CN113176361B

CN113176361B - 一种蜂花粉致敏蛋白的鉴定方法及应用

Info

Publication number: CN113176361B
Application number: CN202110732923.6A
Authority: CN
Inventors: 李强强; 吴黎明; 薛晓锋; 陶宇逍; 尹舒婷
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN113176361A

Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种蜂花粉致敏蛋白的鉴定方法及应用。本发明所提供的蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法包括：以蜂花粉冻干粉作为鉴定样品，对样品进行蛋白抽提、蛋白酶切、肽段除盐及质谱检测鉴定；在所述蛋白抽提中，对样品与蛋白抽提剂的混合物采取间歇式超声破碎的处理手段。本发明提供的鉴定方法解决了目前蜂花粉致敏原鉴定不完善的现状；同时，本发明所述鉴定方法获得蜂花粉潜在致敏原的氨基酸序列，并分析其被T细胞和B细胞识别的抗原表位，明确致敏属性。本发明提供的鉴定方法适用于不同植物来源的蜂花粉，特别是通过该鉴定方法还进一步明确了油菜蜂花粉中5种潜在的致敏蛋白，为后续质量安全控制提供了依据。

Description

一种蜂花粉致敏蛋白的鉴定方法及应用

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种蜂花粉致敏蛋白的鉴定方法及应用。

背景技术

蜂花粉因其丰富的营养价值、极高的食用和药用功效，目前已在食品、保健品、药品行业，以及畜牧养殖方面有所应用。随着蜂花粉适用范围的扩大，食用蜂花粉随即带来的安全问题也逐渐引起人们的关注。

蜂花粉来源于植物花粉，虽然经过工蜂的处理，一部分致敏物质发生改变或降解，致敏性较其植物源花粉有所改善，但数据显示，仍有一部分易感人群食用蜂花粉后产生临床过敏症状。

目前食品过敏原分析方法主要有酶联免疫法、聚合酶链法和质谱法；其中质谱法应用最为普及。如CN107064390A所述，检测方法主要分为两类：一是利用高分辨率质谱和解卷积等数据处理技术在蛋白水平进行研究；二是将蛋白酶解为肽段后进行定性和定量研究，在肽水平实现蛋白的定性和定量。第二种方法已经可以实现一次分析中同时检测多个同类型的过敏原，是当前致敏蛋白检测的主流技术。

然而，由于蜂花粉成分的特殊性，现有常规的食品致敏蛋白分析鉴定方法难以准确鉴定出蜂花粉中致敏蛋白种类，严重制约了蜂花粉的开发利用与产业发展。

发明内容

本发明的第一方面是提供一种蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法。该方法解决了一直以来蜂花粉致敏蛋白鉴定不完善的技术难题。

本发明所提供的蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法，包括：以蜂花粉冻干粉作为鉴定样品，对样品进行蛋白抽提、蛋白酶切、肽段除盐及质谱检测鉴定；其中：

在所述蛋白抽提中，对样品与蛋白抽提剂的混合物采取间歇式超声破碎的处理手段。

研究表明，提高致敏蛋白鉴定准确性除了要改进检测方法外，还需要考虑预处理程序中样品中其他成分对致敏蛋白纯化提取效果的影响。本发明研究发现，现有食品致敏蛋白鉴定方法难以应用于蜂花粉的主要原因是蜂花粉中成分复杂，其存在碳水化合物、脂类、盐类、植物色素等多种复杂成分，由于这些成分在样品处理过程中产生干扰作用，使得现有常规检测方法难以准确鉴定出其中致敏蛋白种类。

为此，本发明提出采用间歇式超声破碎的方式进行蛋白抽提，既能够保证蜂花粉冻干粉样品中致敏蛋白被充分提取，又避免蜂花粉中其他成分的过度掺杂，从而更有利于提高后续鉴定的准确性。

