CN107290461B - 一种建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法，包括，电泳分析蜂王浆蛋白，对致敏蛋白条带预处理，液质联用方法分析鉴定，筛选致敏蛋白特异肽段；对蜂王浆样品进行蛋白提取、酶法消化，LC‑MS/MS法致敏蛋白定量测定。我方发明的针对致敏蛋白定量方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、准确度高、线性范围广等优点，可以有效地对实际样品中某种致敏蛋白进行准确的定量分析。

Description

一种建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法。

背景技术

蜂王浆简称RJ，又名蜂皇浆、蜂皇乳、蜂王乳、蜂乳，是蜜蜂巢中培育幼虫的青年工蜂咽头腺的分泌物，是供给将要变成蜂王的幼虫的食物，也是蜂王终身的食物。

所谓蜂王浆就是青壮年蜜蜂食用花粉后分泌的一种乳状物，此乳状物就像哺乳动物的乳汁并且极具营养价值和免疫功能而且含有极高的长寿因子，蜜蜂(工蜂或雄峰)和蜂王在卵期是一样的，孵化后吃三天蜂王浆以后改为吃蜂蜜和花粉的长成蜜蜂，孵化后一直食用蜂王浆的长成蜂王，蜜蜂(工蜂或雄峰)的寿限在一至六个月而蜂王因一直食用蜂王浆一般能活五到七年。蜂王浆的颜色是根据蜜蜂食用花粉的不同而稍有改变一般分为乳白色和微黄色。

蜂王浆中干物质中约50％为蛋白质，其中MRJP1(Major Royal Jelly Protein1)含量最丰富，约占蜂王浆水溶性蛋白的48％。MRJP1以3种形式存在：单体、低聚体以及与脂肪酸相互作用后形成的水不溶性聚合体。

Nano-RPLC为纳升反相液相色谱。

目前，国内外关于蜂王浆中MRJP1的定量分析多采用ELISA技术，其检测限高、线性范围差，难以大规模推广。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法的技术空白，提出了本发明。

因此，本发明的目的是解决现有技术中的不足，提供一种建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法，包括，电泳分析蜂王浆蛋白，对致敏蛋白条带预处理，液质联用方法分析鉴定，筛选致敏蛋白特异肽段；对蜂王浆样品进行蛋白提取、酶法消化，LC-MS/MS法致敏蛋白定量测定。

作为本发明所述建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法的一种优选方案，其中：所述用LC-MS/MS进行致敏蛋白定量测定，还包括，对蜂王浆样品的目标肽段的二级质谱图数据与所述筛选致敏蛋白特异肽段进行数据比对，观察目标肽段的二级断裂碎片及其信号强度是否完全匹配，以证明实验中筛选出的特异肽段是否符合要求。

作为本发明所述建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法的一种优选方案，其中：所述对蜂王浆样品进行蛋白提取、酶法消化，其是，将蜂王浆样品与水按质量比4:4～6混合，0～5℃抽提过夜提取，随后在离心力10000～14000g下离心20～40min，取上清液用NH₄HCO₃稀释，加入二硫苏糖醇，50～60℃水浴加热20～40min；冷却后加入碘乙酰胺，避光室温下反应20～40min，加入胰蛋白酶，混匀后35～40℃下水浴过夜，再加入甲酸，所得消化液用初始流动相稀释，然后在离心力10000～14000g，0～4℃下离心20～40min，过滤膜待用。

作为本发明所述建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法的一种优选方案，其中：所述初始流动相，包括乙腈与水按体积比1:8～10混合液和0.1～0.2％的甲酸。

作为本发明所述建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法的一种优选方案，其中：所述对致敏蛋白条带进行预处理，其是将致敏蛋白条带切下，用40～60％乙腈、NH₄HCO₃冲洗，加入无水乙腈，二硫苏糖醇于50～60℃下0.5～2h，再加入碘乙酰胺避光反应10～20min，加入胰蛋白酶，充分吸涨后加入含有8～12％乙腈的NH₄HCO₃溶液，35～40℃下过夜反应，分离出上清后,再向残渣中加入萃取液，35～40℃保温20～40min，超声10～20min，离心后合并上清液，冻干。

