最新ではない。多くの治療用タンパク質は、様々な形態でかつ非常に複雑な方法でグリコシル化されていることが知られている。このような糖タンパク質のグリコシル化を同定および定量するには、主に２つの技術的方法がある。
一つの方法は、酵素または化合物により誘発される化学的切断を用いることによって、グリカンを同定および定量する方法であり、他の方法は、糖ペプチドを同定および定量する方法である。しかし、放出されたグリカンを分析する方法では、グリコシル化部位特異的な情報がわからないという問題がある。糖ペプチドをそのままの状態で同定し、定量することができるとすれば、腫瘍の同定および進行を検査できるだけでなく、糖タンパク質自体に加えて、グリコシル化部位およびＮ−結合型糖鎖の大きさ、成長中の側鎖の数についての膨大な情報を得ることができる。
一般に、糖タンパク質のグリコシル化を分析する方法には、タンパク質レベルでの糖タンパク質を濃縮化するステップが含まれる。しかし、本発明においては、標準糖タンパク質試料を使用して、本発明を実行し、完了した。特定的には、前記の標準糖タンパク質試料をトリプシンで加水分解することによって、ペプチドおよび糖ペプチドを得た。次いで、これらのペプチドを、高分解能質量分析計で分析した。タンデム質量スペクトル（ＭＳ／ＭＳ）および質量スペクトル（ＭＳ）の結果を糖ペプチドのデータベースと比較して、糖ペプチドを同定および定量した。
ＭＳ／ＭＳまたはＭＳを用いる糖ペプチドのスクリーニングのための最近のソフトウェアの例としては、Peptoonist（David Goldbergら、「Automated N-Glycopeptide Identification Using a Combination of Single- and Tandem-MS」、Journal of proteome research 2007, 6, 3995-4005）、SimGlycan（http://glycotools.qa-bio.com/SimGlycan）、GlycoMiner（Oliver Ozohanicsら、「GlycoMiner: a new software tool to elucidate glycopeptide composition」、Rapid Communications in Mass Spectrometry 2008, 22, 3245-3254）、GlycoSpectrumScan（NandanDeshpandeら、「GlycoSpectrumScan: Fishing Glycopeptides from MS Spectra of Protease Digests of Human Colostrum slgA」、Journal of proteome research 2010, 9, 1063-1075）、GlycoPep Grader（Carrie L. Woodinら、「GlycoPep Grader: A Web-Based Utility for Assigning the Composition of N-Linked Glycopeptides」、 Analytical Chemistry, 2012）、その他があげられる。
上記のソフトウェアプログラムは、タンデム質量スペクトルだけを用いて糖ペプチドを同定するように設計されていたので、糖ペプチドの正確なプロファイリングに疑いがあるとともに、定量分析結果において不一致があることも別の問題である。これらのソフトウェアが、様々な高分解能質量分析計をサポートしていないことが問題であった。
上記の問題を克服するために、本発明者らは、質量スペクトルを用いて、一般的なペプチドに比べて比較的存在率の低い糖ペプチドを、より効率的に同定および定量するための新規な方法を検討し、完成させた。まず第一に、ヒト血清中に高濃度で存在する２８１の糖タンパク質の糖ペプチド（Terry Farrahら、「A High-Confidence Human Plasma Proteome Reference Set with Estimated Concentrations in PeptideAtlas」、Molecular Cell Proteomics、2011）を蓄積し、続いて、そのような糖ペプチドの理論的な同位体分布（isotopic distribution）をモデル化した。得られた結果はデータベースへと送った。本発明においては、ＭＳ／ＭＳおよびＭＳを用いることによって同様に糖ペプチドの同位体分布を得、この同位体分布を、糖ペプチドデータベースと比較して、正確に糖ペプチドを同定し、イオンクロマトグラムにおける面積を計算することによって、このような糖ペプチドを定量化した。
本発明の目的は、質量スペクトル結果を用いて、一般的なペプチドに比べて比較的存在量の低い糖ペプチドを、より効率的かつ正確に同定および定量するためのバイオインフォマティクスプラットフォームを提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明は、糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための新規なバイオインフォマティックプラットフォームを提供し、このプラットフォームは、
高分解能質量分析計を使用して、プロテアーゼで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドを分析することによって質量スペクトルを得ること（ステップ１）、
ステップ１で得られた質量スペクトルをＭＳ１（質量スペクトル１）およびタンデムスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）に変換すること（ステップ２）、
１２９．０６、１３８．０６、１４５．０５、１４７．０７、１６３．０６、１６８．０７、１８６．０８、２０４．０８、２７４．０９、２９２．１０、３５０．１５、３６６．１４、４５４．１６、５２８．１９、および６５７．２４のオキソニウムイオンピーク分子量を示す、変換されたタンデムスペクトルからなる群から選択される各タンデムスペクトルにおけるＭスコア（M-score）を計算すること（ステップ３）、
上記の目的を達成するために、本発明は、糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための新規なバイオインフォマティックプラットフォームを提供し、このプラットフォームは、
高分解能質量分析計を使用して、プロテアーゼで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドを分析することによって質量スペクトルを得ること（ステップ１）、
ステップ１で得られた質量スペクトルをＭＳ１（質量スペクトル１）およびタンデムスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）に変換すること（ステップ２）、
１２９．０６、１３８．０６、１４５．０５、１４７．０７、１６３．０６、１６８．０７、１８６．０８、２０４．０８、２７４．０９、２９２．１０、３５０．１５、３６６．１４、４５４．１６、５２８．１９、および６５７．２４のオキソニウムイオンピーク分子量を示す、変換されたタンデムスペクトルからなる群から選択される各タンデムスペクトルにおけるＭスコア（M-score）を計算すること（ステップ３）、
ステップ３において得られたＭスコアを用いて糖ペプチドスペクトルを選択すること（ステップ４）、
ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得て、これをデータベースと比較してＳスコア（S-score）を計算し、次いで、計算されたＳスコアを用いて糖ペプチド候補を同定すること（ステップ５）、
タンデムスペクトルにおけるＥスコア（E-score）、Ｙスコア（Y-score）、およびＹ’スコア（Y'-score）を用いて、ステップ５において同定された糖ペプチド候補から正確な糖ペプチドを評価すること（ステップ６）、
ステップ６において評価された糖ペプチドについて定量的分析を行うこと（ステップ７）、および
ステップ６において定量された糖ペプチドについての相関解析を介して、ファミリーＮ−結合型糖ペプチドの追加の同定および定量を行うこと（ステップ８）
を含む。
ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得て、これをデータベースと比較してＳスコア（S-score）を計算し、次いで、計算されたＳスコアを用いて糖ペプチド候補を同定すること（ステップ５）、
タンデムスペクトルにおけるＥスコア（E-score）、Ｙスコア（Y-score）、およびＹ’スコア（Y'-score）を用いて、ステップ５において同定された糖ペプチド候補から正確な糖ペプチドを評価すること（ステップ６）、
ステップ６において評価された糖ペプチドについて定量的分析を行うこと（ステップ７）、および
ステップ６において定量された糖ペプチドについての相関解析を介して、ファミリーＮ−結合型糖ペプチドの追加の同定および定量を行うこと（ステップ８）
を含む。
発明の効果
以上説明したように、本発明は、様々な試料中において、特定の糖鎖を有する糖ペプチドをより効率的で正確に定量する方法を提供するので、この方法は、様々な試料から疾患マーカーをスクリーニングすることによって、癌または疾患を予測および診断するための技術に効果的に使用することができる。また、この方法は、高分解能質量分析計で、糖ペプチドや糖タンパク質バイオシミラー治療物質（glycoprotein biosimiliar therapeutics）の糖構造を分析したい人にとって有用である。
本発明の好ましい態様の応用は、添付の図面を参照すると最もよく理解される。
以上説明したように、本発明は、様々な試料中において、特定の糖鎖を有する糖ペプチドをより効率的で正確に定量する方法を提供するので、この方法は、様々な試料から疾患マーカーをスクリーニングすることによって、癌または疾患を予測および診断するための技術に効果的に使用することができる。また、この方法は、高分解能質量分析計で、糖ペプチドや糖タンパク質バイオシミラー治療物質（glycoprotein biosimiliar therapeutics）の糖構造を分析したい人にとって有用である。
本発明の好ましい態様の応用は、添付の図面を参照すると最もよく理解される。
好ましい態様の説明
本発明をより詳細に説明するために、この説明で使用する用語を以下のように定義する。
「プロテアーゼ」は、グルコースを含む糖タンパク質のアミノ酸結合を切断して、ペプチド混合物を得る酵素を示す。
「タンデム質量分析」は、総質量スペクトル（ＭＳ）から、目的のものの選択されたイオン、または高存在量のイオンのスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）の質量を分析する方法である。
「同位体」は、同じ原子番号であるが、異なる原子量を有する化学元素を示す。
「同位体グループ化」は、実験から得られるピークリストから同定される同位体のグループ化を示している。
「Ｎ−型糖ペプチド同位体モデリング」は、データベースから確立された糖ペプチドの理論的同位体分布を示す。
「Ｓスコア（類似度スコア）」は、実験から得られた同位体ピーク分布と、データベースから理論的に推定される同位体ピーク分布との類似度を表わす数値を示す。
「デルタ（Delta）」は、理論質量と、実験から確認された実際質量との差を表わす絶対値を示す。
本発明をより詳細に説明するために、この説明で使用する用語を以下のように定義する。
「プロテアーゼ」は、グルコースを含む糖タンパク質のアミノ酸結合を切断して、ペプチド混合物を得る酵素を示す。
「タンデム質量分析」は、総質量スペクトル（ＭＳ）から、目的のものの選択されたイオン、または高存在量のイオンのスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）の質量を分析する方法である。
「同位体」は、同じ原子番号であるが、異なる原子量を有する化学元素を示す。
「同位体グループ化」は、実験から得られるピークリストから同定される同位体のグループ化を示している。
「Ｎ−型糖ペプチド同位体モデリング」は、データベースから確立された糖ペプチドの理論的同位体分布を示す。
「Ｓスコア（類似度スコア）」は、実験から得られた同位体ピーク分布と、データベースから理論的に推定される同位体ピーク分布との類似度を表わす数値を示す。
「デルタ（Delta）」は、理論質量と、実験から確認された実際質量との差を表わす絶対値を示す。
以下では、本発明を詳細に説明する。
本発明は、糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための新規なバイオインフォマティックプラットフォームであって、このプラットフォームは以下のステップを含む：
高分解能質量分析計を使用して、プロテアーゼで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドを分析することによって質量スペクトルを得ること（ステップ１）、
ステップ１で得られた質量スペクトルをＭＳ１（質量スペクトル１）およびタンデムスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）に変換すること（ステップ２）、
１２９．０６、１３８．０６、１４５．０５、１４７．０７、１６３．０６、１６８．０７、１８６．０８、２０４．０８、２７４．０９、２９２．１０、３５０．１５、３６６．１４、４５４．１６、５２８．１９、および６５７．２４のオキソニウムイオンピーク分子量を示す、変換されたタンデムスペクトルからなる群から選択される各タンデムスペクトルにおける、Ｍスコアを計算すること（ステップ３）、
本発明は、糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための新規なバイオインフォマティックプラットフォームであって、このプラットフォームは以下のステップを含む：
高分解能質量分析計を使用して、プロテアーゼで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドを分析することによって質量スペクトルを得ること（ステップ１）、
ステップ１で得られた質量スペクトルをＭＳ１（質量スペクトル１）およびタンデムスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）に変換すること（ステップ２）、
１２９．０６、１３８．０６、１４５．０５、１４７．０７、１６３．０６、１６８．０７、１８６．０８、２０４．０８、２７４．０９、２９２．１０、３５０．１５、３６６．１４、４５４．１６、５２８．１９、および６５７．２４のオキソニウムイオンピーク分子量を示す、変換されたタンデムスペクトルからなる群から選択される各タンデムスペクトルにおける、Ｍスコアを計算すること（ステップ３）、
ステップ３において得られたＭスコアを用いて糖ペプチドスペクトルを選択すること（ステップ４）、
ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得て、この同位体分布がデータベースと比較されてＳスコアが計算され、次いで、計算されたＳスコアを用いて糖ペプチド候補を同定すること（ステップ５）、
タンデムスペクトルにおけるＥスコア、Ｙスコア、およびＹ’スコアを用いてステップ５において同定された糖ペプチド候補から正確な糖ペプチドを評価すること（ステップ６）、
ステップ６において評価された糖ペプチドについて定量的分析を行うこと（ステップ７）、および
ステップ６において定量された糖ペプチドについての相関解析を介して、Ｎ−型糖ペプチドファミリーの追加の同定および定量を行うこと（ステップ８）。
ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得て、この同位体分布がデータベースと比較されてＳスコアが計算され、次いで、計算されたＳスコアを用いて糖ペプチド候補を同定すること（ステップ５）、
タンデムスペクトルにおけるＥスコア、Ｙスコア、およびＹ’スコアを用いてステップ５において同定された糖ペプチド候補から正確な糖ペプチドを評価すること（ステップ６）、
ステップ６において評価された糖ペプチドについて定量的分析を行うこと（ステップ７）、および
ステップ６において定量された糖ペプチドについての相関解析を介して、Ｎ−型糖ペプチドファミリーの追加の同定および定量を行うこと（ステップ８）。
本発明はまた、同位体分布の比較を介して、糖ペプチドをより正確かつ効率的に同定および定量するためのバイオインフォマティクスプラットフォームを提供する。特に本発明は、Ｍスコアを用いて糖ペプチドスペクトルを得た後、同位体分布を用いること、およびＹスコア、Ｅスコア、またはＹ’スコアを用いて再度、糖ペプチドを確認し、評価することによって、糖ペプチドを正確に同定する方法を提供する。
以下では、本発明の実施例を、図１を参照して、ステップ毎により詳細に説明する。
本発明の好ましい態様において、糖ペプチドは、いつもそれに限定はされないが、以下に示すステップを含む方法によって同定および定量される：
１）高分解能質量分析計Orbitrapを用いて分析することによって、トリプシンで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドの質量スペクトルを得ること；
２）ステップ１において得られた質量分析計ＲＡＷファイルを、RawExtractor v1.9を用いることによってｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットに変換すること、ここでｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットは、MM File Conversion Tools v3.9を使用することによって、さらにｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルフォーマットに変換される、
３）ステップ２において変換されたｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルの各ＨＣＤ（高エネルギー衝突解離）スペクトルからＭスコアを計算すること、
本発明の好ましい態様において、糖ペプチドは、いつもそれに限定はされないが、以下に示すステップを含む方法によって同定および定量される：
１）高分解能質量分析計Orbitrapを用いて分析することによって、トリプシンで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドの質量スペクトルを得ること；
２）ステップ１において得られた質量分析計ＲＡＷファイルを、RawExtractor v1.9を用いることによってｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットに変換すること、ここでｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットは、MM File Conversion Tools v3.9を使用することによって、さらにｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルフォーマットに変換される、
３）ステップ２において変換されたｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルの各ＨＣＤ（高エネルギー衝突解離）スペクトルからＭスコアを計算すること、
４）ステップ３において得られたスペクトルの内で、少なくとも１．５のＭスコアを取得する、糖ペプチドスペクトルを選択すること、
５）ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得ること、ここでこの同位体分布がデータベースと比較されて、少なくとも９８．０のＳスコアを取得する糖ペプチド候補の同定に至る、
６）ステップ５において同定された糖ペプチド候補の、ＨＣＤスペクトルにおけるＹ’スコア、およびＣＩＤ（衝突誘起解離）スペクトルにおけるＹスコアを用いることによって、糖ペプチドを正確に評価すること、
７）ステップ６において同定された糖ペプチドで、定量分析を行うこと、および
８）ステップ６において同定された糖ペプチドについての相関解析を介してＮ−型糖ペプチドファミリーの追加の同定および定量を行うこと。
５）ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得ること、ここでこの同位体分布がデータベースと比較されて、少なくとも９８．０のＳスコアを取得する糖ペプチド候補の同定に至る、
６）ステップ５において同定された糖ペプチド候補の、ＨＣＤスペクトルにおけるＹ’スコア、およびＣＩＤ（衝突誘起解離）スペクトルにおけるＹスコアを用いることによって、糖ペプチドを正確に評価すること、
７）ステップ６において同定された糖ペプチドで、定量分析を行うこと、および
８）ステップ６において同定された糖ペプチドについての相関解析を介してＮ−型糖ペプチドファミリーの追加の同定および定量を行うこと。
本発明の別の好ましい態様においては、糖ペプチドは、いつもそれに限定はされないが、以下のステップを含む方法によって同定および定量されるのが好ましい：
１）高分解能質量分析計Orbitrapを用いて分析することによって、トリプシンで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドの質量スペクトルを得ること；
２）ステップ１において得られた質量分析計ＲＡＷファイルを、RawExtractor v1.9を用いることによってｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットに変換すること、ここでｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットは、MM File Conversion Tools v3.9を使用することによって、さらにｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルフォーマットに変換される、
３）ステップ２において変換されたｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルの各ＨＣＤ（高エネルギー衝突解離）スペクトルからＭスコアを計算すること、
１）高分解能質量分析計Orbitrapを用いて分析することによって、トリプシンで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドの質量スペクトルを得ること；
