KR20090131745A - 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 혈액 유래당단백질을 동정하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진단 대상자의 혈액에서 종양 발생 및 전이과정에서 당질변화를 보이는 당단백질을 검출해내는 방법에 관한 것으로서, 좀더 상세하게는 당단백질의 N-연결형 당쇄 중 종양의 발생과 전이에 관여한다고 알려진 특정 당쇄를 이용하여 질량분석 방법으로 당단백질을 찾아내는 방법 및 암 진단키트에 관한 것이다.

당단백질, 당쇄, 렉틴, 과상존 단백질

Description

특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 혈액 유래 당단백질을 동정하는 방법{A glycoprotein identifying method using specific lectin affinity chromatography from patients serum}

본 발명은 종양 발생 및 전이과정에서 당질변화를 보이는 당단백질을 검출해내는 방법에 관한 것으로서, 좀더 자세하게는 당단백질의 N-연결형 당쇄 중 종양의 발생과 전이에 관여한다고 알려진 특정 당쇄를 이용하여 질량분석 방법으로 당단백질을 찾아내는 방법에 관한 것이다.

세계적으로 해마다 약 80만명의 새로운 대장암 환자가 출현하고 이는 전체 암 발생의 10%를 차지하고 있다. 게다가 이 대장암에 의한 사망은 해마다 약 45만 명에 이른다. MLH1과 MSH 유전자는 유전적인 비폴립형 대장암에 관여하고( Petersen, G.M. et al., "Genetic testing and counseling for hereditary forms of colorectal cancer" Cancer 1999, 86, 2540-2550), APC 유전자가 가족형 아데노마타입 폴립형성에 관여한다는 보고 (Powell, S.M. et al "Molecular diagnosis offamilial adenomatous polyposis." N. Engl . J. Med . 1993, 329, 1982-1987)는 있으나 다양한 범위의 대장암을 설명하는 데는 한계가 있다. 더군다나 대장암은 내 피세포에 기인하는 암으로서 환경적 요소가 유전적 요소보다 강하게 지배하는 것으로 알려져 있다. 이러한 사실들은 초기에 대장암에 대해 효율적으로 대처하도록 추적 가능한 분자, 바이오마커를 필요로 하지만 불행하게도 아직 대장암에 대한 분명한 바이오마커는 없는 실정이다.

전통적 연구는 암의 생화학적 진행과정 동안 단백질의 발현 변화에 초점을 맞추어 왔다. 그러나, 암세포의 발병이 다양한 당전이 효소의 역할에 기인하며, 이로 인한 당단백질의 당질변화가 세포의 암화 과정과 연관되어 있다는 수많은 보고가 있어 왔다(Orntoft, T.F., Vestergaard, E. M., “Clinical aspects of altered glycosylation of glycoproteins in cancer” Electrophoresis 1999, 20, 362-371). 이 중 잘 정리된 당전이효소가 N-아세틸글루코사민 전이효소 V(N-acetylglucosaminyltransferase V; "GnT-V"와 혼용함)로 N-연결형 당쇄의 코어 당쇄에 β1,6 위치로 N-아세틸글루코사민을 붙여주는 역할을 하는데 이 ‘β1,6- 가지화’의 증가가 암세포의 높은 전이성과 밀접하게 연관되어 있다고 보고된 바 있다 (Dennis, J.W. et al , Laferte, S., Waghorne, C., Breitman, M.L., Kerbel, R.S., "Beta 1-6 branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis" Science 1987, 236, 582-585). 이 당전이효소 GnT-V에 대해 매트립테이즈(matriptase), β1 인테그린(integrin), N-카데린(cadherin), 그리고 TIMP-1(김용삼 외 “Functional Proteomics Study Reveals That N-Acetylglucosaminyltransferase V Reinforces the Invasive/Metastatic Potential of Colon Cancer through Aberrant Glycosylation on Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1” Mol. Cell . Proteomics 2008, 7, 1-14) 등의 많은 표적 단백질들이 알려져 있는데, 이들은 암의 생물학적, 병리학적 과정에서 관여하여 세포 수준에서 당질의 높낮이를 보이지만 혈액으로 희석되고 나면 거의 지금의 프로테오믹스 기술로는 검출할 수 없는 수준이 되어 바이오마커로서의 가치가 매우 낮다. 암 병리학적 측면에서 당전이효소 GnT-V의 응용 가능성이 높음에도 불구하고, 혈액에서 바이오마커 후보로서 이 GnT-V의 표적이 발견된 사례가 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄 변화를 측정하여 혈액에서 종양 발생 및 전이과정에서 당질변화를 보이는 당단백질을 검출해내는 방법을 제공하려는 것으로서, 좀더 자세하게는 당단백질의 N-연결형 당쇄 중 종양의 발생과 전이에 관여한다고 알려진 특정 당쇄를 이용하여 질량분석 방법으로 혈액 내의 당단백질을 찾아내는 방법을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 암 발생 또는 전이에 관여하는 단백질의 당쇄 변화를 혈액 등을 포함한 체액으로부터 민감하게 검출해내는 방법을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 검출 방법을 이용하여 암 발생 및 전이를 탐지할 수 있는 당단백질을 제공하려는 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명의 목적은 상기 당단백질에 대한 항체를 이용하여 암을 진단할 수 있는 암 진단 키트를 제공하려는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 β1,6-N-아세틸글루코사민을 인지하는 L-PHA와 같은 렉틴을 이용하여 β1,6-N-아세틸글루코사민을 보유한 당단백질을 혈액으로부터 포집하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.

좀더 구체적으로는 진단대상자의 체액과 정상인의 체액을 시료로 하여 과상존 단백질 제거용 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 체액 중 과상존하는 단백질을 제거하고, 시료를 환원 및 알킬화한 다음, 렉틴 크로마토그래피를 수행하고, 컬럼에 결합된 단백질을 용출한 다음, 용액상에서 소화(digestion)한 후 질량분석을 통하여 어떤 당단백질의 당쇄가 변화하였는지를 확인하는 것이다.

본 발명은 렉틴 침전 기법을 이용하여 암 발생 및 전이에 관여하여 β1,6-N-아세틸글루코사민 가지 등의 '잘못된 당질화'를 보이는 미량의 당단백질을 혈액 등 체액으로부터 직접 탐지함으로써 체액으로부터 각종 암을 손쉽게 진단할 수 있으며, 각종 암에 대한 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 높은 바이오마커 및 암 진단키트를 제공할 수 있다.

상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 당단백질의 당쇄 변화를 이용하여 질량분석 방법으로 암 진단에 이용되는 당단백질을 선별하였다.

상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며 반드시 여기에 포함되는 것은 아니며, 모든 종류의 암이 본 발명의 대상이 될 수 있다.

본 발명은 정상세포와 비교하여 암세포 및 전이된 세포에서 N-연결형 당단백질의 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지가 변화된 당단백질만을 얻어내는 방법을 제공한다. β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄를 만드는 GnT-V는 조직에 관계없이 암의 발생과 전이에 관여하고, 상기 GnT-V에 의해 부가되는 β1,6-N-아세틸글루코 사민 당쇄는 렉틴 피토해마글루티닌(Phytohaemagglutinin)-L₄(이하 "L-PHA" 또는 "L₄-PHA"라 약칭한다)에 의해 검출되는데 바이오틴 등의 리간드로 이미 표지된 L-PHA를 스트렙타비딘과 같은 리간드 수용체가 붙어 있는 아가로스 등의 글라이칸 비드에 붙인 후 이어 시료를 가하여 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지를 보유한 당단백질만을 포집하는 방법을 제공한다.