作为本发明所述建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法的一种优选方案，其中：所述萃取液，包括质量分数为65～70％的乙腈和4～6％的三氯乙酸。

作为本发明所述建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法的一种优选方案，其中：所述液质联用方法分析鉴定，其是将冻干的酶切样品重新溶解于Nano-RPLC流动相A(质量百分数0.1％甲酸，质量百分数2％乙腈水溶液)、纳升反向色谱流动相中，溶解后的样品以1～3μL/min的流速上样到C18预柱上(100μm×3cm，C18，3μm，

)，然后保持流速冲洗脱盐8～12min；

分析柱是C18反相色谱柱(75μm x 15cm C18-3μm

)，所用梯度为60～80min内流动相B(质量百分数0.1％甲酸，质量百分数95％乙腈水溶液)由4～6％升高至35～45％。质谱喷雾电压为2.0～2.8kV，气帘气压为25～35PSI，雾化气压为4～6PSI，加热温度为140～160℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式，一级飞行时间质谱单张图谱扫描时间为240～260ms，每次模式循环下最多采集35个电荷为2+到5+且单秒计数大于150的二级图谱，每张二级图谱的累积时间为60ms。每次循环时间固定为2.5秒，碰撞室能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离，动态排除设置为17～20s。

作为本发明所述建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法的一种优选方案，其中：所述LC-MS/MS法，其色谱条件包括，

色谱柱，C18柱(2.1mm x 100mm,1.7μm)；

柱温，35～45℃；

进样体积，8～12μL；

流动相A，0.1～0.2wt％甲酸水溶液；

流动相B，0.1～0.2wt％甲酸乙腈溶液；

流速，0.2～0.4mL/min；

梯度洗脱，洗脱程序为10min内，95～98％流动相A到58～62％流动相A；0.1min内，55～65％流动相A到100％流动相A，并100％流动相A维持1min,然后1min内到97％流动相A，最后柱子在97％流动相A的条件下平衡2～4min。

作为本发明所述建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法的一种优选方案，其中：所述LC-MS/MS法，其质谱条件包括，

电喷雾离子源电离模式，ESI+；

毛细管电压，3.0～4.0kV；

锥孔电压，25～40V；

提取器电压，2.5～3.5V；

入口透镜电压，0.2～0.4V；

离子源温度，110～120℃；

脱溶剂气温度，360～380℃；

脱溶剂气流量，550～650L/h；

锥孔反吹气流，45～50L/h；

扫描方式，多离子反应监控模式。

作为本发明所述建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法的一种优选方案，其中：所述电泳分析蜂王浆蛋白，其电泳条件包括，

10～12％聚丙烯酰胺单体浓度的分离胶，4～6％的浓缩胶，

缓冲液，2xSDS电泳缓冲液；

染色液，考马斯亮蓝染色液；

脱色液，水、醋酸、乙醇(7～9:1:1，wt％)；

样品和上样缓冲液按等体积稀释后点样，染色2～3h，脱色3～4h。

本发明所具有的有益效果：

由此可见，我方发明的针对致敏蛋白定量方法具有特异性强、灵敏度高(方法中MRJP1的检测限LOD 7.04μg/g，定量限LOQ 23.07μg/g)、重复性好(相对标准偏差RSD范围4.6～6.3％)、准确度高(三个加标浓度的回收率为88.65％,90.11％和87.26％)等优点，可以有效地对实际样品中某种致敏蛋白进行准确的定量分析。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为RJ蛋白的SDS-PAGE图。Lane 1，RJ-A；Lane 2，RJ-B；Lane 3，RJ-C；黑色箭头所指条带从上至下分别为MRJP1(MW，55KDa)和MRJP2(MW，49KDa)。

图2为实施例1定量方法的内标加标标准曲线，用于目标蛋白的定量计算，图中文字显示该校准曲线的相关系数r为0.999453，说明其在5～500ng/mL浓度范围内线性很好。