２）ステップ１において得られた質量分析計ＲＡＷファイルを、RawExtractor v1.9を用いることによってｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットに変換すること、ここでｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットは、MM File Conversion Tools v3.9を使用することによって、さらにｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルフォーマットに変換される、
３）ステップ２において変換されたｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルの各ＨＣＤ（高エネルギー衝突解離）スペクトルからＭスコアを計算すること、
４）ステップ３において得られたスペクトルの内で、少なくとも１．５のＭスコアを取得する、糖ペプチドスペクトルを選択すること、
５）ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得ること、ここでこの同位体分布がデータベースと比較されて、少なくとも９８．０のＳスコアを取得する糖ペプチド候補の同定に至る、
６）ステップ５において同定された糖ペプチド候補の、ＨＣＤスペクトルにおけるＹ’スコア、およびＥＴＤ（電子移動解離）スペクトルにおけるＥスコアを用いることによって、糖ペプチドを正確に評価すること、
７）ステップ６において同定された糖ペプチドで、定量分析を行うこと、および
８）ステップ６において同定された糖ペプチドについての相関解析を介してＮ−型糖ペプチドファミリーの追加の同定および定量を行うこと。
５）ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得ること、ここでこの同位体分布がデータベースと比較されて、少なくとも９８．０のＳスコアを取得する糖ペプチド候補の同定に至る、
６）ステップ５において同定された糖ペプチド候補の、ＨＣＤスペクトルにおけるＹ’スコア、およびＥＴＤ（電子移動解離）スペクトルにおけるＥスコアを用いることによって、糖ペプチドを正確に評価すること、
７）ステップ６において同定された糖ペプチドで、定量分析を行うこと、および
８）ステップ６において同定された糖ペプチドについての相関解析を介してＮ−型糖ペプチドファミリーの追加の同定および定量を行うこと。
本発明の別の好ましい態様においては、糖ペプチドは、いつもそれに限定はされないが、以下のステップを含む方法によって同定および定量されるのが好ましい。
本発明の別の好ましい態様においては、糖ペプチドは、いつもそれに限定はされないが、以下のステップを含む方法によって同定および定量されるのが好ましい：
１）高分解能質量分析計Orbitrapを用いて分析することによって、トリプシンで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドの質量スペクトルを得ること；
２）ステップ１において得られた質量分析計ＲＡＷファイルを、RawExtractor v1.9を用いることによってｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットに変換すること、ここでｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットは、MM File Conversion Tools v3.9を使用することによって、さらにｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルフォーマットに変換される、
３）ステップ２において変換されたｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルの各ＨＣＤ（高エネルギー衝突解離）スペクトルからＭスコアを計算すること、
本発明の別の好ましい態様においては、糖ペプチドは、いつもそれに限定はされないが、以下のステップを含む方法によって同定および定量されるのが好ましい：
１）高分解能質量分析計Orbitrapを用いて分析することによって、トリプシンで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドの質量スペクトルを得ること；
２）ステップ１において得られた質量分析計ＲＡＷファイルを、RawExtractor v1.9を用いることによってｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットに変換すること、ここでｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットは、MM File Conversion Tools v3.9を使用することによって、さらにｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルフォーマットに変換される、
３）ステップ２において変換されたｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルの各ＨＣＤ（高エネルギー衝突解離）スペクトルからＭスコアを計算すること、
４）ステップ３において得られたスペクトルの内で、少なくとも１．５のＭスコアを取得する、糖ペプチドスペクトルを選択すること、
５）ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得ること、ここでこの同位体分布がデータベースと比較されて、少なくとも９８．０のＳスコアを取得する糖ペプチド候補の同定に至るステップ、
６）ステップ５において同定された糖ペプチド候補の、ＨＣＤタンデムスペクトルにおけるＹ’スコアを用いることによって、糖ペプチドを正確に評価すること、
７）ステップ６において同定された糖ペプチドで、定量分析を行うこと、および
８）ステップ６において同定された糖ペプチドについての相関解析を介してＮ−型糖ペプチドファミリーの追加の同定および定量を行うこと。
５）ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得ること、ここでこの同位体分布がデータベースと比較されて、少なくとも９８．０のＳスコアを取得する糖ペプチド候補の同定に至るステップ、
６）ステップ５において同定された糖ペプチド候補の、ＨＣＤタンデムスペクトルにおけるＹ’スコアを用いることによって、糖ペプチドを正確に評価すること、
７）ステップ６において同定された糖ペプチドで、定量分析を行うこと、および
８）ステップ６において同定された糖ペプチドについての相関解析を介してＮ−型糖ペプチドファミリーの追加の同定および定量を行うこと。
本発明の別の好ましい態様においては、糖ペプチドは、常にそれに限定はされないが、以下のステップを含む方法によって同定および定量するのが好ましい：
１）高分解能質量分析計LTQ-FTを用いて分析することによって、トリプシンで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドの質量スペクトルを得ること、