본 발명은 확보한 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지 보유 당단백질에 트립신을 처리하고 이를 바로 고배율(7-테슬러)의 고분해능 질량분석기인 FT-ICR을 이용하여 펩타이드의 서열을 제시함으로서 미량의 당단백질을 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 혈액 시료 내의 과상존 단백질을 과상존 단백질 제거용 크로마토그래피로 제거하는 단계;

상기 과상존 단백질이 제거된 시료를 환원 및 알킬화하는 단계;

리간드가 결합된 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄)와 상기 리간드에 결합하는 리간드 수용체가 결합된 글라이칸 비드를 반응시켜 얻어지는 L₄-PHA-글라이칸 비드에 상기 환원 및 알킬화된 시료를 가하여 반응시키는 단계;

상기 L₄-PHA-글라이칸 비드에 결합한 시료를 용출하는 단계;

상기 용출된 시료를 소화하여 질량분석하는 단계;

를 포함하는 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 혈액 유래 당단백질 을 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 글라이칸 비드가 아가로스 또는 세파로스 비드인 것을 특징으로 하는 당단백질을 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 리간드 및 리간드 수용체가 바이오틴 및 아비딘인 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 용출 단계가 우레아 또는 SDS-PAGE 변성완충용액을 이용하는 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 대조구 및 분석구의 혈액 시료 내의 과상존 단백질을 각각 과상존 단백질 제거용 크로마토그래피로 제거하는 단계;

상기 과상존 단백질이 제거된 대조구 및 분석구 시료를 각각 환원 및 알킬화하는 단계;

리간드가 결합된 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄)와 상기 리간드에 결합하는 리간드 수용체가 결합된 글라이칸 비드를 반응시켜 얻어지는 L₄-PHA-글라이칸 비드에 상기 환원 및 알킬화된 대조구 및 분석구 시료를 각각 가하여 반응시키는 단계;

상기 L₄-PHA-글라이칸 비드에 결합한 대조구 및 분석구 시료를 각각 용출하는 단계;

상기 용출된 대조구 및 분석구 시료를 소화하여 질량분석하는 단계;

를 포함하는 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 글라이칸 비드가 아가로스 또는 세파로스 비드인 것을 특징으로 하는, 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 리간드 및 리간드 수용체가 바이오틴 및 아비딘인 것을 특징으로 하는, 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 용출 단계가 우레아 또는 SDS-PAGE 변성완충용액을 이용하는 것을 특징으로 하는, 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 대조구 및 분석구가 각각 정상인의 혈액과 진단대상자의 혈액인 것을 특징으로 하는, 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질이 암 발생 및 전이에 관여하는 다이아실글리세롤 키나아제 제타의 긴 아이소폼(Isoform Long of Diacylglycerol kinase zeta), JmjC 도메인 함유 히스톤 디메틸화 단백질 2A(JmjC domai-containing histone demethylation protein 2A), 프로토카데린 알파 C2 전구체의 긴 아이소폼(Isoform Long of Ptorocadherin alpha C2 precursor), 뇌-구조-인자-1(Brain-rescue-factor-1), 숙주 세포 인자 2(Host cell factor 2), 이중 기능성 헤파란 설페이트 N-디아세틸화효소/N-황전이효소 4(Bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase 4), 폴리아민 변환 인자 1-결합 단백질 1(Polyamine modulated factor 1-binding protein 1), 카복시펩타다아제 B2 전구체의 아이소폼 2(Isoform 2 of Carboxypeptidase B2 precursor), FLJ00268 단백질(조각){FLJ00268 protein(Fragment)}, α-3 타입 Ⅵ 콜라겐 아이소폼 1 전구체 유사(Similar to alpha 3 type Ⅵ collagen isoform 1 precursor), B0416.5a 유사(Similar to B0416.5a), OTU 도메인 함유 1(OTU domain containing 1), 컴플리먼트 C1r-유사 단백질(Complement C1r-like protein), A-키나아제 앵커 단백질의 아이소폼 1(Isoform 1 of A-kinase anchor protein 9), 187kDa 단백질(187kDa protein), Rho-GTPase 활성 단백질 10(Rho-GTPase activating protein 10), WW 도메인-결합 단백질 7의 아이소폼 1(Isoform 1 of WW domain-binding protein), 183kDa 단백질(183kDa protein), 키네신-유사 모터 단백질 C20orf23의 아이소폼 2(Isoform 2 of Kinesin-like motor protein C20orf23), 361kDa 단백질(361kDa protein), 코일드코일 도메인 함유 132 아이소폼 a(Coiled coil domain containing 132 isoform a), 유방암 항원 NY-BR-1.1 유사(Similar to breast cancer antigen NY-BR-1.1), 포르민-1의 아오소폼 1(Isoform 1 of Formin-1), 에프린 타입-A 수용체 8 전구체(Ephrin type-A receptor 8 precursor), 아미노펩티다제 O의 아이소폼 1(Isoform 1 of Aminopeptidase O) 및 신경세포 접합물질 L-1 유사 단백질 전구체의 아이소폼 2(Isoform 2 of Neural cell adhesion molecule L1-like protein precursor)로 구성되는 단백질 군 중 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질인 것을 특징으로 하는, 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방 법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질군 중 1 이상에 각각의 항체가 흡착된 기질;

상기 단백질에 대한 항체;

리간드가 결합된 N-연결형 당쇄변화 측정용 렉틴;

발색 또는 발광 효소로 표지된 2차 항체;

및 발색 또는 발광 효소로 표지된 상기 리간드의 수용체;를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 암이 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 기질이 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 수지로 합성된 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 발색 또는 발광 효소가 퍼옥시데이즈, 알칼라인 포스파테이즈로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 리간드 및 상기 리간드 수용체가 바이오틴 및 아비딘인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 발색 또는 발광 기질액을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 N-연결형 당쇄 변화 측정용 렉틴이 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄) 및 LCA(lens culinaris agglutinin) 중 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질이 다이아실글리세롤 키나아제 제타의 긴 아이소폼(Isoform Long of Diacylglycerol kinase zeta), JmjC 도메인 함유 히스톤 디메틸화 단백질 2A(JmjC domai-containing histone demethylation protein 2A), 프로토카데린 알파 C2 전구체의 긴 아이소폼(Isoform Long of Ptorocadherin alpha C2 precursor), 뇌-구조-인자-1(Brain-rescue-factor-1), 숙주 세포 인자 2(Host cell factor 2), 이중 기능성 헤파란 설페이트 N-디아세틸화효소/N-황전이효소 4(Bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase 4), 폴리아민 변환 인자 1-결합 단백질 1(Polyamine modulated factor 1-binding protein 1), 카복시펩타다아제 B2 전구체의 아이소폼 2(Isoform 2 of Carboxypeptidase B2 precursor), FLJ00268 단백질(조각){FLJ00268 protein(Fragment)}, α-3 타입 Ⅵ 콜라겐 아이소폼 1 전구체 유사(Similar to alpha 3 type Ⅵ collagen isoform 1 precursor), B0416.5a 유사(Similar to B0416.5a), OTU 도메인 함유 1(OTU domain containing 1), 컴플리먼트 C1r-유사 단백질(Complement C1r-like protein), A-키나아제 앵커 단백질의 아이소폼 1(Isoform 1 of A-kinase anchor protein 9), 187kDa 단백질(187kDa protein), Rho-GTPase 활성 단백질 10(Rho-GTPase activating protein 10), WW 도 메인-결합 단백질 7의 아이소폼 1(Isoform 1 of WW domain-binding protein), 183kDa 단백질(183kDa protein), 키네신-유사 모터 단백질 C20orf23의 아이소폼 2(Isoform 2 of Kinesin-like motor protein C20orf23), 361kDa 단백질(361kDa protein), 코일드코일 도메인 함유 132 아이소폼 a(Coiled coil domain containing 132 isoform a), 유방암 항원 NY-BR-1.1 유사(Similar to breast cancer antigen NY-BR-1.1), 포르민-1의 아오소폼 1(Isoform 1 of Formin-1), 에프린 타입-A 수용체 8 전구체(Ephrin type-A receptor 8 precursor), 아미노펩티다제 O의 아이소폼 1(Isoform 1 of Aminopeptidase O), 신경세포 접합물질 L-1 유사 단백질 전구체의 아이소폼 2(Isoform 2 of Neural cell adhesion molecule L1-like protein precursor)로 구성되는 단백질 군 중 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단 키트를 제공한다.