图3为是特异肽段标准品及其内标肽段的二级质谱图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

RJ中蛋白的提取

取纯RJ样品适量用超纯水以质量比为4:5(RJ/Water)稀释，4℃抽提过夜提取，随后离心力12000g、离心30min；离心后取上清液继续离心20min，再取上清液-18℃冷冻备用。上清中蛋白质的含量用考马斯亮蓝G-250法测定。

MRJP1定量样品的预处理

取上述上清液50μL，用40mM NH₄HCO₃溶液稀释至1mL，取900μL的稀释液(此时蛋白的含量约为2.5mg)先加入一定量的内标肽标准溶液，再加入10μL的500mM二硫苏糖醇(DTT)，56℃水浴加热30min；冷却后加入30μL的500mM碘乙酰胺(IAA)，避光室温下反应30min；然后加入100μL 0.2μg/μL的胰蛋白酶(trypsin)，温柔混匀后37℃水浴过夜反应。最后加入10μL的甲酸终止消化反应。蛋白消化液用初始流动相(ACN/H₂O＝10/90，v/v，0.1％的甲酸)稀释至2mL，然后12000g，4℃条件下离心20min,离心后的上清液过0.22μm的滤膜待液质联用进行分析。

RJ(不同产地和季节的)中蛋白含量的测定

参考国标GB 9697-2008RJ中蛋白质的测定

掺假蜂王浆的制备

分别往纯RJ中加入不同质量比例(5％和10％的掺假物)的脱脂牛奶、甜炼乳、无添加蔗糖豆奶粉、蛋清、蜂蜜和牛奶，所有掺假的样品放在-18℃冻存，直至分析解冻使用。

SDS-PAGE分析RJ及掺假RJ蛋白

RJ及掺假RJ的蛋白提取液分别稀释40倍后用SDS-PAGE分析其蛋白条带。

电泳条件：12％聚丙烯酰胺单体浓度的分离胶，5％的浓缩胶，2xSDS电泳缓冲液，电泳上样缓冲液，样品和上样缓冲液按体积比1:1稀释后取20μL点样。染色液：考马斯亮蓝染色液；脱色液：800mL的水+100mL的醋酸+100mL的乙醇。染色2个小时，脱色3个小时。电泳结果见图1。

MRJP1蛋白的鉴定

RJ蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，目标蛋白的蛋白条带切割下来做胶内酶解。胶内酶解的步骤如下：切下来的条带放入1.5mL的EP管内，用50％ACN和25mM NH₄HCO₃冲洗直至胶块变为无色透明。分别加入200μL无水ACN脱水，100μL10mM DTT溶液于56℃下还原反应1h，再加入100μL 50mM IAA溶液避光烷基化反应15min。然后水洗、乙腈脱水直至胶块完全变白。每管各加入蛋白质组学级胰蛋白酶2μg，冰上充分吸涨变透明后再加入25mM NH₄HCO₃含10％ACN的溶液覆盖，37℃水浴过夜消化反应；酶解后的上清液转移至另一个新的EP管中，加入200μL的萃取液(67％CAN，含5％TFA)于剩下的胶块中，37℃保温30min，超声15min，离心合并上清，冻干，待做LCMS质谱分析。

LC-MS/MS分析：

1)将冻干后的酶切多肽样品重新溶解于Nano-RPLC流动相A(0.1％甲酸，2％乙腈/水)、纳升反向色谱流动相中，在线Nano-RPLC液相色谱在Eksigent nanoLC-Ultra^TM2D系统(AB SCIEX)进行，溶解后的样品以2μL/min的流速上样到C18预柱上(100μm×3cm，C18,3μm,

