CN104987363A - 花生过敏源蛋白的特征肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花生过敏源蛋白的特征肽及其应用，该特征肽的氨基酸序列为DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR。本发明选择花生中含量最高的过敏源Arah1和Arah2作为候选标记物，筛选出各自的特征肽，并设计合成对应的内标物，采用高效液相色谱与质谱联用的分析技术，计算获得食物中花生过敏源蛋白的含量，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。

Description

花生过敏源蛋白的特征肽及其应用

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种花生过敏源蛋白的特征肽及其应用。

背景技术

花生也是一种常见的过敏源食物，由它引起的过敏反应占食物过敏的1％～20％。目前，公认的花生致敏蛋白有13种。其中，Ara h1和Ara h2是主要花生过敏源，分别约占花生蛋白总量的12～16％和5.9-9.3％，都能被90％以上的花生过敏患者血清所识别。Ara h1在天然状态下主要是以单聚体和三聚体形式存在的水溶性蛋白，包含23个线性IgE结合位点。Ara h2存在两种异构体，包含10个线性IgE结合位点。Ara h2稳定性高、耐酶解，主要原因是Ara h2含有大量二硫键，用以保持其结构稳定。Ara h2具有典型的胰蛋白酶抑制剂的结构，并且经过烘烤处理后，Ara h2蛋白的抑制剂活性被显著提高。

目前，检测食物中花生过敏源成分主要有2种方法。一种是基于DNA检测的方法，如聚合酶链式反应(PCR)。该方法灵敏度高，特异性强，但是由于不直接检测致敏蛋白，故无法进行定量分析。此外，现代食品工业可以将蛋白质和DNA完全分离开来，所以PCR法有假阴性的风险。另外一种基于蛋白的检测方法，如酶联免疫法(ELISA)。此方法也具有高灵敏度、高特异性等特点，但该应用方法在热加工食品中的检测结果通常会低于真实值，主要因为热处理会使蛋白质变性，降低蛋白质溶解度，同时改变蛋白质表面位点，使其不易被抗体正确识别。此外，ELISA法采用抗原抗体技术不可避免会产生交叉反应，导致假阳性现象，也会影响最终检测结果。

现阶段有人尝试将蛋白质组学与液质联用技术运用到对蛋白质的定性定量分析中。Heick等(Heick，J.，M.Fischer，and B.First screening methodfor the simultaneous detection ofseven allergens by liquid chromatography mass spectrometry.Journal of Chromatography A，2011.1218(7)：p.938-943)和Shefcheck等人(Shefcheck，K.J.and S.M.Musser，Confirmation of theallergenic peanut protein，Ara h1，in a model food matrix using liquid chromatography/tandemmass spectrometry(LC/MS/MS).Journal of agricultural and food chemistry，2004.52(10)：p.2785-2790)先后建立应用酶解技术和液质联用技术检测花生过敏蛋白的方法。Lutter P等(Lutter，P.，V.Parisod，and H.Weymuth，Development and validation of a method for thequantiftcation of milk proteins in food products based on liquid chromatography with massspectrometric detection.Journal of AOAC International，2011.94(4)：p.1043-1059.)在检测过程中，在预处理结束后加入了稳定同位素标记的特征肽作为内标，以校正基质效应对质谱离子化带来的影响。Zhang等(Zhang，J.，et al.，Determination of bovine lactoferrin in dairy products byultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry based on trypticsignature peptides employing an isotope-labeled winged peptide as internal standard.Analyticachimica acta，2014.829：p.33-39.)和Chen等(Chen，Q.，et al.，Quantification of bovine β-caseinallergen in baked foodstuffs based on ultra-performance liquid chromatography with tandem massspectrometry.Food Additives&Contaminants：Part A，2015.32(1)：p.25-34)人在稳定同位素标记的特征肽的基础上，根据蛋白质原有序列，向氮端和碳端各延长了6-8个氨基酸。该多肽在酶解之前加入样品中，可在酶的作用下形成同位素标记的特征肽，所以它除了能对离子化过程进行校正之外，还能校正基质对酶切过程造成的干扰，使建立的方法较之前的方法更加准确可靠。