본 발명은 대조구 및 분석구 세포의 여러 당단백질에 대해 동일하게 표지된 L-PHA를 가하여 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 대조구 및 분석구의 세포 배양액의 당단백질에 대해 동일하게 표지된 L-PHA를 가하여 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 분석하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 정상 혈액과 진단대상자 혈액의 당단백질에 대해 동일하게 표지된 L-PHA를 가하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단 백질을 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 상기 방법을 이용하여 정상인 혈액과 대장암 환자 혈액으로부터 당쇄 가지에 변화가 있는 미량의 당단백질을 탐지하였다. 이와 같이 탐지된 당단백질은 다이아실글리세롤 키나아제 제타의 긴 아이소폼(Isoform Long of Diacylglycerol kinase zeta), JmjC 도메인 함유 히스톤 디메틸화 단백질 2A(JmjC domai-containing histone demethylation protein 2A), 프로토카데린 알파 C2 전구체의 긴 아이소폼(Isoform Long of Ptorocadherin alpha C2 precursor), 뇌-구조-인자-1(Brain-rescue-factor-1), 숙주 세포 인자 2(Host cell factor 2), 이중 기능성 헤파란 설페이트 N-디아세틸화효소/N-황전이효소 4(Bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase 4), 폴리아민 변환 인자 1-결합 단백질 1(Polyamine modulated factor 1-binding protein 1), 카복시펩타다아제 B2 전구체의 아이소폼 2(Isoform 2 of Carboxypeptidase B2 precursor), FLJ00268 단백질(조각){FLJ00268 protein(Fragment)}, α-3 타입 Ⅵ 콜라겐 아이소폼 1 전구체 유사(Similar to alpha 3 type Ⅵ collagen isoform 1 precursor), B0416.5a 유사(Similar to B0416.5a), OTU 도메인 함유 1(OTU domain containing 1), 컴플리먼트 C1r-유사 단백질(Complement C1r-like protein), A-키나아제 앵커 단백질의 아이소폼 1(Isoform 1 of A-kinase anchor protein 9), 187kDa 단백질(187kDa protein), Rho-GTPase 활성 단백질 10(Rho-GTPase activating protein 10), WW 도메인-결합 단백질 7의 아이소폼 1(Isoform 1 of WW domain-binding protein), 183kDa 단백질(183kDa protein), 키네신-유사 모터 단백질 C20orf23의 아이소폼 2(Isoform 2 of Kinesin-like motor protein C20orf23), 361kDa 단백질(361kDa protein), 코일드코일 도메인 함유 132 아이소폼 a(Coiled coil domain containing 132 isoform a), 유방암 항원 NY-BR-1.1 유사(Similar to breast cancer antigen NY-BR-1.1), 포르민-1의 아오소폼 1(Isoform 1 of Formin-1), 에프린 타입-A 수용체 8 전구체(Ephrin type-A receptor 8 precursor), 아미노펩티다제 O의 아이소폼 1(Isoform 1 of Aminopeptidase O) 및 신경세포 접합물질 L-1 유사 단백질 전구체의 아이소폼 2(Isoform 2 of Neural cell adhesion molecule L1-like protein precursor)이다.

다이아실글리세롤 키나아제 제타의 긴 아이소폼(Isoform Long of Diacylglycerol kinase zeta)은 ATP를 사용하여 1,2-다이아실글리세롤로부터 1,2-다이아실-sn-글리세롤 3-인산의 생성을 촉매하는 효소로 Ras의 활성화를 유도하여 암 발생을 촉진시킬 것으로 사료된다(J. Cell Biol. 152, 2001, 1135-1143).

JmjC 도메인 함유 히스톤 디메틸화 단백질 2A(JmjC domai-containing histone demethylation protein 2A)는 안드로겐 수용체에 의한 전사의 활성화에 관여하며(Cell 125, 2006 483-495), 대장암 및 유방암에서 잦은 유전적 변이를 보이는 단백질 중의 하나이다.

프로토카데린 알파 C2 전구체의 긴 아이소폼(Isoform Long of Ptorocadherin alpha C2 precursor)은 잠재적으로 Ca^{2 +}-의존적인 세포결합 단백질로 뇌 신경세포의 형성과 유지에 관여하는 것으로 알려져 있으며 암과 관련된 보고는 없었다.

뇌-구조-인자-1(Brain-rescue-factor-1) 및 숙주 세포 인자 2(Host cell factor 2)는 단순포진 바이러스(Herpes simplex virus)의 감염에 관련된다고 보고되어 있으나(J. Virol. 73, 1999, 3930-3940), 암과 관련된 보고는 없었다.

이중 기능성 헤파란 설페이트 N-디아세틸화효소/N-황전이효소 4(Bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase 4)는 헤파란 설페이트의 생합성에 관여하는 N-디아세틸화효소/N-황전이효소 패밀리의 한 멤버로서(J. Biol. Chem. 276, 2001, 5876-5882) 암과 관련된 보고는 없었다.

폴리아민 변환 인자 1-결합 단백질 1(Polyamine modulated factor 1-binding protein 1)는 정자의 꼬리 형성 및 세포 골격(cytoskeleton)의 구성에 관여하는 것으로 생각되나 암과 관련된 보고는 없었다.

카복시펩타다아제 B2 전구체의 아이소폼 2(Isoform 2 of Carboxypeptidase B2 precursor)는 C 말단의 아르기닌이나 라이신을 절단하여 활성있는 폴리펩타이드를 만들어 내는 효소로서, 암과 관련된 보고는 없었다.

FLJ00268 단백질(조각){FLJ00268 protein(Fragment)}은 스캐빈저 수용체(Scavenger receptor) 시스테인-풍부 도메인을 지니고 있어 단백질-단백질 상호작용에 관여할 것으로 생각되나 특별한 기능이 보고되어 있지 않다.

α-3 타입 Ⅵ 콜라겐 아이소폼 1 전구체 유사(Similar to alpha 3 type Ⅵ collagen isoform 1 precursor)는 타입 Ⅵ 콜라겐의 알파 서브유닛 중의 하나인 α3의 변이체(variant)로서 세포외기질(extracellular matrix)에 존재하는 단백질과의 상호작용에 관여한다.

B0416.5a 유사(Similar to B0416.5a)와 OTU 도메인 함유 1(OTU domain containing 1)은 특별한 기능이 알려져 있지 않은 단백질이다.

컴플리먼트 C1r-유사 단백질(Complement C1r-like protein)은 햅토글로빈(haptoglobin)을 소포체에서 가수분해하는 작용을 매개하는 것으로 생각되며 백혈병 세포주와 전립선암 (PC-3) 및 난소암 세포주 (SK-OV-3) 등에서 발현되나 다른 암세포주에서는 발현되지 않는 것으로 보고된바 있다(Biochem. Biophys. Res. Commun. 321, 2004, 329-336).

A-키나아제 앵커 단백질 9의 아이소폼 1(Isoform 1 of A-kinase anchor protein 9)은 대장암 및 유방암에서 잦은 유전적 변이를 보이는 단백질 중의 하나로 암의 생성과정 중 세포의 접착 및 이동에 영향을 미칠 것으로 예상되고 있다(Science 314, 2006, 268-274).

187kDa 단백질(187kDa protein)은 컴플리먼트 시스템의 한 구성원인 C3의 조각으로서, 암과 관련된 보고는 없었다.

Rho-GTPase 활성 단백질 10(Rho-GTPase activating protein 10)은 GTPase RhoA 나 cdc42의 활성자(activator)로서 세포골격의 구성 및 세포의 사멸에 관여하는 단백질 패밀리의 한 멤버이다.

WW 도메인-결합 단백질 7의 아이소폼 1(Isoform 1 of WW domain-binding protein)은 전사조절인자의 기능을 가질 것으로 생각되나 암과 관련된 보고는 없었다.

183kDa 단백질(183kDa protein)은 DNA와 결합하는 전사인자로 RB1의 발현 및 조절에 관여하며, RB1의 발현과 관계된 암세포종에서 발현된다(Nat. Genet. 31, 2002, 285-288; Int. J. Mol. Med. 12, 2003, 767-769).