优选地，所述间歇式超声破碎的条件：超声3-4s，间隔3-4s，重复30-32次。

进一步优选地，所述蜂花粉冻干粉的含水率控制在7%以下，同时蜂花粉冻干粉的粒径尺寸为100~300目。通过控制蜂花粉冻干粉的含水率及粒径尺寸，可进一步提高致敏蛋白的提取率，同时又避免蜂花粉中其他成分被过度提取，影响提取质量。

所述蛋白抽提剂可通过市售购买得到；或者自制获得。

在本发明中，所述蛋白抽提剂由pH7.4的25mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、150mmol/L氯化钠、1mmol/L乙二胺四乙酸、质量分数1%乙基苯基聚乙二醇和质量分数5%甘油组成。

本发明所述的蛋白酶切包括沉淀蛋白的复溶、乙酰化反应、酶解。

所述复溶为：将蛋白抽提得到的沉淀蛋白经尿素溶液复溶，得到复溶蛋白溶液；其中尿素溶液的浓度为5-6mol/L。研究表明，通过控制尿素溶液的浓度，可以增加蛋白沉淀的复溶率，使蛋白提取物充分地溶解于尿素溶液中，同时避免因浓度过大而导致杂质的复溶掺入。

所述乙酰化反应为：向所得复溶蛋白溶液中依次加入碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液，室温反应1~2 h，再加入碘乙酰胺溶液，室温避光反应1~2 h。本发明研究发现，常规乙酰化反应所用试剂用量并不是针对蜂花粉蛋白提取物所设置的，存在乙酰化反应不充分的问题。为此，本发明通过针对蜂花粉蛋白提取物进行乙酰化试剂用量的优化，最终限定所述碳酸氢铵溶液的加入体积是尿素溶液体积的4~6倍；且所述乙酰化反应的体系中，所述碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘乙酰胺的最终摩尔比为：（4~5）：1：5，由此可解决蜂花粉蛋白提取物乙酰化反应不充分的问题。

所述酶解采用质谱级胰酶（Trypsin），其用量为乙酰化反应所得蛋白溶液中蛋白质量的1/100~1/30，优选1/50。研究表明，通过控制胰酶用量，起到充分酶切蜂花粉蛋白提取物的作用，同时又避免过度酶切而影响鉴定结果的准确性。

所述肽段除盐为：对所述蛋白酶切得到的肽段进行除盐；所述除盐采用洗脱柱Ziptips（Millipore公司），操作步骤如下：

首先，利用Ziptip活化液和平衡液分别冲洗洗脱柱ZiptipsC18柱数次；

然后，利用洗脱柱Ziptips反复抽吸酶解所得蛋白溶液数次，使其中肽段充分结合在洗脱柱Ziptips上；

最后，利用Ziptip洗脱液冲洗洗脱柱Ziptips上吸附的肽段，重复数次。

优选地，以上各步骤重复10-12次。

本发明研究表明，通过上述除盐步骤，有效解决了后续质谱检测中盐类对检测结果干扰的问题，取得了提高质谱检测灵敏度和准确度的技术效果。

所述质谱检测鉴定采用EASY-nLC1000纳升级液相色谱仪串联LTQ-OrbitrapElite组合型质谱仪进行；其中：

富集柱的规格：100μm×2cm，5μm，反相C18柱；

分析柱的规格：75μm×15cm，3μm，100Å，反相C18柱；

色谱条件如下：

流动相流速为350nL/min；

流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；

流动相洗脱梯度如下：

质谱条件如下：

一级全扫描：离子源为电喷雾离子源（ESI），喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为300-8000m/z；

二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子；

二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离（HCD），能量为30%。

通过上述质谱检测条件的优化，起到提高质谱检测灵敏度和准确度的作用。

所述质谱检测鉴定还包括：将采集的检测原始数据与蛋白数据库比对，获得蛋白质氨基酸序列；进一步与致敏蛋白数据库进行蛋白质序列同源性比对，确定潜在致敏蛋白种类；再进一步通过对潜在致敏蛋白种类的结构分析确定其抗原表位属性。

