CN105738550A - 食品中潜在过敏原的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

食品中潜在过敏原的筛选方法，是将食品蛋白与体外模拟消化液混合后，以SDS?PAGE电泳分析不同消化时间条件下的消化产物；选取耐酶解条带进行胶内酶解，所得肽段采用液相色谱?质谱联用鉴定分析，并结合蛋白质数据库和过敏原数据库，确定致敏蛋白质种类及其过敏性。本发明的方法无需预先纯化目标蛋白质，操作简单，结果显著，且可信度高，重复性强。该方法不仅能够检测食物的过敏原，还能够评估耐酶解蛋白质的过敏性。方法简便易行，可以同时检测多个样品，易于实现高通量筛选，符合食品检测领域准确高效的需求。

Description

食品中潜在过敏原的筛选方法
技术领域
本发明涉及食品中过敏原评估检测方法，属检验检疫领域。
背景技术
食品过敏指的是人体免疫系统对食品中的某种物质产生了免疫反应，包括抗体的释放，而这些抗体又引起人体内某些化学物质释放，例如组胺会引起皮肤发痒、流鼻涕、咳嗽、呼吸困难，甚至导致死亡(张瑞灏等，中国检验检疫，2009，3:22)。除牛奶、蛋类以及坚果等常见的陆地食物过敏原外，鱼类等水产品过敏原同样占据了非常大的比重。在发达国家，对鱼类过敏的人群约占总人群的0.1～0.3％(Zhang W.,etc,Food Chemistry 2015,174:547.)。在我国，水产品和鸡蛋、牛奶等都是引起食物过敏的主要原因，在对在校大学生食物过敏的流行病学研究表明，鱼类是最主要的致敏食物之一，占过敏患者总数的18.2％。(吕相征等，中国食品卫生杂志2005,17:119)。然而现有技术中明确鉴定的过敏原数量非常有限。以鱼类过敏原的鉴定为例，目前已发现并鉴定的鱼类过敏原只有如小清蛋白、鱼卵蛋白、胶原蛋白以及肌钙蛋白等数种机体表达极为丰富的组织蛋白，除此以外，可能还存在大量的表达丰度低，但活性非常强烈的鱼类过敏原，这极大地增加了鱼类过敏原检测、诊断以及治疗的难度(Bredehorse R.,etc,Journal of Chromatography B 2001,756:33.)。目前，确定鱼类食品中潜在蛋白质过敏原还没有成熟可靠的方法。2001年3月，联合国粮农组织(FAO)与世界卫生组织(WHO)修订并提出了一种“树状评价模式”对目标蛋白质进行过敏原性评价(FAO/WHO.Food and Agriculture Organization of the United Nations(FAO),Rome,Italy 2001,27)。FAO/WHO“评估树”从新蛋白一级结构氨基酸序列开始分析，确定其与已知过敏原的序列同源性，如果这样的评价不能提供潜在过敏性的证据，则进一步对该蛋白质进行特异血清和消化稳定性实验。但是由于该法工作量较大(需要提纯一定量的目标蛋白质，测定其氨基酸序列)，而且已知的过敏原大约只有500多种，限制了该方法的准确性及其应用。此外，利用已知过敏病人血清进行体外检测，由于过敏病例血清样品数目有限，所得到的结论不完全可靠。 同样，其它诸如鸡蛋、牛奶、坚果等食品中的过敏原筛选检测也存在同样的问题。
Astwood等人发现食品中的大部分过敏原具有含量高、对酶和化学降解具有抗性等特点，在体内胃液酸性环境中很难被胃蛋白酶水解(Astwood J.D.,ect,Nature Biotechnology 1996,14:1269)该发现为食品潜在过敏原的筛选提供了一个有益的思路，本发明即基于此。
发明内容
本发明旨在提供一种简单易行的检测食品食品潜在过敏原的方法，以提高对食品安全性的评估效率，达到对食品安全控制的作用。
为了实现上述目的，本发明提供一种食品中潜在过敏原的筛选方法，是将食品蛋白与体外模拟消化液混合后，以SDS-PAGE电泳分析不同消化时间条件下的消化产物；选取耐酶解条带进行胶内酶解，所得肽段采用液相色谱-质谱联用鉴定分析，并结合蛋白质数据库和过敏原数据库，确定致敏蛋白质种类及其过敏性。
本发明的方法无需预先纯化目标蛋白质，操作简单，结果显著，且可信度高，重复性强。该方法不仅能够检测食物的过敏原，还能够评估耐酶解蛋白质的过敏性。方法简便易行，可以同时检测多个样品，易于实现高通量筛选，符合食品检测领域准确高效的需求。
附图说明
本发明附图3幅，分别是：