키네신-유사 모터 단백질 C20orf23의 아이소폼 2(Isoform 2 of Kinesin-like motor protein C20orf23)는 세포 내 trafficking에 관여할 것으로 생각되며 대장암 및 유방암에서 잦은 유전적 변이를 보이는 유전자 (단백질) 중의 하나이다(Science 314, 2006, 268-274).

361kDa 단백질(361kDa protein)은 Trans-Golgi network를 통해 단백질을 엔도솜(endosome) 및 생체막으로 순환시키는 일을 담당하며 암과 관련된 보고는 없었다.

코일드코일 도메인 함유 132 아이소폼 a(Coiled coil domain containing 132 isoform a)는 특별한 기능이 알려져 있지 않다.

유방암 항원 NY-BR-1.1 유사(Similar to breast cancer antigen NY-BR-1.1)는 유방암 혈청을 통한 스크리닝 과정에서 유방암에 과발현되는 단백질로 보고되었다(Cancer Res. 61, 2001, 2055-2061).

포르민-1의 아이소폼 1(Isoform 1 of Formin-1)은 adherein junction에 관여하며 actin cable의 중합형성에 관여하나 암과 관련된 보고는 없었다.

에프린 타입-A 수용체 8 전구체(Ephrin type-A receptor 8 precursor)는 에프린 패밀리 멤버의 수용체로서, MAP 카이네이즈의 지속적 활성화를 유도해 신경세포의 급속한 생장을 촉진한다(Oncogene 24, 2005, 4243-4256).

아미노펩티다제 O의 아이소폼 1(Isoform 1 of Aminopeptidase O)은 단백질이 나 펩타이드 N-말단으로부터 아미노산을 가수분해하는 효소로서, 암과 관련된 보고는 없었다.

또한, 신경세포 접합물질 L-1 유사 단백질 전구체의 아이소폼 2(Isoform 2 of Neural cell adhesion molecule L1-like protein precursor)는 대장암 및 유방암에서 잦은 유전적 변이를 보이는 유전자(단백질) 중의 하나로 암의 생성과정 중 세포의 접착 및 이동에 영향을 미칠 것으로 예상된다(Science 314, 2006, 268-274).

이상의 단백질들은 암과 관련이 있다고 보고된 것도 있으나, 대부분은 암과 관련된 보고가 없었던 단백질이며, 암과 관련되었다는 연구결과에서도 그 단백질의 당질화에 대한 보고는 없었다. 따라서, 상기 단백질들에 대하여 당단백질로서 당질 변화를 탐지하여 암 진단 마커로서 유용성을 규명한 본 발명은 신규성과 진보성을 갖춘 발명이라 하겠다.

본 발명의 진단키트는 상기 단백질의 발현을 정량 분석 또는 정성 분석하거나, N-연결형 당쇄 변화인 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄 가지 변화를 측정하며, 상기 분석을 위하여 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질에 대한 항체를 제조하여 표면에 코팅시킨 96 웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 ELISA를 수행하도록 상기 진단키트를 제공할 수 있다.

본 발명의 진단키트는 상기 단백질에 대한 항체, 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있고, 당쇄 가지 변화를 측정하기 위하여 L₄-PHA 또는 LCA를 포함한다.

상기 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS{2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)} 또는 OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)가 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 진단키트는 암을 진단하기 위해 생물학적 마이크로 칩을 이용한 자동화된 분석 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 암 발생 및 전이에 관여하여 당쇄 변화를 나타내는 단백질들을 글래스 슬라이드 등의 표면에 고정화시켜 단백질 칩을 제작하고, 이들 단백질의 당쇄 변화를 동시에 측정하도록 진단키트를 구성할 수 있다. 이와 같은 진단키트는 상기 단백질, 적당한 완충용액 및 L₄-PHA 등을 포함한다.

렉틴 L-PHA는 N-연결형 당구조의 코어 당쇄에 β1,6-N-아세틸글루코사민 가지가 붙은 경우, 즉 N-연결형 당쇄의 β1,6-N-아세틸글루코사민 가지 부분을 인식하지만 친화크로마토그래피 컬럼으로 제작시 붙은 당쇄를 떼어내는 방법이 없어 2차원 전기영동 후 렉틴 블럿을 수행하는 방법이 통상 이용되어 왔다. 천연의 기질 은 극미량이라 사용이 불가능하다. 이 2차원 전기영동 겔에 기초한 렉틴 블럿은 두 가지의 문제를 안고 있다. 1) 2차원 전기영동에 펼칠 수 있는 시료량의 한계를 지니고 있으며, 2) 중요한 기술인 고민감도 질량분석기의 등장으로 하나의 스팟에서 여러 단백질에 대한 스코어가 나타남으로 인해 진짜의 단백질을 선정하는데 어려움이 있다. 이런 문제는 혈액과 같은 체액이 도 1과 같이 여러 단백질에 대한 높은 양적 범위(dynamic range)를 지니고 있어 겔 전기영동에 이은 렉틴 블럿을 적용할 수 없는 한계를 보인다.

본 발명자들은 우선 대장암 환자의 혈청을 확보하고, 건강진단을 받아 건강한 사람으로 판단되는 지원자의 정상 혈청을 확보하였다. 혈청 200㎕를 0.45㎛의 필터에 통과시킨 후 Sigma사에서 제공하는 ProteomPrep 20 plasma immunodepletion LC 컬럼 키트(혈청내 과상존하는 20개의 단백질 제거용 컬럼)를 사용하여 혈액에 과상존(high abundant) 단백질을 키트 사용법에 따라 제거하였다. 한편 이 20개의 과상존 단백질 제거용 컬럼의 성능과 비교하기 위해 N-연결형 당쇄만을 인식하는 Con A 렉틴 컬럼 크로마토그래피 (GE Healthcare)를 이용하여 당단백질을 확보하였다. 50mM Tris-HCl (pH 7.4)완충용액을 이용하여 미리 평형화시킨 Con A-아가로스에 희석된 혈청을 로딩하고 동일한 완충용액으로 씻어준 다음, 결합된 당단백질을 0.4M β-D-메틸만노피라노사이드(methylmannopyranoside)를 포함하는 50mM Tris-HCl (pH 7.4)로 용출시켰다.

이렇게 부분 정제된 단백질 시료에 최종 10mM β-머캡토에탄올을 가하여 환 원시킨 후 아이오도아세트아마이드(100mM)를 가하여 상온에서 한 시간 반응시켜 알킬화시켰다. 이 환원, 알킬화의 과정에 관여하는 시약은 렉틴과 당단백질간의 결합에 방해가 되므로 HiPrep 26/10 (GE Healthcare) 염제거 컬럼으로 염을 제거한 후 최종 부피가 1㎖ 되게 농축하였다. 이 단백질 용액을 미리 아비딘-아가로스에 상온에서 한 시간 붙여 비특이적으로 아비딘에 붙는 단백질을 제거하였다. 이어 여기서 나온 단백질을 상용화되어 팔고 있는 L-PHA-아가로스와 L-PHA-비오틴-아비딘-아가로스에 반응시켜 4℃에서 밤새 결합시켰다. 이 결합을 떼어내는 기질은 자연에 존재하는 당단백질의 당쇄에 1,6 N-아세틸글루코사민 가지가 부가된 당쇄이므로 거의 얻어낼 수가 없어서 현재까지 알려진 방법은 산성 pH에 의해 물리적으로 떼어내는 방법이 있다. 그러나 낮은 pH에서는 단백질이 분해되거나 또는 비특이적 용출로 인해 동일하게 전체 단백질이 떨어지지 않는 결점을 지니고 있다. 이를 떼어내기 위하여 과량의 PBS로 씻어준 다음, 1배의 SDS-PAGE 로딩 염액(Loading dye)이나 6M 우레아를 이용하여 결합을 떼어내었다. SDS-PAGE 로딩 염액을 이용한 경우 이를 SDS-PAGE를 짧게 전개한 후 겔에서 단백질을 잘라내어 젤 내부 소화(in-gel digestion) 방법을 이용하여 트립신 처리하였고(Shevchenko, A. et al "Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels". Anal . Chem ., 1996, 68, 850-858), 6M 우레아의 경우 0.6M이 되도록 희석한 후 트립신을 처리하였다. 절단된 펩타이드는 SpeedVac 시스템을 이용하여 동결건조시킨 후 질량분석기를 이용하여 동정하였다. 따라서 본 발명자들은 GnT-V의 표적을 포집, 침전, 트립신처리, FT-ICR-LTQ 질량분석을 이용한 동정 등의 일련의 과정을 통 해 간단한고 신뢰도가 높은 방법을 발명한 것이다. 이 방법을 통해 대장암에서 26개의 GnT-V 표적 단백질을 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예의 기재 범위에 한정되지 않음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