２）ステップ１において得られた質量分析計ＲＡＷファイルを、RawExtractor v1.9を用いることによってｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットに変換すること、ここでｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットは、MM File Conversion Tools v3.9を使用することによって、さらにｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルフォーマットに変換されること、
３）ステップ２において変換されたｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルの各ＣＩＤスペクトルからＭスコアを計算すること、
１）高分解能質量分析計LTQ-FTを用いて分析することによって、トリプシンで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドの質量スペクトルを得ること、
２）ステップ１において得られた質量分析計ＲＡＷファイルを、RawExtractor v1.9を用いることによってｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットに変換すること、ここでｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルフォーマットは、MM File Conversion Tools v3.9を使用することによって、さらにｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルフォーマットに変換されること、
３）ステップ２において変換されたｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルの各ＣＩＤスペクトルからＭスコアを計算すること、
４）ステップ３において得られたスペクトルの内で、少なくとも０．５のＭスコアを取得する、糖ペプチドスペクトルを選択すること、
５）ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得ること、ここでこの同位体分布がデータベースと比較されて、少なくとも９８．０のＳスコアを取得する糖ペプチド候補の同定に至る、
６）ステップ５において同定された糖ペプチド候補の、ＣＩＤタンデムスペクトルにおけるＹスコアを用いることによって、糖ペプチドを正確に評価すること、
７）ステップ６において同定された糖ペプチドで、定量分析を行うこと、および
８）ステップ６において同定された糖ペプチドについての相関解析を介してＮ−型糖ペプチドファミリーの追加の同定および定量を行うこと。
５）ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得ること、ここでこの同位体分布がデータベースと比較されて、少なくとも９８．０のＳスコアを取得する糖ペプチド候補の同定に至る、
６）ステップ５において同定された糖ペプチド候補の、ＣＩＤタンデムスペクトルにおけるＹスコアを用いることによって、糖ペプチドを正確に評価すること、
７）ステップ６において同定された糖ペプチドで、定量分析を行うこと、および
８）ステップ６において同定された糖ペプチドについての相関解析を介してＮ−型糖ペプチドファミリーの追加の同定および定量を行うこと。
本発明の別の好ましい態様においては、糖ペプチドは、常にそれに限定はされないが、以下のステップを含む方法によって同定および定量するのが好ましい：
１）高分解能質量分析計Q-Tofを用いて分析することによって、トリプシンで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドの質量スペクトルを得ること；
２）ステップ１において得られた質量分析計ＷＩＦＦファイルを、AB Science MS Data Convert v1.3およびProteoWizard v2.1（http://proteowizard.sourceforge.net/）を使用して、ｍｓ１（ＴＸＴ）およびｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルフォーマットに変換すること、
３）ステップ２において変換されたｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルの各ＣＩＤスペクトルからＭスコアを計算すること、
１）高分解能質量分析計Q-Tofを用いて分析することによって、トリプシンで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドの質量スペクトルを得ること；
２）ステップ１において得られた質量分析計ＷＩＦＦファイルを、AB Science MS Data Convert v1.3およびProteoWizard v2.1（http://proteowizard.sourceforge.net/）を使用して、ｍｓ１（ＴＸＴ）およびｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルフォーマットに変換すること、
３）ステップ２において変換されたｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルの各ＣＩＤスペクトルからＭスコアを計算すること、
４）ステップ３において得られたスペクトルの内で、少なくとも１．５のＭスコアを取得する、糖ペプチドスペクトルを選択すること、
５）ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得ること、ここでこの同位体分布がデータベースと比較されて、少なくとも９８．０のＳスコアを取得する糖ペプチド候補の同定に至る、
６）ステップ５において同定された糖ペプチド候補の、ＣＩＤタンデムスペクトルにおけるＹスコアを用いることによって、糖ペプチドを正確に評価すること、
７）ステップ６において同定された糖ペプチドで、定量分析を行うこと、および
８）ステップ６において同定された糖ペプチドについての相関解析を介してＮ−型糖ペプチドファミリーの追加の同定および定量を行うこと。
５）ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得ること、ここでこの同位体分布がデータベースと比較されて、少なくとも９８．０のＳスコアを取得する糖ペプチド候補の同定に至る、
６）ステップ５において同定された糖ペプチド候補の、ＣＩＤタンデムスペクトルにおけるＹスコアを用いることによって、糖ペプチドを正確に評価すること、
７）ステップ６において同定された糖ペプチドで、定量分析を行うこと、および
８）ステップ６において同定された糖ペプチドについての相関解析を介してＮ−型糖ペプチドファミリーの追加の同定および定量を行うこと。
本発明においては、一般的なペプチドよりも、より複雑で多様性があるが、低い濃度で存在する、糖ペプチドを定性的および定量的に分析するために、高分解能質量分析計を使用する。質量分析から得られる結果をより迅速かつより正確に解析するために、糖ペプチドの同定および定量のために、Ｍスコア、Ｓスコア、Ｅスコア、Ｙスコア、およびｙスコアを用いる。
上記の方法において、ステップ３に示すように、Ｍスコアを用いることは、一般的なペプチドのスペクトルのみならず、糖ペプチドのスペクトルの分析において、より効率的である。前記のＭスコアは、以下の数式１によって計算することができる。