发明内容

本发明提供了一种花生过敏源蛋白的特征肽、内标物和试剂盒以及质谱联用检测花生过敏源蛋白的方法，该方法具有较高的灵敏度、回收率和精密度。

一种花生过敏源蛋白的特征肽，氨基酸序列为DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR。

上述特征肽分别从花生致敏蛋白Ara h1和Ara h2酶解后产生的多肽中筛选获得，其具有高度特异性、良好的稳定性和较高的灵敏度。

针对上述花生过敏源蛋白的特征肽，进行同位素标记，获得同位素标记的特征肽(简称：同位素特征肽)，其氨基酸序列为DL*AFPGSGEQV*EK或NL*PQQCGL*R，其中L*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

本发明还提供了一种用于检测花生过敏源蛋白的内标物，氨基酸序列为IEKQAKDL*AFPGSGEQV*EKLIKNQ或QFKRELRNL*PQQCGL*RAPQRCD，其中L*和V*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

本发明还公开了一种液质联用检测花生过敏源蛋白的试剂盒，包括特征肽和内标物，所述特征肽的氨基酸序列为DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR，所述内标物的氨基酸序列为IEKQAKDL*AFPGSGEQV*EKLIKNQ或QFKRELRNL*PQQCGL*RAPQRCD，其中L*和V*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

上述试剂盒中还包括：同位素特征肽、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、胰蛋白酶、碳酸氢铵和甲酸。

上述试剂盒可用于检测花生过敏源蛋白，尤其适合检测热加工食品中的花生过敏源蛋白。

本发明还提供了一种液质联用检测花生过敏源蛋白的方法，包括：

(1)配制系列含花生过敏原蛋白的特征肽和同位素标记特征肽的标准溶液，利用液质联用进行分离检测，计算特征肽和同位素标记特征肽的峰面积比，线性回归得到方程Y＝kX+b，其中Y为特征肽和同位素标记特征肽的峰面积比，X为特征肽的浓度；

所述特征肽的氨基酸序列为DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR，所述同位素标记特征肽的氨基酸序列为DL*AFPGSGEQV*EK或NL*PQQCGL*R；

(2)取待测样品，与内标物混合溶于水后进行酶解，在相同条件下对酶解液利用液质联用进行分离检测，计算特征肽和同位素标记特征肽的峰面积比，根据所述方程得到酶解液中所述特征肽的浓度，最后计算得到样品中花生过敏源蛋白的含量。

上述方法采用的是内标法，具体计算过程和原理如下：

将花生过敏源蛋白的特征肽和经同位素标记的花生过敏源蛋白的特征肽配制成系列浓度的标准工作曲线溶液，并通过液质联用的分析方法进行分离检测，制作标准工作曲线，根据得到的标准工作曲线中花生过敏源蛋白的特征肽和同位素标记特征肽的峰面积比与对应的溶液浓度，进行线性回归，得到线性方程Y＝kX+b，其中，Y为特征肽和同位素标记特征肽的峰面积比，X为特征肽的摩尔浓度，单位为nM；k为线性方程的斜率；b为线性方程的截距；

酶解后的酶解液采用上述相同条件的液质联用的分析方法进行分离检测，获得酶解液中特征肽和同位素标记特征肽峰面积比，然后代入上述线性方程，即可计算得到样液中花生过敏源蛋白的特征肽的摩尔浓度；最后，将该浓度代入含量计算公式C_x＝(n_a×M_r×f₁×f₂)/W，即可得到被测样品中花生过敏源蛋白的特征肽的含量C_x(其中，C_x为花生致敏蛋白浓度，单位为mg/100g；n_a为由线性方程获得的样液中花生过敏源蛋白的特征肽的浓度，单位为nM；M_r为花生致敏蛋白的分子量，单位为g/mol；f₁为预处理过程中的稀释倍数；f₂：为不同单位间的换算系数；W为样品称样量，单位为g)。

酶解前，添加用于使蛋白质完全变性的试剂以及可水解二硫键破坏蛋白质空间结构的试剂；本发明中添加了碘乙酰胺(IAA)和二硫苏糖醇(DTT)。

花生致敏蛋白Ara h2具有典型的胰蛋白酶抑制剂的结构，通过水解二硫键破坏该蛋白质空间结构可以降低其胰蛋白酶抑制剂的活性，提高酶解效率；而二硫苏糖醇(DTT)可水解二硫键，实验发现，适宜浓度的DTT可提高酶切效率，作为优选，所述二硫苏糖醇的浓度为500～700mmol/L。碘乙酰胺(IAA)可使蛋白质全部变性，利于提高酶解效率，作为优选，所述碘乙酰胺的浓度为500～700mmol/L。