< 실시예 1> 렉틴 침전법을 이용한 β1,6 N-아세틸글루코사민 가지 보유 당 단백질의 정제

대장암 환자의 혈청을 확보하고, 건강진단을 받아 건강한 사람으로 판단되는 지원자의 정상 혈청을 확보하였다. 혈청 200㎕를 0.45㎛의 필터에 통과시킨 후 Sigma사에서 제공하는 ProteomPrep 20 plasma immunodepletion LC 칼럼 키트(註: 혈청 내 과상존 20종 단백질 제거용 컬럼)를 사용하여 혈액에 과상존하는(high abundant) 단백질을 키트의 안내에 따라 제거하였다. 한편 이 20개의 과상존 단백질 제거용 컬럼의 성능과 비교하기 위해 N-연결형 당쇄만을 인식하는 Con A 렉틴 컬럼 크로마토그래피(GE Healthcare)를 이용하여 당단백질을 확보하였다. 50mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충용액을 이용하여 미리 평형화시킨 Con A-아가로스에 희석된 혈청을 로딩하고 동일한 완충용액으로 씻어준 다음, 결합된 당단백질을 0.4 M β-D-메틸만노피라노사이드(methylmannopyranoside)를 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 7.4)로 용출시켰다.

이렇게 부분 정제된 단백질 포함 시료에 최종 10mM β-머캡토에탄올을 가하여 환원시킨 후 아이오도아세트아마이드(100mM)를 가하여 상온에서 1시간 반응시켜 알킬화시켰다. 이 환원 및 알킬화의 과정에 관여하는 시약은 렉틴과 당단백질 간의 결합에 방해가 되므로 HiPrep 26/10 (GE Healthcare) 염제거 컬럼으로 염을 제거한 후 최종 부피가 1㎖ 되게 농축하였다. 이 단백질 용액을 미리 아비딘-아가로스에 상온에서 1시간 붙여 비특이적으로 아비딘에 붙는 단백질을 제거하였다. 이어 여기서 나온 단백질을 상용화되어 시판 중인 L-PHA-아가로스 컬럼과 L-PHA-바이오틴-아비딘-아가로스 컬럼에 각각 반응시켜 4℃에서 밤새 결합시켰다. 이 결합을 떼어내는 기질은 자연에 존재하는 당단백질의 당쇄에 1,6 N-아세틸글루코사민 가지가 부가된 당쇄이므로 거의 얻어낼 수가 없어서 현재까지 알려진 방법은 산성 pH에 의해 물리적으로 떼어내는 방법이 있다. 그러나 낮은 pH에서는 단백질이 분해되거나 또는 비특이적 용출로 인해 동일하게 전체 단백질이 떨어지지 않는 결점을 지니고 있다. 상기 렉틴에 결합한 단백질을 떼어내기 위하여 과량의 PBS로 씻어준 다음, 1배의 SDS-PAGE 로딩 염액(Loading dye)이나 6M 우레아를 이용하여 렉틴과 당단백질 간의 결합을 떼어내었다. SDS-PAGE 로딩 염액을 이용한 경우 이를 SDS-PAGE를 짧게 전개한 후 겔에서 단백질을 잘라내어 젤 내부 절단(in-gel digestion) 방법을 이용하여 트립신 처리하였고 (Shevchenko, A. et al "Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels". Anal . Chem ., 1996, 68, 850-858), 6M 우레아의 경우 0.6M이 되도록 희석한 후 트립신을 처리하였다. 절단된 펩 타이드는 SpeedVac 시스템을 이용하여 동결건조시킨 후 질량분석기를 이용하여 동정하였다.

< 실시예 2> 질량분석을 통한 단백질의 동정

절단된 펩타이드 혼합물은 C18 트랩 컬럼(5㎛, 100Å, 300㎛ i.d x 5 mm)에 오토샘플러(Surveyor)를 이용하여 20㎖/min의 속도로 진행시켜 염을 제거한 후 농축시켰다. 집적된 펩타이드는 C18(입자크기 5㎜)가 충진된 미세모세관 컬럼(길이 100㎜)을 이용하여 분리하였다. 이때 사용한 이동상은 0.1%의 개미산에 0%(A)와 80%(B)의 아세토나이트릴을 각각 다른 구배(15분간 B 5%, 3분간 B 20%, 47분간 B 50%로 올리고 최종 B 95%로 씻어주었다)를 주어 전개하였다. 용출된 펩타이드는 직접 질량분석기로 일렉트로스프레이하여 전개하였고 질량분석 소프트웨어는 Xcalibur (ThermoElectron Corp., Home Page Version 2.0SR1)를 이용하였다. 농도 구배 용출 동안에, 고해상도 (R set at 100,000) FT-ICR 마스터 스펙트럼으로부터 데이터에 따라 3개의 ion-trap MS/MS 스펙트럼들을 얻어내었다. 병렬질량분석(MS/MS)에 선택된 이온들은 60초로 자동적으로 한정되게 하였다. 피크의 리스트가 생성된 후 결과값인 .raw 파일은 Bioworks software (ThermoElectron, ver. 3.3)에서 .xml 파일로 전환되었다. 이 .xml 파일은 IPI human database 20070905 (67524 sequences; 28722560 residues)에서 마스코트(Mascot) 서치 엔진 버전 2.0 (Matrix Science)을 이용하여 단백질을 동정하는데 사용하였다. 마스코트는 모노아이소토픽(monoisotopic) 질량을 선택하였고, 선구 질량값의 허용치는 ±1.5Da로, 조각의 질량값의 허용치는 ±0.8Da로 설정하였다. 절단효소는 트립신으로 하고, 한 군데 정도 잠재적 비절단을 허용하였다. 가변적 변형은 산화된 메티오닌, 피로-글루탐산(pyro-glutamate; N-말단 Q), 프로피오아마이드(propioamide) 시스테인과 카바마이도메틸화된(carbamidomethylated) 시스테인을 선정하였다. 단백질 동정의 경계를 정하는 수단으로 2개 이상의 펩타이드를 동정하였고 이 중 적어도 하나는 마스코트 개별 이온 값이 42(p 값이 0.05 이하) 이상이 되는 것을 후보로 정하였다. 또한 이미 당단백질로 알려져 있거나 적어도 하나 이상의 N-연결형 컨센서스 모티프(N-X-S/T, 여기서 X는 프롤린을 제외한 어느 아미노산이든 관계 없음)를 보유하고 있는 것을 정하였다.