図２ａは、糖タンパク質標準試料（ＲＮａｓｅＢ）のＨＣＤスペクトルのＭスコア分布マップを示す。この分布マップにおいて、一般的なペプチドは、青色で表わされており、糖ペプチドは、手動評価を介して、緑色で表わされている。一般ペプチドと糖ペプチドの間の感度および特異性の相関はＲＯＣ（受信者動作特性（Receiver Operating Characteristic））曲線で表わされており、これは図２ｂにおけるＡＵＣ（曲線下面積（Area Under Curve））であり、その値は０．９８である。
上述の方法において、ステップ５に示すように、Ｓスコアを使用することは、スクリーニングおよび、データベースから得られる理論的同位体分布と実験によって得られる同位体分布との比較によって特徴づけられる、糖ペプチドの同定において有利である。前記のＳスコアは、以下の数式２から計算することができる。
上記の方法のステップ４において、データベースは、好ましくは、糖ペプチドの理論同位体分布を用いて糖タンパク質から確立されるが、いつもそれに限定はされない。上記の方法のステップ５において、Ｓスコアを生成するために、同位元素の質量分布の類似度は、好ましくはユークリッド距離を用いて測定し、強度分布の類似度は、好ましくはピアソン相関解析を用いて測定するのが好ましいが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法のステップ６において、Ｙスコアリングは、タンデムスペクトル（ＣＩＤおよびＨＣＤ）における糖ペプチドの理論的なフラグメンテーションを確認して評価する工程である。本明細書においては、前記のＹスコアは、以下の数式３によって計算することができる。
上記の方法のステップ６において、Ｙスコアリングは、タンデムスペクトル（ＣＩＤおよびＨＣＤ）における糖ペプチドの理論的なフラグメンテーションを確認して評価する工程である。本明細書においては、前記のＹスコアは、以下の数式３によって計算することができる。
上記の方法のステップ６において、タンデムスペクトルはＨＣＤスペクトルであり、Ｙ’スコアは、好ましくは、以下の数式４によって計算されるが、いつもそれに限定されるものではない。
［数式４］
Ｙ’スコア＝Ｙスコア＋ｙスコア
［数式４］
Ｙ’スコア＝Ｙスコア＋ｙスコア
本発明においては、ｙスコアは、ペプチドのｂイオンおよびｙイオンの理論的分布に基づいて計算される。Ｙ’スコアは、Ｙスコアとｙスコアの合計である。
上記の方法のステップ６において、タンデムスペクトルはＥＴＤスペクトルであり、Ｅスコアは、好ましくは以下の数式５によって計算されるが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法のステップ６において、タンデムスペクトルはＥＴＤスペクトルであり、Ｅスコアは、好ましくは以下の数式５によって計算されるが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法のステップ６において、Ｎ−型糖ペプチドファミリーは、タンデムスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）を用いて正確に特定された糖ペプチドに基づいて、追加的に予測される。糖ペプチドの同定および定量は、好ましくは、タンデムスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）なしでＳスコアおよびＭＳ１におけるＭＳ精度を用いて行われるが、いつもそれに限定されるものではない。
本発明において、本発明者らは、高分解能質量分析計Orbitrapによって得られたＨＣＤおよびＣＩＤスペクトルを用いることによって、標準糖タンパク質試料（ＲＮａｓｅＢ）の糖ペプチドを同定および定量した結果を、表１に提示した。
表１
ステップ７において、標準糖タンパク質（ＲＮａｓｅＢ）を用いることによって正確に同定された糖ペプチドについて、定量的分析を実行した。前記の定量的分析は、各糖ペプチドのイオンクロマトグラムにおける面積を計算することによって実行される。面積の計算のための各データポイントは、３つの最も強い同位体ピークの合計である。データポイント数が少なくとも７つである場合には、ガウス分布が適用されて、分布の面積が計算されて、定量的値として提示される。標準糖タンパク質（ＲＮａｓｅＢ）の同位体分布は、図６ａにおけるベン図（Venn diagram）として表わされている。
図６ａに示されるように、ＮＬＴＫ＿５２００（５Ｈｅｘ ２ＨｅｘＮａｃ）は４０％、ＮＬＴＫ＿６２００（６Ｈｅｘ ２ＨｅｘＮａｃ）は２６％、ＮＬＴＫ＿８２００（８Ｈｅｘ ２ＨｅｘＮａｃ）は１６％、ＮＬＴＫ＿７２００（７Ｈｅｘ ２ＨｅｘＮａｃ）は１１％、およびＮＬＴＫ＿９２００（９Ｈｅｘ ２ＨｅｘＮａｃ）は７％であった。上記の定量的分布は、文献（Kathryn R. Rebecchiら、「Label-Free Quantitation: A New Glycoproteomics Approach」、J. Am. Soc. Mass. Spectrom, 2009, 20, 1048-1059）にあるものと一致していた。糖ペプチドの追加の同定および定量は、ＭＳ／ＭＳを用いることなく、同定された糖ペプチドについて相関解析を介して実行した。表１におけるＭＳ２スペクトル（スペクトルカウント）ゼロは、糖ペプチドの追加の同定および定量の例である。
実施例２において、標準糖タンパク質試料（ＲＮａｓｅＢ）の糖ペプチドの同定および定量は、高分解能質量分析計Orbitrapによって得られたＨＣＤおよびＥＴＤスペクトルを用いて実行し、結果を表２に示した。図６ｂにおいて示されるように、上記と類似の定量的分布が確認され（ＮＬＴＫ＿６２００（６Ｈｅｘ ２ＨｅｘＮａｃ）は２２％、ＮＬＴＫ＿８２００（８Ｈｅｘ ２ＨｅｘＮａｃ）は１７％、およびＮＬＴＫ＿７２００（７Ｈｅｘ ２ＨｅｘＮａｃ）が９％であった）、それが表２に提示されている。
表２
結論として、本発明の方法は、標準糖タンパク質からの糖ペプチドの正確な同定および定量を容易化する。実施例１および２において実行された糖ペプチドについての定性分析および定量分析の結果が、図７ａおよび７ｂに、相関マップとして提示されている。この結果は、それらのマップを比較することによって、容易に比較することができる。この方法は、糖タンパク質を分析するための多くの異なる試みに応用することができるとともに、特に、バイオシミラーの分野において非常に有用であることが期待される。
本発明においては、標準糖タンパク質試料が、質量分析器Orbitrapを用いて分析されたが、いつもそれに限定されるものではない。本発明においては、データベースが、ヒトの血漿において見い出された、２８１糖タンパク質で確立されたが、いつもそれに限定されるものではない。
本発明においては、３５０糖だけのグリコシル化を考慮したが、いつもそれに限定されるものではない。