)，然后保持流速冲洗脱盐10min。

2)分析柱是C18反相色谱柱(75μm x 15cm C18-3μm

ChromXP Eksigent)，实验所用梯度为70min内流动相B(0.1％甲酸，95％乙腈/水)由5％升高至40％。质谱采用TripleTOF 5600系统(AB SCIEX)结合纳升喷雾III离子源(AB SCIEX,USA)，喷雾电压为2.4kV，气帘气压为30PSI，雾化气压为5PSI，加热温度为150℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(IDA，Information Dependent Analysis)，一级TOF-MS单张图谱扫描时间为250ms，每次IDA循环下最多采集35个电荷为2+到5+且单秒计数大于150的二级图谱，每张二级图谱的累积时间为60ms。每次循环时间固定为2.5秒，碰撞室能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离(CID)，动态排除设置为18秒，约等于色谱半峰宽。

数据库检索分析

质谱采集到的原始wiff图谱文件，采用Paragon algorithm算法的Protein PilotSoftware v.4.5(AB SCIEX,USA)软件进行数据加工处理和检索分析，数据库为uniprot的honeybee物种专一数据库(包含15323条蛋白质序列，2015年5月下载)，检索参数设置如下：半胱氨酸烷基化为碘乙酰胺修饰、胰蛋白酶酶解、检索方式为快速检索分析，假阳性率控制为1％FDR，蛋白质检索unused score>1.3视为可信结果，肽段置信度大于95％为可靠序列。

MRJP1蛋白特异肽段序列的筛选

特定肽段的筛选原则如下：1、肽序列长短适中，8～20个AA为宜；2、没有翻译后修饰的氨基酸；3、在消化位点没有连续的R或K；4、不含有漏切的酶切位点；5、具有高度特异性与专一性；6、进行质谱分析时，有较好的灵敏度和分辨率，信号强度足够大；7、肽段有稳定的理化性质；8、不能含有易被化学修饰的氨基酸；9、重复性好；10、在原材料中的丰富度好。

筛选结果见下表。

根据LC-MS/MS分析的结果，发现肽段FFDYDFGSDER响应信号最好、最稳定，最后选择了此特异性肽段去合成标准品及其内标肽段。

MRJP1蛋白特异肽段及其内标肽段的合成

特异肽段FFDYDFGSDER，内标肽段FFDYDFGSDER*(R*双标[13C6,15N4])。

MRJP1蛋白的定量

LC-MS/MS方法如下：

色谱条件：

色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1mm x 100mm,1.7μm)；柱温：40℃；进样体积：10μL；流动相A：0.1％的甲酸/水溶液；流动相B：0.1％的甲酸/乙腈溶液；流速：0.3mL/min；梯度洗脱，洗脱程序：10min内，97％A to 60％A；0.1min内，60％A to 100％A，并100％A维持1min,然后1min内到97％A.最后柱子在97％A的条件下平衡3min。

质谱条件：

电喷雾离子源电离模式：ESI+；毛细管电压：3.5kV；锥孔电压35V；提取器电压：3V；入口透镜电压：0.3V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度380℃；脱溶剂气流量：600L/h；锥孔反吹气流：50L/h；扫描方式：多离子反应监控模式(MRM)，MRJP1特异肽标准品和特异肽内标的质谱参数见下表。

特征肽段和内标肽相应的MRM二级碎片质谱图见图3。

多肽标准品及校准曲线

分装后的1mg多肽标准品，先用500μL的乙腈溶解成悬浮液，超声溶解几秒钟，然后加入100μL的水，缓慢摇匀几秒钟，然后再加入100μL的水，再缓慢摇匀几秒钟，重复几次，直至加入水的总体积为500μL，最后再超声几分钟，至多肽完全溶解。溶解后多肽标准品的浓度为1mg/mL。

内标储备液的配制同多肽标准品的配制，内标储备液的浓度为1mg/mL。

标准曲线及内标的配制

分别精密移取一定量的MRJP1特异肽标准品储备液，用初始流动相(97％水/3％ACN，0.1％甲酸)稀释后，分别加入100ng的内标溶液，配成浓度分别为5，20，50，100，200和500ng/mL的内标加标标准曲线溶液。