< 실시예 3> 트립신 절단 방법의 최적화

본 실시예들은 혈청 단백질의 부분정제, 렉틴을 통한 포집과 침전, 트립신 처리 그리고 질량분석과 데이터베이스의 탐색을 통한 단백질의 동정으로 구성되어 있다. 도 2의 A는 전체적 실험의 흐름을 표시한 것으로 하나는 L-PHA-에 기본한 렉틴 포집의 실험과정을 정립하는 것이고 또 하나는 이 정립된 실험과정에 근거하여 대장암의 바이오마커를 발굴하는 과정이다. 실험과정의 정립에는 포집이나 분획에 대한 선택과 β1,6-N-아세틸글루코사민 가지를 포함하는 N-연결형 당단백질을 포집하는 수단으로 L-PHA의 연결형태와 트립신 처리의 단계를 선정하는 과정을 포함하고 있다. 각 단계를 점검하여 '최적의 실험방법'(optimized protocol)(도 2A)을 선 택하는 것이 포함되어 있다. L₄-PHA를 컬럼을 이용하여 크로마토그래피법으로 정제하는 방법은 Con-A(concanavalin A), LCA(lens culinaris agglutinin ), WGA(wheat germ agglutinin)와 같이 비-변성 방식으로 용출시키는 방법을 이용할 수 없기 때문에 사용하지 않았다. 이런 연유로 L₄-PHA에 붙은 단백질을 6M 우레아나 SDS-PAGE 변성완충용액을 이용하였고, 용액상 절단 방식일 경우 6M 우레아를 10배 희석하여 트립신을 처리한 것을 사용하였다. 겔상 절단일 경우는 변성 완충용액으로 변성시켜 단백질을 추출한 다음 8% SDS-PAGE 겔을 전개하여 전체 겔을 잘라낸 다음 여러 조각으로 나누어 트립신 처리하였다. 어느 절단 방법이 더 효과적인지를 확인하기 위해 1) 동정된 단백질의 숫자는 최소한 겹치지 않는 2개 이상의 펩타이드가 있어야 하고, 2) 서열이 할당되는(coverage) 정도, 3) 전체값의 정도라는 기준을 만들었다.

도 2B와 2C에서 겔상 절단과 용액상 절단에서 각각 28, 41개의 단백질을 동정하였다. 게다가 용액상 절단 방법이 겔상 절단 방법에 비해 더 높은 전체값과 서열할당의 정도를 보여, 용액상 절단(solution digestion)을 이어지는 방법 최적화(protocol optimization)와 바이오마커 발굴에 이용하였다.

< 실시예 4> 렉틴 침전 방법의 최적화

최적화의 또 다른 주제는 L-PHA 컨주게이트 즉 아가로스나 세파로스 등의 글리칸에 기초한 담체에 L-PHA가 바로 붙어 있는 형태와 간접적인 방법으로 바이오틴 표지-L-PHA와 아비딘-아가로스 간의 결합을 이용한 방법 중 하나를 선택하는 것이다. 직접 L-PHA가 아가로스에 붙어있는 형태는 활성부위가 붙어버릴 수도 있기 때문이다. L-PHA 아가로스는 이미 시판중인 제품(시그마)을 구입하였고(L-PHA-agarose), 간접적인 방법은 바이오틴표지-L-PHA를 아비딘-아가로스를 이용하여 실험(L-PHA-avi-agarose)하였다. Con-A-아가로스로 혈액에서 당단백질만을 포집한 다음 아가로스나 아비딘-아가로스로 미리 반응시켜 비특이적 반응을 상쇄시킨 후 각각 L-PHA-아가로스와 L-PHA-아비딘-아가로스에 붙여 침전시켰다. 결합한 단백질은 실시예 3의 방법으로 용액상 트립신 처리하고 나온 펩타이드의 서열은 FT-ICR/LTQ 질량분석기를 통하여 분석해 내었다. 도면 2B와 2C는 L-PHA-아비딘-아가로스의 경우가 혈청에서 표적 단백질을 잡아내는 데 더 효과적임을 제시하고 있다. 즉 더 많은 단백질이 L-PHA-아가로스보다 L-PHA-아비딘-아가로스로 포집되었으며, 동정된 경우의 전체값이나 서열할당 정도가 더 높았다. 공간적 방해(steric hindrance)나 제한된 유연성이 수용체와 리간드의 관계처럼 생체분자 사이의 상호작용에는 장애가 되는 현상이 일반적이다. 따라서 공간 팔을 지닌 담체가 이러한 친화 크로마토그래피에서의 제한을 극복하는 유용한 방법이기도 하다. 아비딘은 L-PHA-아비딘-아가로스 복합체에서 공간 팔 역할을 하여 혈청 당단백질과 아가로스 구슬 사이에서 생기는 가려막는 효과를 감소시킬 것으로 예측된다.

혈청이나 혈액을 이용하여 바이오마커를 찾아내는 일은 주로 혈액 단백질들의 높은 양적 범위(dynamic range)에 의하여 어려움을 겪고 있다. 알부민은 전체 혈청 단백질의 약 45%를 차지하며, 이뮤노글로불린까지 합치면 혈청 단백질의 약 60%를 상회한다. 게다가 거의 모든 과상존 단백질은 당단백질이기 때문에 미량존재하는 단백질을 정확하게 동정해내기 위해서 이러한 과상존 단백질의 제거가 필수적이다. 시험 결과, 시판되고 있는 면역적 제거 컬럼인 ProteomPrep 20 LC 컬럼(시그마사)를 이용하면 혈청 내 과상존 단백질을 효과적으로 잘 제거할 수 있었다. 상기 컬럼을 진행시켰을 때, 과상존 단백질은 효과적으로 남아있는 혈액 단백질과 잘 분리되었다 (도 3A). 컬럼에 붙지않고 지나간 분획에는 대부분의 미량 단백질이 포함되어 있어 20개의 과상존 단백질과 분리되었다. 50㎍의 단백질을 SDS-PAGE에 로딩, 전개하고 쿠마찌 브릴리언트 블루("CBB")로 염색하였을 때, 알부민은 이뮤노글로불린과 함께 밴드로 잘 보이나 동량에서 과상존 단백질 20개를 제거한 시료에서는 과상존 단백질이 거의 나타나지 않았다(도 3B). 중요한 것은 과상존 단백질이 제거된 시료에서 L-PHA 블럿이 더 잘 나타남을 확인하였다(도 3C)는 점이다. 게다가 이 면역적 제거 단계는 더 많은 단백질에서 높은 전체값(total score)과 서열할당을 보여 주었다(도 2B, 2C). 따라서 면역적 제거방법을 첫 단계에서 적용하였고 이는 단백질의 손실을 야기하는 완충용액 바꾸기 등의 추가 단계를 삽입하지 않아도 된다. 이상의 과정으로 혈청시료를 면역적 제거에 이어 변성, 알킬화 단계로 최적화하게 되었다. 이렇게 미리 처리된 단백질은 L-PHA-아비딘-아가로스 컨주게이트에 붙이고, 이어 결합된 단백질은 6M 우레아로 떼어낸 후 트립신 처리와 단백질 동정을 하였다.

임상시료는 ‘정상’(Normal; "N")과 ‘환자’(Cancer; "C") 시료로 나누었 으며, 정상 혈액은 6명의 지원자 (평균 나이 44세)에서 나온 것으로 어떠한 발암 기록도 없고 건강검진에서 정상으로 나온 사람들의 것을 사용하였다. 환자시료는 10명의 대장암 환자에서 유래한 것으로 평균 나이 49세로 부분적 림프노드 전이 (pN0:40%, pN1:50%, pN2:10%), 침윤 깊이(pT2:10%, pT3:80%, pT4:10%)이고 TNM(Tumor, Node, Metastasis) 단계는 (단계 I:10%, II: 20%, III: 70%)였다. 본 발명에서는 반-정량적 접근으로, 환자 시료에서는 검출되지만 정상에서는 나오진 않는 단백질들을 Microsoft Excel을 이용하여 찾아내었다. 이 단백질들 중 단지 하나의 펩타이드만 동정된 경우는 배제하여 최종 100개 이상의 단백질이 동정되었다. 이들 중 1) 최소한 1개 이상의 N-연결형 당쇄 부가 위치(N-X-S/T, 여기서 X는 프롤린을 제외한 아미노산)를 포함할 것, 2) 민감도(sensitivity)가 50% 이상일 것이라는 두 가지 단서를 충족하는 단백질을 뽑은 결과 최종 26개의 후보가 선택되었다. 이렇게 선택된 26개의 단백질 리스트가 표 1에 나타나 있다. 이 단백질들은 정상의 혈액에는 나타나지 않고 암환자에만 나타났으므로 특이도(specificity)가 100%이다.