本发明的第二方面提供上述鉴定方法在油菜蜂花粉中的具体应用。

以油菜蜂花粉为研究对象，通过上述鉴定方法获得其潜在的5种致敏蛋白：Profilin，Expansin，Prolamin，Oleosin B2和Glutaredoxin。这一发现为后续质量安全控制提供了依据。

与现有技术相比较，本发明具有以下优点：

一是提供一种鉴定蜂花粉致敏原的方法，以解决目前蜂花粉致敏原鉴定不完善的现状；

二是获得蜂花粉潜在致敏原的氨基酸序列，并分析其被T细胞和B细胞识别的抗原表位，明确致敏属性。

本发明提供的鉴定方法适用于不同植物来源的蜂花粉，特别是通过该鉴定方法还进一步明确了油菜蜂花粉中5种潜在的致敏蛋白，为后续质量安全控制提供了依据。

附图说明

图1为从油菜蜂花粉中鉴定得到的致敏蛋白Profilin的代表性肽段质谱图。

图2为从油菜蜂花粉中鉴定得到的致敏蛋白Expansin的代表性肽段质谱图。

图3为从油菜蜂花粉中鉴定得到的致敏蛋白Prolamin的代表性肽段质谱图。

图4为从油菜蜂花粉中鉴定得到的致敏蛋白Oleosin B2的代表性肽段质谱图。

图5为从油菜蜂花粉中鉴定得到的致敏蛋白Glutaredoxin的代表性肽段质谱图。

图6为从油菜蜂花粉中分析得到的致敏蛋白Profilin的抗原表位图。

图7为从油菜蜂花粉中分析得到的致敏蛋白Expansin的抗原表位图。

图8为从油菜蜂花粉中分析得到的致敏蛋白Prolamin的抗原表位图。

图9为从油菜蜂花粉中分析得到的致敏蛋白Oleosin B2的抗原表位图。

图10为从油菜蜂花粉中分析得到的致敏蛋白Glutaredoxin的抗原表位图。

图11为实施例2与对比例2、3测定的已知致敏原Polcalcin的特征肽段丰度比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中各组分均可通过市售购买得到。

实施例1

本实施例提供了油菜蜂花粉致敏原的鉴定方法，具体步骤如下：

1）样品预处理，得到蜂花粉冻干粉：

准确称取5.0g研磨好的油菜蜂花粉粉末（100~300目）；

利用真空冷冻干燥机对蜂花粉粉末进行真空冷冻干燥，所需干燥时长约为48h，获得蜂花粉冻干粉。

利用GB5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》测定该冻干粉的含水量，在7%以下达标。

2）蛋白抽提，得到沉淀蛋白：

准确称取100.0mg油菜蜂花粉冻干粉，加入1mL蛋白抽提剂；

超声破碎，条件为超声3s，间隔3s，重复30次，超声结束后继续室温振荡30~60min；

然后于4℃，13000g条件下离心15min，吸取400μL上清液，并向其中加入2mL丙酮冰上放置60min以沉淀蛋白，去上清，得到沉淀蛋白；

其中，蛋白抽提剂由pH7.4的25mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、150mmol/L氯化钠、1mmol/L乙二胺四乙酸、1%乙基苯基聚乙二醇和5%甘油组成。

3）蛋白酶切，得到肽段：

3.1）沉淀蛋白的复溶，得到复溶蛋白溶液：

沉淀蛋白用100μL 5mol/L尿素溶液复溶，得到复溶蛋白溶液；

然后利用Brandford法测定复溶蛋白溶液的蛋白浓度；再根据蛋白浓度计算蛋白质量；

3.2）乙酰化反应：

向复溶蛋白溶液中加入400μL 40mmol/L碳酸氢铵溶液，然后加入50μL 100mmol/L二硫苏糖醇溶液，室温反应1h，再加入250μL 100mmol/L碘乙酰胺溶液，室温避光1h，进行乙酰化反应。