图1是大黄鱼蛋白质的模拟胃液消化产物的SDS-PAGE电泳图。
图2是鲅鱼蛋白质的模拟胃液消化产物的SDS-PAGE电泳图。
图3是鸡蛋清蛋白质的模拟胃液消化产物的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
本发明所述的食品中潜在过敏原的筛选方法，是将食品蛋白与体外模拟消化液混合后，以SDS-PAGE电泳分析不同消化时间条件下的消化产物；选取耐酶解条带进行胶内酶解，所得肽段采用液相色谱-质谱联用鉴定分析，并结合蛋白质数据库和过敏原数据库，确定致敏蛋白质种类及其过敏性。
其中，所述的体外模拟消化液优选体外模拟胃液或体外模拟肠液。在食品蛋 白与体外模拟消化液混合过程中，优选控制所述的体外模拟消化液中的酶与食品蛋白的质量比是1:40～60。
再者，其中所述的食品蛋白是采用等电点沉淀法、缓冲盐提取法或有机溶剂提取法从食物样品中提取，并经冷冻干燥处理的混合蛋白样品。
另一方面，本发明实施的要素之一，有赖于对耐酶解条带的判断。现有技术中有很多关于此的判断标准可供参考。本发明中所述的耐酶解条带为相对耐酶解的蛋白质条带，即在一定酶解条件下，大部分蛋白质被酶解，少数几种酶解速率较慢或不被酶解的蛋白质条带为耐酶解条带。这些耐酶解条带具体到不同的检测对象是有所差异的。具体实施方式中，鱼源性待测样品，尤其是含大黄鱼成分的待测样品中，耐酶解条带可确定为47kD，42kD和12kD条带。
进一步的具体实施方式中，本发明所述的方法中的致敏蛋白质种类及其过敏性的判断标准包括：待测蛋白质的氨基酸序列采用生物信息学的方法与已知过敏原进行比对：如果待测蛋白质至少6个连续的氨基酸与已知过敏原氨基酸序列相同；或长度至少为80个氨基酸的序列与过敏原蛋白质的相似性在35％以上，该判定该待测蛋白质具有潜在过敏性。
作为本发明的方法的优选实施方式，其中所述的食品是含鱼源性食品蛋白的食品，尤其是含有大黄鱼成分的食品。应用于该类样品的潜在过敏原筛选方法中，所述的体外模拟消化液优选含有胃蛋白酶的体外模拟胃液，其中胃蛋白酶与食品蛋白的质量比是1:50。
再进一步，上述鱼源性食品中潜在过敏原的筛选方法包括如下步骤：
(1)提取食品蛋白；
(2)将步骤1所提取的食品蛋白与含有胃蛋白酶的体外模拟胃液混合，使胃蛋白酶与食品蛋白的质量比是1:50；
(3)消化反应在37℃条件下震荡进行，分别在消化反应0、2、10、30、60、90和120分钟，进行SDS-PAGE电泳分析；
(4)按照反应120分钟时的SDS-PAGE电泳分析结果，选择47kD，42kD和12kD条带的蛋白质条带为耐酶解条带；
(5)对选定的耐酶解条带进行胶内酶解：首先向蛋白条带中加入脱色液振荡脱色，缩干胶条，继而加入DTT溶液，振荡反应；然后加入IAA溶液，室温黑 暗条件下反应后，加入胰蛋白酶溶液酶解；上清液真空干燥，所得产物复溶后待分析；
(6)经步骤(5)酶解后的肽段以液相色谱-质谱进行分析：
采用纳升级高效液相色谱-质谱串联，分析在LTQ-Orbitrap(Thermo，SandyJose，SA)质谱系统中进行；其中，液相色谱C18AQ，3μm，12cm，分流后的流速200nl/min；离子传输毛细管的温度设置为200℃，电喷雾电压设置为1.8kV；
采用数据依赖模式(data-dependent mode，DDA)进行数据采集，每个循环包括1个MS全扫描和10个MS/MS质谱扫描，MS全扫描在Orbitrap中采集，二级质谱采集在LTQ中进行；
所收集的质谱文件通过Maxquant在蛋白质库中进行检索；
(7)耐酶解蛋白质与已知过敏原氨基酸序列比对在NCBI/blast数据库中进行，根据比对结果判定致敏蛋白质种类及其过敏性。
以下具体实施例是为对本发明作进一步的说明，不应理解为对本发明任意形式的限定。
实施例1
1、大黄花鱼蛋白质的提取
取洗净的大黄鱼肌肉300g，用搅拌机将大黄花鱼肌肉绞碎，再用均质机将绞碎的鱼肉进行均质，加入7倍体积的水后，用盐酸将PH值调至2.4左右，使蛋白质大部分溶解，在5000r/min条件下，离心15min，收集上清液。再用氢氧化钠溶液将上清液的pH值调至4.75左右，使蛋白质沉淀，在5000r/min下，离心15min，收集蛋白质沉淀，将其冷冻干燥以备用。
2.体外模拟胃液消化