종양 전개의 과정은 생체분자의 양적, 질적 변화를 가져온다. 양적 변화는 특히 단백질에서는 발현 정도의 변화를 의미하며 바이오마커 발굴의 주류연구는 병리학적 과정에서 단백질 발현의 변동 및 균형파괴에 관한 것이었다. 질적 변화는 인산/비인산화, 단백질의 분해, 당질화 그리고 여타의 번역후 변형 (PostTranslational Modification)을 수반하는 변화를 의미한다. 특히 당질의 변화는 암의 악성화, 침윤 및 전이과정과 밀접하게 관련이 있음이 보고되어 왔다. 이 점을 고려할 때 단백질의 양적 및 질적 변화를 고려하면 암의 진단 및 예측에 좀더 유용한 정보를 얻을 수 있다. 예를 들어 현재 간암의 마커로 사용되고 있는 α-피토프로테인(α-fetoprotein; AFP)의 경우, 그 자체로는 약 50% 정도의 민감도를 보여주지 못한다. 하지만 AFP에 결합되는 퓨코실화 (fucosylation)를 함께 고려할 경우 민감도는 69%로, 특이도는 90% 정도로 증가하게 된다. 따라서 L-PHA를 사용하면 양적 변화없이 β1,6-GlcNAc가지가 첨가된 단백질(질적 변화)과, 원래 가지고 있지만 소량존재하여 검출되지 않던 단백질이 암형성 과정에서 양적으로 증가한(양적 변화) 단백질들을 함께 모을 수 있게 된다.

대부분의 당단백질들은 세포막이나 소포체막과 같은 생체막에 위치하거나 세포 밖으로 분비된다. 이러한 이유로 혈청에는 각종 조직 유래의 당단백질이 존재하게 된다. 또한 실제 지금까지 보고되어 있는 유용한 바이오마커들이 당단백질인데 전립선의 마커인 PSA(prostate specific antigen)나 간암의 마커인 AFP(α-fetoprotein)가 그러한 예이다. 따라서 다양한 렉틴을 바이오마커 개발의 전반부에 사용하면 이렇게 유용한 당단백질들만을 효과적으로 포집할 수 있는 중요한 스텝으로 활용할 수 있다. 또한 이후 질량분석기와 연동하여 단백질의 확인에도 효과적으로 사용될 수 있기 때문이다. AAL(Aleuria aurantia lectin), AAA(Anguillaanguilla agglutinin), 및 SNA1(Sambucusnigra 1)등은 특정한 당구조만을 인식할 수 있는 렉틴이며 Con A나 WGA(Wheat germ agglutinin)는 폭넓은 단백질들을 비교적 비특이적으로 인식하는 렉틴이다. 이렇게 비특이적인 렉틴을 사용한다면 많은 양의 렉틴이 필요하게 되며 이는 질량분석과정에서 단백질 분석의 방해 를 일으킬 수 있다. 따라서 우리는 암과 좀더 밀접한 관련이 있는 당쇄 변화를 추적하기 위해 L-PHA를 사용하게 되었는데 이는 이미 언급한 바와 같이 암에 의해 증가되는 β1,6-GlcNAc 가지를 갖는 당단백질들을 효과적으로 탐지할 수 있는 렉틴이기 때문이다.

표 1은 상기 방법을 통해 얻은 대장암의 바이오마커 리스트이다. 유방암에서 증가하는 것으로 알려진 NY-BR-1.1의 호몰로그인 NY-BR-1.1을 제외하고는 대부분의 단백질이 암의 바이오마커로서의 연구가 거의 이루어지지 않은 새로운 바이오마커 후보군들이다. 이 후보들이 과연 대장암에 특이적인지를 알아보는 실험을 간암의 혈청을 시료로 하여 상기 기술한 바와 같은 방법으로 진행하였다. 그 결과 100%의 특이도와 50% 이상의 민감도를 갖는 24종류의 간암 바이오마커 후보군을 얻어낼 수 있었다. 하지만 polyamine modulated factor 1-binding protein 1 (IPI00235481) 와 isoform 1 of formin-1 (IPI00854651)을 제외하고는 어떠한 단백질도 대장암의 바이오마커 후보군과 겹치지 않았다. 이는 표 1의 후보군이 대장암에 특이적인 바이오마커 후보군임을 말해 주고 있다. 바이오마커 디스커버리 단계는 오차율이 크고 신뢰성이 낮기 때문에 현재로는 표 1의 단백질들이 바이오마커 후보군으로 분류된다. 이 후의 심도있는 validation과정을 통해 진정한 대장암 바이오마커들이 선별될 것이며, 또한 상기 기술된 방법은 결정암 이외의 다른 암들의 바이오마커 디스커버리 과정에 직접적으로 적용될 수 있을 것이다.

도 1은 혈액 내에 존재하는 여러 단백질의 양적 범위(dynamic range)를 보여주는 그림이다.

도 2는 혈청을 이용하여 바이오마커를 발굴하는 최적 조건 구현의 전략을 보여주는 그림이다. (A)는 부분 정제시(Con A 컬럼 혹은 면역제거), L-PHA의 형태(L-PHA-아가로스 혹은 L-PHA-비오틴-아비딘-아가로스), 트립신 처리(겔상 처리 혹은 액상처리)를 이용하여 실험한 결과, 오른쪽에 최적의 방법을 제시한 그림이며, (B-C)는 부분 정제시, L-PHA의 형태, 트립신처리의 변화에 따른 서열 할당 정도(B)와 전체값(C)을 보여주는 그림이다. 이런 방법을 통해 하나의 이온값보다 (P<0.05) 약 2.8배 정도의 단백질 수를 보여주었다. 도면 중 "L-PHA-avi-agarose"는 L-PHA-비오틴-아비딘-아가로스를 나타낸다.

도 3은 혈청에서 30개의 과상존 단백질을 면역제거하는 그림이다. ProteomPrep 20 혈청 20 면역제거 LC 컬럼을 이용하여 붙지 않는 미량 단백질을 정제하고 (A) 이를 다음의 실험에 이용하였다. (B)의 그림은 과상존 단백질을 제거한 군(+D)과 제거하지 않은 군(-D)에 대하여 SDS-PAGE를 펼치고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 그림으로, 50㎍의 단백질에서 알부민(약 67 KDa)과 이뮤노글로불린(약 56 KDa)이 제거된 것을 보여주고 있다. (C)는 동량의 혈청을 SDS-PAGE 전개한 후 L-PHA 블럿을 수행한 그림으로 면역제거로 더 많은 미량 당단백질을 확보할 수 있음을 보여주고 있다. (D-E)는 L-PHA-바이오틴-아비딘-아가로스로 정상(N)과 환자(C)의 혈청을 포집한 후 10% SDS-PAGE를 전개하여 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 (D)과 L-PHA 블럿을 수행(E)한 그림으로 이때 X-레이필름은 충분한 시간을 감광시킨 것이다.