3.3）酶解，孵育：

向乙酰化后的蛋白溶液中加入蛋白质量的1/50的质谱级胰酶（Trypsin），37℃下孵育12h，加入1µL甲酸终止反应。

4）肽段除盐：

肽段除盐采用的是Millipore公司的除盐洗脱柱Ziptips，操作如下：

首先用Ziptip活化液和平衡液分别冲洗ZiptipC18柱10次，然后用Ziptip反复抽吸孵育后的蛋白溶液10次，使其肽段充分结合在Ziptip柱上，再利用Ziptip洗脱液冲洗柱上吸附的肽段，重复10次。

将带有肽段的洗脱液进行真空干燥，然后用0.1%甲酸溶液溶解，于4℃，13000g条件下离心10min取上清。

用Nanodrop2000测定肽段浓度；根据肽段浓度，确定质谱上样体积。

5）质谱检测鉴定：

利用EASY-nLC1000纳升级液相色谱仪串联LTQ-OrbitrapElite组合型质谱仪（ThermoFisherScientific，USA）；其中：

富集柱（100μm×2cm，5μm）和分析柱（75μm×15cm，3μm，100Å）均为ThermoFisherScientific公司生产的反相C18柱。

色谱条件设置如下：

流动相流速为350nL/min，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液。

流动相洗脱梯度设置见表1。

表1

质谱条件设置如下：

一级全扫描：离子源为电喷雾离子源（ESI），喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为300-8000m/z。

二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子。二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离（HCD），能量为30%。

定性分析：采集的原始数据导入PeaksDB7.5分析软件进行定性分析。

定性分析的参数设置：

从Uniprot下载芸苔属植物（Brassica）蛋白质数据库进行质谱数据检索。设置母离子质量误差为15ppm，子离子质量误差为0.05Da，Trypsin酶切最大漏切位点数为2，可变修饰为oxidation（M,+15.99），固定修饰为carbamidomethyl（C,+57.02）。所有检索结果采用正反库融合的算法控制蛋白和肽段的假阳性率（FDR）小于1%。

经Uniprot蛋白质数据库检索获得的蛋白质氨基酸序列，采用AllergenOnline致敏蛋白数据库进行蛋白质序列同源性比对，确定潜在致敏蛋白种类；然后对确定的潜在致敏蛋白进一步通过DNAStar软件进行结构分析确定其抗原表位属性。

基于上述方法从油菜蜂花粉中鉴定出5种潜在致敏蛋白，分别为Profilin，Expansin，Prolamin，Oleosin B2和Glutaredoxin其代表性肽段质谱信息如图1~5，抗原表位属性见图6~10。

实施例2

本实施例提供一种油菜蜂花粉中已知致敏蛋白的鉴定方法，以验证本发明所述的鉴定方法的准确性。

具体实验步骤与实施例1相同，经过鉴定得到了油菜蜂花粉中的一种已知致敏蛋白，为Polcalcin，同时获得Polcalcin的一级序列，并通过结构分析得到该致敏蛋白的T细胞和B细胞抗原表位呈阳性，与已知致敏蛋白的特性相一致。

可见，上述试验结果验证了本发明所述鉴定方法是准确、可靠的。

对比例1

本实施例提供了一种油菜蜂花粉致敏原的鉴定方法，与实施例1的区别仅在于：采用连续超声破碎处理样品；处理时间100s。

结果显示：经此方法得到的样品中杂质（包括脂质、糖类、盐类、色素）干扰严重，影响致敏蛋白的特征肽段丰度，无法对致敏蛋白一级序列进行鉴定。

对比例2

本实施例提供了一种油菜蜂花粉致敏原的鉴定方法，与实施例2的区别仅在于：蜂花粉冻干粉的含水率为9%。

结果显示：经质谱分析发现该对比例测定的已知致敏原Polcalcin的特征肽段丰度较实施例2获得的特征肽段丰度下降约20%（见图11），说明含水率影响了该致敏蛋白的提取率。