本発明においては、３５０糖だけのグリコシル化を考慮したが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法において、糖ペプチド間の相関を解析し、比較のために試料間の類似度をマッピングするステップが、ステップ８における同定および定量の後に、付加的に追加されるが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法において、加水分解に使用される酵素は、トリプシン、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、およびキモトリプシンからなる群から選択されるが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法において、本明細書において使用される質量分析計は、LTQ-FT、Orbitrap、Triple-Tof、Q-Tof、およびQExactiveからなる群から選択されるが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法において、加水分解に使用される酵素は、トリプシン、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、およびキモトリプシンからなる群から選択されるが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法において、本明細書において使用される質量分析計は、LTQ-FT、Orbitrap、Triple-Tof、Q-Tof、およびQExactiveからなる群から選択されるが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法においては、同定および定量が、少なくとも１００００の質量分解能、および５０ｐｐｍまでの質量精度を有する、高分解能質量分析計を使用して実行されるが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法においては、定量のための糖ペプチドは、ＭＳ１スペクトルにおけるＳスコアを用いて選択されるが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法において、定量のためにＭＳ１スペクトルから選択される糖ペプチドの強度は、理論的に期待される３つの最も強いピークの強度の合計として表わされるが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法においては、定量のための糖ペプチドは、ＭＳ１スペクトルにおけるＳスコアを用いて選択されるが、いつもそれに限定されるものではない。
上記の方法において、定量のためにＭＳ１スペクトルから選択される糖ペプチドの強度は、理論的に期待される３つの最も強いピークの強度の合計として表わされるが、いつもそれに限定されるものではない。
本明細書における糖タンパク質は、血清、血漿、血液、尿、脳せき髄液、羊水、または洗浄液（lavage fluid）から抽出するのが好ましいが、いつもそれらに限定されるものではない。
実際的であり、現時点で好ましい本発明の態様は、以下の実施例、実験例および製造例において示されるように、例証のためのものである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮すれば、本発明の趣旨と範囲の中で、修正および改善を行うことができることを認識するであろう。
実施例１：試料調製および糖ペプチドの同定／定量分析
標準糖タンパク質試料、ＲＮａｓｅＢ（リボヌクレアーゼＢ）およびＡＧＰ（α１酸性糖タンパク質）、はSigma-Aldrichから購入した。前記の２つの試料は、表３に示すように混合した。
表３
標準糖タンパク質試料、ＲＮａｓｅＢ（リボヌクレアーゼＢ）およびＡＧＰ（α１酸性糖タンパク質）、はSigma-Aldrichから購入した。前記の２つの試料は、表３に示すように混合した。
表３
各試料は、３７℃で一晩、トリプシンで加水分解させた。
上記の試料調製工程によって調製されたポリペプチドは、高分解能質量分析計Orbitrap（Thermo Finnigan）、続いてＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳへと進められた。各試料の再現性を試験するために、分析は３回繰り返した。質量分析計ＲＡＷファイルは、フリーウェアプログラムRawExtractor v1.9（The Scripps Research Institute, La Jolla, CA）およびMM File Conversion Tools v3.9（http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py）を使用して、ｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルおよびｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルに変換された。ＲＮａｓｅＢの糖ペプチドの同定および定量は、本発明のＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための新規のバイオインフォマティックスプラットフォームを使用して、各質量分析結果に基づいて行った。
上記の試料調製工程によって調製されたポリペプチドは、高分解能質量分析計Orbitrap（Thermo Finnigan）、続いてＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳへと進められた。各試料の再現性を試験するために、分析は３回繰り返した。質量分析計ＲＡＷファイルは、フリーウェアプログラムRawExtractor v1.9（The Scripps Research Institute, La Jolla, CA）およびMM File Conversion Tools v3.9（http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py）を使用して、ｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルおよびｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルに変換された。ＲＮａｓｅＢの糖ペプチドの同定および定量は、本発明のＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための新規のバイオインフォマティックスプラットフォームを使用して、各質量分析結果に基づいて行った。
実施例２：試料調製および糖ペプチドの同定／定量分析
標準糖タンパク質試料ＡＧＰ（α１酸性糖タンパク質）は、Sigma-Aldrichから購入した。６つの高濃度タンパク質を、血漿から除去した。試料混合物は、表４に示されるように、血漿にＡＧＰを混ぜることによって調製した。
表４
標準糖タンパク質試料ＡＧＰ（α１酸性糖タンパク質）は、Sigma-Aldrichから購入した。６つの高濃度タンパク質を、血漿から除去した。試料混合物は、表４に示されるように、血漿にＡＧＰを混ぜることによって調製した。
表４
上述の試料調製工程によって調製されたポリペプチドは、高分解能質量分析計Orbitrap（Thermo Finnigan）、続いてＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳへと進められた。各試料の再現性を試験するために、分析は３回繰り返した。質量分析計ＲＡＷファイルは、フリーウェアプログラムRawExtractor v1.9（The Scripps Research Institute, La Jolla, CA）およびMM File Conversion Tools v3.9（http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py）を使用して、ｍｓ１（ＴＸＴ）ファイルおよびｍｓ２（ＭＧＦ）ファイルに変換された。ＡＧＰの糖ペプチドの同定および定量は、本発明のＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための新規のバイオインフォマティックスプラットフォームを使用して、各質量分析結果に基づいて行った。
産業上の利用可能性