模拟胃液：称取0.1gNaCl于50ml蒸馏水中，用HCl调pH至1.2，加入胃蛋白酶，使胃蛋白酶的质量浓度为150ug/ml。
同样方法制备对照溶液，与模拟胃液区别在于仅不含胃蛋白酶。
取离心管，其中一支加入模拟胃液，另一支加入同体积对照溶液，分别设置平行样品。在37℃条件下预热15分钟后，将所提取的大黄花鱼蛋白质加入上述 离心管中混合均匀，使胃蛋白酶与大黄鱼蛋白的质量比例为1:50，总反应体系为1ml。消化反应在37℃条件下震荡进行，分别在消化反应0、2、10、30、60、90和120分钟时取出100ul反应液于离心管中，迅速与30ul 200mM Na2CO3溶液混合均匀，使其达到碱性，终止反应，并迅速放入冰柜中。其中0分钟样品是将含有胃蛋白酶的模拟胃液先与Na2CO3中和终止反应，再加入同等量的大黄鱼蛋白。
3.SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量及抗酶解性能
采用12.5％的分离胶对步骤2不同时间点取样的消化后产物进行分析，结果如附图1所示。
根据附图1可见：模拟胃液酶解120min后，仍然存在47kD，42kD和12kD条带的蛋白质。在0min时，42kD条带存在，47kD和12kD条带不存在。47kD，42kD和12kD三条条带的蛋白质在120min以内随着酶解时间的增加浓度逐渐增加，这几个条带是相对耐酶解的蛋白质或肽段。由此可见大黄鱼肌肉中耐酶解蛋白质是分子量为47kD，42kD和12kD的蛋白质。
对上述确定的大黄鱼的耐酶解蛋白质条带进行胶内酶解，采用液相色谱-质谱联用进行分析，结合蛋白质数据库进行鉴定。参数条件包括：纳升级高效液相色谱-串联质谱分析在LTQ-Orbitrap(Thermo，SandyJose，SA)质谱系统中进行。其中，液相色谱C18AQ(3μm，12cm)分流后的流速约为200nl/min；离子传输毛细管的温度设置为200℃，电喷雾电压设置为1.8kV。采用数据依赖模式(data-dependent mode，DDA)进行数据采集，每个循环包括1个MS全扫描和10个MS/MS质谱扫描，MS全扫描在Orbitrap中采集，扫描范围为400-2000Da，分辨率为60000.二级质谱采集在LTQ中进行，采用CID碎裂方式，归一化碰撞能量为35％。所收集的质谱文件通过Maxquant(version 1.3.0.5)在蛋白质库中进行检索。结果如表1所示：
表1.大黄鱼蛋白质耐酶解条带通用液相色谱-质谱联用鉴定结果
采用NCBI/blast数据库将鉴定到的大黄鱼蛋白质与已知过敏原或表位序列进行比对，得到如下结果：
1.大黄鱼中烯醇化酶与已知武昌鱼(Megalobrama amblycephala)中过敏原烯醇化酶同源性为95％(Identities 410/433(95％),E value0.0)，说明该蛋白质过敏性较高。
2.大黄鱼中肌酸激酶M与已知武昌鱼中过敏原肌酸激酶同源性为89％(Identities 335/377(89％)，E value0.0)，说明该蛋白质过敏性较高。
3.大黄鱼中原肌球蛋白α-1与已知过敏原pen a 1同源性为55％(Identities 145/265(55％)，E value2e-75)。该蛋白与pen a 1三个已鉴定的表位都有超过6个连续的氨基酸序列相同，分别为：AADESER，AEEADRKY和FAERSV，说明该蛋白质过敏性较高。
4.大黄鱼中小清蛋白与鲤鱼已知过敏原小清蛋白质同源性为79％(Identities84/107(79％)，E value1e-51)。该蛋白与Gad c1已鉴定的1个表位(AGDSDGDGK，Elsay,Apold,1983)氨基酸序列完全一致相同。与scoj 1过敏原表位中8个连续氨基酸序列(FFKACGLS)一致说明该蛋白质过敏性较高。
实施例2：
采用与实施例1相似的方法，提取鲅鱼蛋白质并进行消化。经过模拟胃液消化后，发现两条耐酶解蛋白质条带，分子量位于35kDa和45kDa左右，如附图2所示。
对鲅鱼的耐酶解蛋白质条带进行胶内酶解，采用液相色谱-质谱联用进行分析，结合蛋白质数据库进行鉴定。结果如表2所示：
表2：鲅鱼蛋白质耐酶解条带通用液相色谱-质谱联用鉴定结果
采用NCBI/blast数据库将鉴定到的鲅鱼蛋白质与已知过敏原或表位序列进行比对，得到如下结果：