对比例3

本实施例提供了一种油菜蜂花粉致敏原的鉴定方法，与实施例2的区别仅在于：蜂花粉冻干粉的粒径尺寸为80目。

结果显示：经质谱分析发现该对比例测定的已知致敏原Polcalcin的特征肽段丰度较实施例2获得的特征肽段丰度下降约40%（见图11），并且该致敏蛋白的部分特征肽段无法鉴定到，影响鉴定的准确性。

对比例4

本实施例提供了一种油菜蜂花粉致敏原的鉴定方法，与实施例1的区别仅在于：尿素溶液的浓度为9mol/L。

结果显示：蛋白酶切效果差，高浓度尿素使胰酶部分失活，影响后续质谱鉴定灵敏度和准确性。

对比例5

本实施例提供了一种油菜蜂花粉致敏原的鉴定方法，与实施例1的区别仅在于：碳酸氢铵溶液的加入体积是尿素溶液体积的2倍。

对比例6

本实施例提供了一种油菜蜂花粉致敏原的鉴定方法，与实施例1的区别仅在于：所述碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘乙酰胺的摩尔终浓度为40 mmol/L、10 mmol/L、10 mmol/L。

结果显示：蛋白乙酰化反应不充分，通过质谱无法鉴定出致敏蛋白的特征肽段。

对比例7

本实施例提供了一种油菜蜂花粉致敏原的鉴定方法，与实施例1的区别仅在于：胰酶用量为样品蛋白质量的1/200。

结果显示：酶切效果差，无法通过质谱鉴定致敏蛋白的特征肽段。

对比例8

本实施例提供了一种油菜蜂花粉致敏原的鉴定方法，与实施例1的区别仅在于：所述除盐采用琼葡糖凝胶G25 FF脱盐柱。

所述除盐的操作步骤如下：

（1）冲洗：首先加入5倍柱体积的蒸馏水对填料进行冲洗；

（2）平衡：用5倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡；

（3）上样：样品蛋白的上样体积控制在填料体积15%；

（4）洗脱：加入平衡缓冲液进行洗脱，洗脱体积控制在1倍柱体积；

（5）将带有肽段的洗脱液进行真空干燥，然后用0.1%甲酸溶液溶解，于4℃，13000g条件下离心10min取上清。后续步骤与实施例1相同。

结果显示：经此方法得到的蛋白样品脱盐效果不如实施例1，质谱检测时存在干扰，影响离子化效应，降低致敏蛋白鉴定的准确度。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法，包括：以蜂花粉冻干粉作为鉴定样品，对样品进行蛋白抽提、蛋白酶切、肽段除盐及质谱检测鉴定；其特征在于，

所述致敏蛋白为Profilin，Expansin，Prolamin，Oleosin B2和Glutaredoxin；

所述致敏蛋白Profilin的氨基酸序列为MSVTAKVTTSPLPLSSAMTVAFGLRALIFLRQYLFLSSLIFHDCFKPQEMTDIMKDFDEPGHLAPTGLFLAGLKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQSMVFGLYEEPVTPGQCNMVVERLGDYLVEQDL，代表性肽段为DFDEPGHLAPTGLFLAGLK；

所述致敏蛋白Expansin的氨基酸序列为MKLLQNIIFVQVLMMAMVIWIVPMTYGHGHGHDHGHGHGHGHHAPVAGWLDARATFYGDINGGQTHQGACGYGDLHKQGFGLATAALSTALFNNGYTCGACYEIKCANSPQWCLPGSIKITATNFCPPDPSNKKDSWCNPPQKHFDLSQPMFLKIAQYKAGVVPVRYRRVHCTKTGGVKFEIKGNPHFVMVLPYNVGGAGDIKELCIKGTKTDWIKMQKNWGQIWNSGVVMTGQCLSFRITTSDGSTKDFMDVTPTNWGFNGQAFDGKINF，代表性肽段为ATFYGDINGGQTHQGACGYGDLHK；