Claims (20)

1. 혈액 시료 내의 과상존 단백질을 과상존 단백질 제거용 크로마토그래피로 제거하는 단계;

   상기 과상존 단백질이 제거된 시료를 환원 및 알킬화하는 단계;

   리간드가 결합된 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄)와 상기 리간드에 결합하는 리간드 수용체가 결합된 글라이칸 비드를 반응시켜 얻어지는 L₄-PHA-글라이칸 비드에 상기 환원 및 알킬화된 시료를 가하여 반응시키는 단계;

   상기 L₄-PHA-글라이칸 비드에 결합한 시료를 용출하는 단계;

   상기 용출된 시료를 소화하여 질량분석하는 단계;

   를 포함하는 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 혈액 유래 당단백질을 동정하는 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 글라이칸 비드는 아가로스 또는 세파로스 비드인 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법.
3. 제1항에 있어서,

   상기 리간드 및 리간드 수용체는 바이오틴 및 아비딘인 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법.
4. 제1항에 있어서,

   상기 용출 단계는 우레아 또는 SDS-PAGE 변성완충용액을 이용하는 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 당단백질은 종양 발생 또는 전이의 마커인 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법.
6. 대조구 및 분석구의 혈액 시료 내의 과상존 단백질을 각각 과상존 단백질 제거용 크로마토그래피로 제거하는 단계;

   상기 과상존 단백질이 제거된 대조구 및 분석구 시료를 각각 환원 및 알킬화하는 단계;

   리간드가 결합된 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄)와 상기 리간드에 결합하는 리간드 수용체가 결합된 글라이칸 비드를 반응시켜 얻어지는 L₄-PHA-글라이칸 비드에 상기 환원 및 알킬화된 대조구 및 분석구 시료를 각각 가하여 반응시키는 단계;

   상기 L₄-PHA-글라이칸 비드에 결합한 대조구 및 분석구 시료를 각각 용출하는 단계;

   상기 용출된 대조구 및 분석구 시료를 소화하여 질량분석하는 단계;

   를 포함하는 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법.
7. 제6항에 있어서,

   상기 글라이칸 비드는 아가로스 또는 세파로스 비드인 것을 특징으로 하는, 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법.
8. 제6항에 있어서,

   상기 리간드 및 리간드 수용체는 바이오틴 및 아비딘인 것을 특징으로 하는, 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법.
9. 제6항에 있어서,

   상기 용출 단계는 우레아 또는 SDS-PAGE 변성완충용액을 이용하는 것을 특징으로 하는, 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법.
10. 제6항에 있어서,

    상기 대조구 및 분석구는 각각 정상인의 혈액과 진단 대상자의 혈액인 것을 특징으로 하는, 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법.
11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질은 종양 발생 또는 전이의 마커인 것을 특징으로 하는, 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법.
12. 상기 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질은 암 발생 및 전이에 관여하는 다이아실글리세롤 키나아제 제타의 긴 아이소폼(Isoform Long of Diacylglycerol kinase zeta), JmjC 도메인 함유 히스톤 디메틸화 단백질 2A(JmjC domai-containing histone demethylation protein 2A), 프로토카데린 알파 C2 전구체의 긴 아이소폼(Isoform Long of Ptorocadherin alpha C2 precursor), 뇌-구조-인자-1(Brain-rescue-factor-1), 숙주 세포 인자 2(Host cell factor 2), 이중 기능성 헤파란 설페이트 N-디아세틸화효소/N-황전이효소 4(Bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase 4), 폴리아민 변환 인자 1-결합 단백질 1(Polyamine modulated factor 1-binding protein 1), 카복시펩타다아제 B2 전구체의 아이소폼 2(Isoform 2 of Carboxypeptidase B2 precursor), FLJ00268 단백질(조각){FLJ00268 protein(Fragment)}, α-3 타입 Ⅵ 콜라겐 아이소폼 1 전구체 유사(Similar to alpha 3 type Ⅵ collagen isoform 1 precursor), B0416.5a 유사(Similar to B0416.5a), OTU 도메인 함유 1(OTU domain containing 1), 컴플리먼트 C1r-유사 단백질(Complement C1r-like protein), A-키나아제 앵커 단백질의 아이소폼 1(Isoform 1 of A-kinase anchor protein 9), 187kDa 단백질(187kDa protein), Rho-GTPase 활성 단백질 10(Rho-GTPase activating protein 10), WW 도메인-결합 단백질 7의 아이소폼 1(Isoform 1 of WW domain-binding protein), 183kDa 단백질(183kDa protein), 키네신-유사 모터 단백질 C20orf23의 아이소폼 2(Isoform 2 of Kinesin-like motor protein C20orf23), 361kDa 단백질(361kDa protein), 코일드코일 도메인 함유 132 아이소폼 a(Coiled coil domain containing 132 isoform a), 유방암 항원 NY-BR-1.1 유사(Similar to breast cancer antigen NY-BR-1.1), 포르민-1의 아오소폼 1(Isoform 1 of Formin-1), 에프린 타입-A 수용체 8 전구체(Ephrin type-A receptor 8 precursor), 아미노펩티다제 O의 아이소폼 1(Isoform 1 of Aminopeptidase O), 신경세포 접합물질 L-1 유사 단백질 전구체의 아이소폼 2(Isoform 2 of Neural cell adhesion molecule L1-like protein precursor)로 구성되는 단백질 군 중 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질인 것을 특징으로 하는, 특정 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법.
13. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 검출되며, 대조구와 분석구 사이에 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질군 중 하나 또는 그 이상의 단백질에 대한 각각의 항체가 흡착된 기질;

    상기 당단백질군 중 하나 또는 그 이상의 단백질에 대한 각각의 항체;

    리간드가 결합된 N-연결형 당쇄변화 측정용 렉틴;

    발색 또는 발광 효소로 표지된 2차 항체;

    및 발색 또는 발광 효소로 표지된 상기 리간드의 수용체;를 포함하는 암 진단용 키트.
14. 제13항에 있어서, 상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
15. 제13항에 있어서, 상기 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 수지로 합성된 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
16. 제13항에 있어서, 상기 발색 또는 발광 효소는 퍼옥시데이즈, 알칼라인 포스파테이즈로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
17. 제13항에 있어서, 상기 리간드 및 상기 리간드 수용체는 바이오틴 및 아비딘인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
18. 제13항에 있어서, 발색 또는 발광 기질액을 추가적으로 포함하는 것을 특징 으로 하는 암 진단용 키트.
19. 제13항에 있어서, 상기 N-연결형 당쇄 변화 측정용 렉틴은 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄) 및 LCA(lens culinaris agglutinin) 중 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
20. 제13항에 있어서,

    대조구와 분석구 사이에 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질은 다이아실글리세롤 키나아제 제타의 긴 아이소폼(Isoform Long of Diacylglycerol kinase zeta), JmjC 도메인 함유 히스톤 디메틸화 단백질 2A(JmjC domai-containing histone demethylation protein 2A), 프로토카데린 알파 C2 전구체의 긴 아이소폼(Isoform Long of Ptorocadherin alpha C2 precursor), 뇌-구조-인자-1(Brain-rescue-factor-1), 숙주 세포 인자 2(Host cell factor 2), 이중 기능성 헤파란 설페이트 N-디아세틸화효소/N-황전이효소 4(Bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase 4), 폴리아민 변환 인자 1-결합 단백질 1(Polyamine modulated factor 1-binding protein 1), 카복시펩타다아제 B2 전구체의 아이소폼 2(Isoform 2 of Carboxypeptidase B2 precursor), FLJ00268 단백질(조 각){FLJ00268 protein(Fragment)}, α-3 타입 Ⅵ 콜라겐 아이소폼 1 전구체 유사(Similar to alpha 3 type Ⅵ collagen isoform 1 precursor), B0416.5a 유사(Similar to B0416.5a), OTU 도메인 함유 1(OTU domain containing 1), 컴플리먼트 C1r-유사 단백질(Complement C1r-like protein), A-키나아제 앵커 단백질의 아이소폼 1(Isoform 1 of A-kinase anchor protein 9), 187kDa 단백질(187kDa protein), Rho-GTPase 활성 단백질 10(Rho-GTPase activating protein 10), WW 도메인-결합 단백질 7의 아이소폼 1(Isoform 1 of WW domain-binding protein), 183kDa 단백질(183kDa protein), 키네신-유사 모터 단백질 C20orf23의 아이소폼 2(Isoform 2 of Kinesin-like motor protein C20orf23), 361kDa 단백질(361kDa protein), 코일드코일 도메인 함유 132 아이소폼 a(Coiled coil domain containing 132 isoform a), 유방암 항원 NY-BR-1.1 유사(Similar to breast cancer antigen NY-BR-1.1), 포르민-1의 아오소폼 1(Isoform 1 of Formin-1), 에프린 타입-A 수용체 8 전구체(Ephrin type-A receptor 8 precursor), 아미노펩티다제 O의 아이소폼 1(Isoform 1 of Aminopeptidase O), 신경세포 접합물질 L-1 유사 단백질 전구체의 아이소폼 2(Isoform 2 of Neural cell adhesion molecule L1-like protein precursor)로 구성되는 단백질 군 중 하나인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.

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