1.鲅鱼中烯醇化酶与已知武昌鱼(Megalobrama amblycephala)中过敏原烯醇化酶同源性为83％(Identities 357/431(83％),E value0.0)，说明该蛋白质过敏性较高。
2.鲅鱼中原肌球蛋白与已知过敏原pen a 1同源性为56％(Identities 148/264(56％)，E value5e-82)。该蛋白与pen a 1三个已鉴定的表位都有超过6个连续的氨基酸序列相同，分别为：AADESER，AEEADRKY和FAERSV，说明该蛋白质过敏性较高。
实施例3
采用与实施例1的方法，筛选鸡蛋清蛋白质的过敏原。
SDS-PAGE电泳分析不同消化时间条件下的消化产物结果如附图3所示。
耐酶解条带胶内酶解后所得肽段的液相色谱-质谱联用鉴定分析结果如表3。
表3.鸡蛋清蛋白质耐酶解条带通用液相色谱-质谱联用鉴定结果
蛋白质名称 序列覆盖度[％] 分子量[kDa] 基因名
条带1 卵白蛋白 72.3 45.8 SERPINB14
鸡蛋清中耐酶解蛋白质鉴定为卵白蛋白，为鸡蛋中已报道的主要过敏原。综上，采用体外耐模拟胃液消化得到的耐酶解蛋白质，都具有较高的过敏性，所以该方法切实可行。

Claims (8)

1.食品中潜在过敏原的筛选方法，是将食品蛋白与体外模拟消化液混合后，以SDS-PAGE电泳分析不同消化时间条件下的消化产物；选取耐酶解条带进行胶内酶解，所得肽段采用液相色谱-质谱联用鉴定分析，并结合蛋白质数据库和过敏原数据库，确定致敏蛋白质种类及其过敏性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的体外模拟消化液是体外模拟胃液或体外模拟肠液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的体外模拟消化液中的酶与食品蛋白的质量比是1:40～60。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的致敏蛋白质种类及其过敏性的判断标准包括：待测蛋白质的氨基酸序列采用生物信息学的方法与已知过敏原进行比对：如果待测蛋白质至少6个连续的氨基酸与已知过敏原氨基酸序列相同；或长度至少为80个氨基酸的序列与过敏原蛋白质的相似性在35％以上，该判定该待测蛋白质具有潜在过敏性。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的食品蛋白是采用等电点沉淀法、缓冲盐提取法或有机溶剂提取法从食物样品中提取，并经冷冻干燥处理的混合蛋白样品。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的食品蛋白是鱼源性食品蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的体外模拟消化液是含有胃蛋白酶的体外模拟胃液，胃蛋白酶与食品蛋白的质量比是1:50。
8.鱼源性食品中潜在过敏原的筛选方法，包括如下步骤：
(1)提取食品蛋白；
(2)将步骤1所提取的食品蛋白与含有胃蛋白酶的体外模拟胃液混合，使胃蛋白酶与食品蛋白的质量比是1:50；
(3)消化反应在37℃条件下震荡进行，分别在消化反应0、2、10、30、60、90和120分钟，进行SDS-PAGE电泳分析；
(4)按照反应120分钟时的SDS-PAGE电泳分析结果，选择47kD，42kD和12kD条带的蛋白质条带为耐酶解条带；
(5)对选定的耐酶解条带进行胶内酶解：首先向蛋白条带中加入脱色液振荡脱色，缩干胶条，继而加入DTT溶液，振荡反应；然后加入IAA溶液，室温黑暗条件下反应后，加入胰蛋白酶溶液酶解；上清液真空干燥，所得产物复溶后待分析；
(6)经步骤(5)酶解后的肽段以液相色谱-质谱进行分析：
液相色谱C18AQ，3μm，12cm，分流后的流速200nl/min；离子传输毛细管的温度设置为200℃，电喷雾电压设置为1.8kV；
数据采集每个循环包括1个MS全扫描和10个MS/MS质谱扫描；
(7)耐酶解蛋白质与已知过敏原氨基酸序列比对在NCBI/blast数据库中进行，根据比对结果判定致敏蛋白质种类及其过敏性。
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