以上に説明したように、本発明は、癌診断用の新規のバイオマーカーの開発および試験に対して有効に使用できるとともに、さらに、糖ペプチドおよび糖タンパク質バイオ治療物質（biotherapeutics）のグルコース構造の分析を容易にするバイオシミラー技術に有効に応用することができる。
当業者であれば、前述の説明において開示された概念および特定の態様は、本発明の同一の目的を実施するためのその他の態様を改変または設計する基礎として、容易に使用できることを認識するであろう。当業者はまた、そのような均等な態様は、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の趣旨と範囲から逸脱しないことを認識するであろう。
以上に説明したように、本発明は、癌診断用の新規のバイオマーカーの開発および試験に対して有効に使用できるとともに、さらに、糖ペプチドおよび糖タンパク質バイオ治療物質（biotherapeutics）のグルコース構造の分析を容易にするバイオシミラー技術に有効に応用することができる。
当業者であれば、前述の説明において開示された概念および特定の態様は、本発明の同一の目的を実施するためのその他の態様を改変または設計する基礎として、容易に使用できることを認識するであろう。当業者はまた、そのような均等な態様は、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の趣旨と範囲から逸脱しないことを認識するであろう。
Claims (13)
- 高分解能質量分析計を使用して、プロテアーゼで糖タンパク質を加水分解して調製したポリペプチドを分析することによって複数の質量スペクトルを得ること（ステップ１）、
ステップ１で得られた複数の質量スペクトルからの原ファイル（raw file）を、ＭＳ１（複数の質量スペクトル１）および複数のタンデムスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）に対するファイルに変換すること（ステップ２）、
１２９．０６、１３８．０６、１４５．０５、１４７．０７、１６３．０６、１６８．０７、１８６．０８、２０４．０８、２７４．０９、２９２．１０、３５０．１５、３６６．１４、４５４．１６、５２８．１９、および６５７．２４のオキソニウムイオンピーク分子量を示す、変換された複数のタンデムスペクトルからなる群から選択される各タンデムスペクトルにおけるＭスコア（M-score）を計算すること、ここで、Ｍスコアは、以下の数式１によって計算される、
ステップ３において得られたＭスコアを用いて糖ペプチドスペクトルを選択すること（ステップ４）、
ステップ４において選択された糖ペプチドスペクトルのＭＳ１における同位体分布を得て、この同位体分布がデータベースと比較されてＳスコアが計算され、次いで、計算されたＳスコアを用いて糖ペプチド候補を同定すること、ここで、Ｓスコアは、以下の数式２によって計算される、
タンデムスペクトルにおけるＥスコア、Ｙスコア、およびＹ’スコアを用いてステップ５において同定された糖ペプチド候補から正確な糖ペプチドを評価すること、ここで、Ｅスコアは、以下の数式５によって計算される、
［数式４］
Ｙ’スコア＝Ｙスコア＋ｙスコア
ここで、ｙスコアは、ペプチドのｂイオンおよびｙイオンの理論的分布に基づいて計算される（ステップ６）、
ステップ６において評価された糖ペプチドについて定量的分析を行うこと（ステップ７）、および
ファミリーＮ−結合型糖ペプチドの追加の同定および定量を行うこと、ここで、ファミリーＮ−結合型糖ペプチドは、ステップ６においてタンデムスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）を用いて正確に同定された糖ペプチドに基づいて、Ｎ−型糖ペプチドファミリーが追加的に予測された後に、タンデムスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）を用いずに、ＳスコアおよびＭＳ１におけるＭＳ精度を用いて同定および定量される（ステップ８）
を含む、糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。 - ステップ３におけるタンデムスペクトルがＣＩＤスペクトルまたはＨＣＤスペクトルである、請求項１に記載の糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。
- ステップ５におけるＳスコアの計算が、データベースから得られた理論的同位体分布とＭＳ１での実験によって得られた同位体分布との類似度の比較のためである、請求項１に記載の糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。
- データベースが、糖ペプチドの理論同位体分布を用いることによって、糖タンパク質から、ステップ４において確立される、請求項１に記載の糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。
- ステップ５においてＳスコアを生成するために、同位体の質量分布の類似度がユークリッド距離を用いて測定され、強度分布の類似度がピアソン相関解析を用いて測定される、請求項３に記載の糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。
- ステップ６におけるタンデムスペクトルが、ＣＩＤスペクトルまたはＨＣＤスペクトルである、請求項１に記載の糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。
- ステップ６におけるタンデムスペクトルがＨＣＤスペクトルである、請求項１に記載の糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。
- ステップ６におけるタンデムスペクトルがＥＴＤスペクトルである、請求項１に記載の糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。
- 糖ペプチドの相対量と糖ペプチドのタンデムマススペクトルの計数との相関が、ステップ８における同定および定量の後に、比較用の試料間での類似度を表わすマップとして提示される、請求項１に記載の糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。
- 加水分解が、トリプシン、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、およびキモトリプシンからなる群から選択される酵素を用いて行われる、請求項１に記載の糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。
- 同定および定量が、少なくとも１００００の質量分解能と最大５０ｐｐｍまでの質量精度を有する、高分解能質量分析計を使用して実行される、請求項１に記載の糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。
- 定量のための糖ペプチドは、ＭＳ１スペクトルにおけるＳスコアを用いて選択される、請求項１に記載の糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。
- 定量のためにＭＳ１スペクトルから選択された糖ペプチドの強度が、理論的に期待される３つの最も強いピークの強度の合計として表わされる、請求項１に記載の糖タンパク質からＮ−結合型糖ペプチドを同定および定量するための方法。
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