所述酶解采用的是胰蛋白酶。作为优选，所述酶解的温度为37℃，时间为5h。

步骤(1)和(2)中，所述液质联用的液相色谱条件为：色谱柱：Acquity BEH 300 C18柱(1.7μm，2.1×100mm)；柱温：40℃；进样体积：5μL；流动相A：0.1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/乙腈；流速0.3mL/min；洗脱程序：流动相B起始浓度为7％，8min内线性上升为25％，9min下降至7％并保持3分钟。

步骤(1)和(2)中，所述液质联用的质谱分析条件为：电喷雾离子源电离模式：ESI+；毛细管电压：3.5kV；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：800L/min；锥孔反吹气流量：150L/h；碰撞室压力：7.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.77V；高端分辨率1：15.09V；离子能量1：0.1；低端分辨率2：2.80V；高端分辨率2：14.79V；离子能量2：0.6；离子源温度：150℃；提取器电压：3.0V；入口透镜电压：0.5V；出口电压：0.5V；碰撞梯度：4.0。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明选择花生中含量最高的过敏源Ara h1和Ara h2作为候选标记物，筛选出各自的特征肽，并设计合成对应的内标物，采用高效液相色谱与质谱联用的分析技术，计算获得食物中花生过敏源蛋白的含量，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度；

(2)本发明通过优化样品预处理方案，消除了Ara h2的胰蛋白酶抑制剂活性，提高了酶解效率。

附图说明

图1为实施例1中候选特征肽的离子色谱图；

图2为实施例2中不同DTT浓度对酶切效率的影响；

图3为实施例4中不同烘焙时间下花生致敏蛋白的测得量；

图4为实施例5中采用本发明方法与ELISA法回收率结果的比较。

具体实施方式

下面结合具体实施方式和附图说明对本发明进行详细阐述。

本发明采用的仪器设备、化学试剂，具体如下：

超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF，Waters公司，美国)；超高效液相色谱串联四级杆质谱(UPLC-TQ-MS，Waters公司，美国)；刀式混和研磨仪GM200(Retsch公司，德国)；球磨仪MM400(Retsch公司，德国)；L-8900全自动氨基酸分析仪(日立Hitachi公司，日本)。

碳酸氢铵(NH₄HCO₃)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)购自美国Sigma公司。乙腈、甲酸购自德国Merck公司。所有试剂均为分析纯或色谱纯。

特异性肽段标准品DLAFPGSGEQVEK、NLPQQCGLR由中国上海强耀生物科技有限公司合成，纯度均大于95％。同位素标记的特异性肽段DL*AFPGSGEQV*EK、NL*PQQCGL*R由中国上海强耀生物科技有限公司合成公司合成，纯度大于98％。(同位素标记特异性肽段内标物，简称内标物)IEKQAKDL*AFPGSGEQV*EKLIKNQQFKRELRNL*PQQCGL*RAPQRCD(*号标记为碳、氮全同位素标记的氨基酸)由中国上海强耀生物科技有限公司合成，纯度均大于90％。超纯水由Milli-Q超纯水净化系统制备获得。

样品的预处理方法如下(注：该方法实际为经条件优化后的最佳预处理方法，其中DDT的浓度为实施例2实验结果中显示的最佳浓度；实施例1～8中提到的上文所述的预处理方法均为下列内容)：

准确称取0.1g研磨均匀的花生样品，加1mL超纯水以及3颗粒径为2mm的小铁球，用球磨仪以25次/s的频率振荡提取10min，制得花生样品悬浊液。将花生样品悬浊液1∶50比例用水稀释后，取10μL样品稀释液，加825μL超纯水、10μL同位素内标和10μL的600μMDTT，80℃水浴加热15min。然后加入30μL的600μM IAA，室温下暗处静置30min。接着加入100μL 500μM碳酸氢铵溶液和10μL的400μg/mL胰蛋白酶，在37℃水浴中酶切5h。最后加入5μL的甲酸终止反应。之后溶液过0.22μm滤膜，用于液质联用分析。