所述致敏蛋白Prolamin的氨基酸序列为MKNLTMLVAIILFSCYVTSQVTASDMESMPSLRSEKLEWWHYHSYPYFHPKPPQWTFPCAGGKAFPPLPAGYNHPFHPVPFHPPPVVAKCLSDCKDVKTCMADIQKAFFTHKPVIGSECCASIQKMDVDCDKTVFGAYHNPFFDYFVKLHCATKSGSTPSAPSPA，代表性肽段为AFFTHKPVIGSECCASIQK；

所述致敏蛋白Oleosin B2的氨基酸序列为QASIFSRFFRMFSFIFPFVNVIKLIIASVTSLVCLAFSCVALGGSAVALIVSTPLFIMFSPILVPATIATTLLASGLMAGTTLGLTGIGLIMGLVRTAGGVSLLQSPLRKIIVNRIKARLGGGGGGSRLARLKKILGLLNKLRGMGAGGAAAPAAEPAPAAEAAPAAEAAPAAAPAAAPAAAP，代表性肽段为TAGGVSLLQSPLR；

所述致敏蛋白Glutaredoxin的氨基酸序列为MAMQKAKEIVSGNAVVVFSKSFCPYCVRVKELLQQLGAKFIAVELDKESDGSQVQSALAEWTGQRTVPNVFIGEKHIGGCDSVTNLHRDGKLVPMLTEAGAIAATAGTTSA，代表性肽段为AKEIVSGNAVVVFSK；

在所述蛋白抽提中，对样品与蛋白抽提剂的混合物采取间歇式超声破碎的处理手段；所述蜂花粉冻干粉的含水率控制在7%以下；蜂花粉冻干粉的粒径尺寸为100~300目；

所述蛋白酶切包括沉淀蛋白的复溶；所述复溶为将蛋白抽提得到的沉淀蛋白经尿素溶液复溶，得到复溶蛋白溶液；其中，所述尿素溶液的浓度为5-6mol/L；

所述蛋白酶切包括乙酰化反应；所述乙酰化反应为，向所得复溶蛋白溶液中依次加入碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液，室温反应1~2 h，再加入碘乙酰胺溶液，室温避光反应1~2h；

其中，所述乙酰化反应的体系中，所述碳酸氢铵溶液的加入体积是尿素溶液体积的4~6倍；所述碳酸氢铵、二硫苏糖醇与碘乙酰胺的摩尔比为：（4~5）：1：5。

2.根据权利要求1所述的蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法，其特征在于，所述间歇式超声破碎的条件：超声3-4s，间隔3-4s，重复30-32次。

3.根据权利要求1所述的蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法，其特征在于，所述蛋白酶切包括酶解；

所述酶解采用质谱级胰酶，其用量为乙酰化反应所得蛋白溶液中蛋白质量的1/100~1/30。

4.根据权利要求1或2所述的蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法，其特征在于，所述肽段除盐为对所述蛋白酶切得到的肽段进行除盐；

所述除盐采用洗脱柱Ziptips；

所述除盐的操作步骤如下：

5.根据权利要求1所述的蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法，其特征在于，所述质谱检测鉴定采用纳升级液相色谱仪串联组合型质谱仪进行；其中：

富集柱的规格：100μm×2cm，5μm，反相C18柱；

分析柱的规格：75μm×15cm，3μm，100Å，反相C18柱；

色谱条件如下：

流动相流速为350nL/min；

流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；

流动相洗脱梯度如下：

质谱条件如下：

一级全扫描：离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为300-8000m/z；

二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离，能量为30%。

6.根据权利要求5所述的蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法，其特征在于，所述质谱检测鉴定还包括：

将采集的检测原始数据与蛋白数据库比对，获得蛋白质氨基酸序列；

所得蛋白质氨基酸序列进一步与致敏蛋白数据库进行蛋白质序列同源性比对，确定潜在致敏蛋白种类；

对所得潜在致敏蛋白种类进行结构分析，确定其抗原表位属性。

7.权利要求1-6任一所述鉴定方法在油菜蜂花粉致敏蛋白鉴定中的应用；所述致敏蛋白为Profilin，Expansin，Prolamin，Oleosin B2和Glutaredoxin。