校准曲线的结果见图2。

样品中MRJP1含量的计算公式

X(mg/g)—RJ样品中MRJP1的含量，m(g)—RJ样品的质量，

—RJ蛋白提取液的稀释系数，c(ng/mL)—RJ中特异性标准肽段的浓度，V(mL)—胰蛋白酶消化液的体积，及M₁/M₂—MRJP1蛋白和特异性标准肽段的摩尔质量比值。

致敏蛋白MRJP1的定量分析实验方法：

色谱条件：

色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1mm x 100mm,1.7μm)；柱温：40℃；进样体积：10μL；流动相A：0.1％的甲酸/水溶液；流动相B：0.1％的甲酸/乙腈溶液；流速：0.3mL/min；梯度洗脱，洗脱程序：10min内，97％A to 60％A；0.1min内，60％A to 100％A，并100％A维持1min,然后1min内到97％A.最后柱子在97％A的条件下平衡3min。

质谱条件：

电喷雾离子源电离模式：ESI+；毛细管电压：3.5kV；锥孔电压35V；提取器电压：3V；入口透镜电压：0.3V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度380℃；脱溶剂气流量：600L/h；锥孔反吹气流：50L/h；扫描方式：多离子反应监控模式(MRM)。

实验结果见下表(新鲜RJ和部分掺假RJ中MRJP1的含量)。

A.WE,white of the egg,5％WE represents the fresh RJ adulterated with5％white of the egg；

B.CM,condensed milk,5％CM represents the fresh RJ adulterated with5％condensed milk；

C.SM,skim milk,5％SM represents the fresh RJ adulterated with 5％skimmilk；

本实施例1中，MRJP1的检测限为LOD 7.04μg/g，定量限为LOQ 23.07μg/g，相对标准偏差RSD范围为4.6～6.3％，三个加标浓度的回收率为88.65％,90.11％和87.26％。

实施例2

LC-MS/MS方法如下：

色谱条件：

色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1mm x 100mm,1.7μm)；柱温：40℃；进样体积：10μL；流动相A：0.1％的甲酸/水溶液；流动相B：0.1％的甲酸/乙腈溶液；流速：0.3mL/min；梯度洗脱，洗脱程序：10min内，97％A to 60％A；0.1min内，60％A to 100％A，并100％A维持1min,然后1min内到97％A.最后柱子在97％A的条件下平衡3min。

质谱条件：

电喷雾离子源电离模式：ESI+；毛细管电压：4.0kV；锥孔电压25V；提取器电压：2.5V；入口透镜电压：0.2V；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度360℃；脱溶剂气流量：550L/h；锥孔反吹气流：45L/h；扫描方式：多离子反应监控模式(MRM)。

实验结果整理得，MRJP1的检测限LOD 8.01μg/g，定量限LOQ 25.02μg/g)，相对标准偏差RSD范围6.5～9.3％、回收率为85.02％

实施例3

1mg多肽标准品，先用125μL的乙腈溶解成悬浮液，然后加入500μL水。

此时标准品溶解不完全，且定量结果不准确、检测限上升、灵敏度下降。

由此可见，我方发明的针对致敏蛋白定量方法具有特异性强、灵敏度高(方法中MRJP1的检测限LOD 7.04μg/g，定量限LOQ 23.07μg/g)、重复性好(相对标准偏差RSD范围4.6～6.3％)、准确度高(三个加标浓度的回收率为88.65％,90.11％和87.26％)等优点，可以有效地对实际样品中某种致敏蛋白进行准确的定量分析。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法，其特征在于：包括，

电泳分析蜂王浆蛋白，对致敏蛋白条带预处理，液质联用方法分析鉴定，筛选致敏蛋白特异肽段；

对蜂王浆样品进行蛋白提取、酶法消化，LC-MS/MS法致敏蛋白定量测定，对蜂王浆样品的目标肽段的二级质谱图数据与所述筛选致敏蛋白特异肽段进行数据比对，观察目标肽段的二级断裂碎片及其信号强度是否完全匹配，以证明实验中筛选出的特异肽段是否符合要求；其中，

所述对致敏蛋白条带进行预处理，其是将致敏蛋白条带切下，用40～60%乙腈、NH₄HCO₃冲洗，加入无水乙腈，二硫苏糖醇于50～60℃下0 .5～2h，再加入碘乙酰胺避光反应10～20min，加入胰蛋白酶，充分吸涨后加入含有8～12%乙腈的NH₄HCO₃溶液，35～40℃下过夜反应，分离出上清后，再向残渣中加入由质量分数为65～70%的乙腈和4～6%的三氯乙酸组成的萃取液，35～40℃保温20～40min，超声10～20min，离心后合并上清液，冻干；

所述液质联用方法分析鉴定，其是将冻干的酶切样品重新溶解于Nano-RPLC流动相A、纳升反向色谱流动相中，溶解后的样品以1～3μL/min的流速上样到C18预柱上，然后保持流速冲洗脱盐8～12min；其中，所述Nano-RPLC流动相A为质量百分数0 .1%甲酸、质量百分数2%乙腈水溶液；所述C18预柱，100μm×3cm，C18，3μm，150Å；

分析柱是C18反相色谱柱，75μm ×15cm C18，3μm，150Å，所用梯度为60～80min内流动相B：由4～6%升高至35～45%；其中，所述流动相B为质量百分数0 .1%甲酸、质量百分数95%乙腈水溶液；

质谱喷雾电压为2 .0～2 .8kV，气帘气压为25～35PSI，雾化气压为4～6PSI，加热温度为140～160℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式，一级飞行时间质谱单张图谱扫描时间为240～260ms，每次模式循环下最多采集35个电荷为2+到5+且单秒计数大于150的二级图谱，每张二级图谱的累积时间为60ms，每次循环时间固定为2 .5秒，碰撞室能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离，动态排除设置为17～20s；

所述对蜂王浆样品进行蛋白提取、酶法消化，其是，将蜂王浆样品与水按质量比4:4～6混合，0～5℃抽提过夜提取，随后在离心力10000～14000g下离心20～40min，取上清液用NH₄HCO₃稀释，加入二硫苏糖醇，50～60℃水浴加热20～40min；冷却后加入碘乙酰胺，避光室温下反应20～40min，加入胰蛋白酶，混匀后35～40℃下水浴过夜，再加入甲酸，所得消化液用乙腈与水按体积比1:8～10混合液和0 .1～0 .2%的甲酸组成的初始流动相稀释，然后在离心力10000～14000g，0～4℃下离心20～40min，过滤膜待用；

所述LC-MS/MS法，其色谱条件包括，色谱柱，C18柱，2 .1mm×100mm ,1 .7μm；柱温，35～45℃； 进样体积，8～12μL； 流动相A，0 .1～0 .2wt%甲酸水溶液；流动相B，0 .1～0.2wt%甲酸乙腈溶液；流速，0 .2～0 .4mL/min；梯度洗脱，洗脱程序为10min内，95～98%流动相A到58～62%流动相A；0 .1min内，55～65%流动相A到100%流动相A，并100%流动相A维持1min ,然后1min内到97%流动相A，最后柱子在97%流动相A的条件下平衡2～4min；

所述LC-MS/MS法，其质谱条件包括，电喷雾离子源电离模式，ESI+；毛细管电压，3 .0～4 .0kV；锥孔电压，30～40V；提取器电压，2 .5～3 .5V；入口透镜电压，0 .2～0 .4V；离子源温度，110～120℃； 脱溶剂气温度，360～380℃；

脱溶剂气流量，550～650L/h；锥孔反吹气流，45～50L/h；扫描方式，多离子反应监控模式。

2.根据权利要求1所述建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法，其特征在于：所述电泳分析蜂王浆蛋白，其电泳条件包括，

10～12%聚丙烯酰胺单体浓度的分离胶，4～6%的浓缩胶，

缓冲液，2xSDS电泳缓冲液；

染色液，考马斯亮蓝染色液；

脱色液，由水、醋酸、乙醇组成，按wt%计，水：醋酸：乙醇为7～9:1:1；

样品和上样缓冲液按等体积稀释后点样，染色2～3h，脱色3～4h。

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