液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF)参数，如下：

色谱条件：色谱柱：Acquity BEH 300 C18柱(1.7μm，2.1×100mm)；柱温：40℃；进样体积：5μL；流动相A：0.1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/乙腈；流速0.3mL/min；洗脱程序：流动相B起始浓度为3％，20min内流动相B线性上升为20％，21min内流动相B下降为3％，并且保持5分钟。

质谱条件：TOF仪器：Synapt G2 HDMS(Waters，美国)；离子化模式：ESI+；数据采集方式：MS^E；毛细管电压：3kV；样品锥孔电压：25V；提取锥孔电压：4V；源温度：100℃；脱溶剂温度：400℃；锥孔气流量：30L/h；脱溶剂气流量：800L/h；循环碰撞能量：15-35V；锁定质量参考物质：亮氨酸脑啡肽。

数据分析软件采用ProteinLynx Global Server version 2.5(PLGS)，其中详细设置如下：模式：electrospray-MS^E；锁定质量1，556.2771Da；每个多肽子离子数：2；每个蛋白质子离子数L5；允许漏切数量：1；固定修饰：carbamdomethyl C；可变修饰：oxidation M；所用的数据库来自www.uniprot.org；Ara h1和Ara h2的录入号分别为P43238和Q6PSU2。

液相色谱串联三重四级杆质谱(UPLC-TQ-MS，简称：UPLC-MS)参数，如下：

液相色谱条件与上述UPLC-Q-TOF的内容一致，但洗脱梯度程序为：流动相B起始浓度为7％；8min内线性上升为25％；9min下降至7％并保持3分钟。

质谱条件：电喷雾离子源电离模式：ESI+；毛细管电压：3.5kV；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：800L/min；锥孔反吹气流量：150L/h；碰撞室压力：7.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.77V；高端分辨率1：15.09V；离子能量1：0.1；低端分辨率2：2.80V；高端分辨率2：14.79V；离子能量2：0.6；离子源温度：150℃；提取器电压：3.0V；入口透镜电压：0.5V；出口电压：0.5V；碰撞梯度：4.0。

实施例1特征肽的筛选和确定

已知的花生致敏蛋白有13种，其中含量最高的两种分别为Ara h1和Ara h2，分别约占花生蛋白总量的12～16％和5.9-9.3％。与上述两种蛋白质相比，其余致敏蛋白在花生中的含量较小，在含有低浓度水平花生蛋白质的样品中，可能无法提供令人满意的灵敏度，故本发明在Ara h1和Ara h2中选择合适的多肽作为标记物，而不对其余致敏蛋白做进一步考察。

根据Uniprot所提供的PeptideMass功能模拟Trypsin酶解结果显示，Ara h1和Ara h2理论上可分别形成89个和23个酶切产物。根据上文所提供UPLC-Q-ToF检测方法分别可测得22条来自Ara h1和11条来自Ara h2的酶解多肽，多肽覆盖率分别为61％与52％(详见表1)。

表1：UPLC-Q-ToF测得的多肽

根据Defernez等人(Defernez，M.，et al.，Management of food allergens：from threshold dosesto ahalysis in foods，Food Standards Agency Project T07062，final report.2013)和Taylor等人(Taylor，S.L.，et al.，Threshold dose for peanut：risk characterization based upon diagnostic oralchallenge of a series of 286 peanut-allergic individuals.Food and chemical toxicology，2010.48(3)：p.814-819)对食品过敏源致敏剂量阈值的研究表明，花生的10％致敏剂量(objective symptomED10 values)为10mg左右，按照过敏源污染食品暴露量100g计算，本发明检测方法的灵敏度要求约在100mg/kg左右。

鉴于高的灵敏度要求，本发明不再针对响应值低的多肽进行详细研究，只针对每个蛋白质选择信号量最强的四个多肽作为候选特征肽进行下一步研究。所选择多肽的MRM参数见表2；其定量子离子色谱图见图1。

表2中列举了致敏蛋白Ara h1和Ara h2所有的候选特征肽标准品和同位素特征肽的质谱参数。

表2：MRM参数

将上述8条多肽利用Uniprot所提供的BLAST功能进行数据库比对，以验证其特异性。其中，多肽CQSQLER和QQEQQFK的氨基酸数量小于8个，无法直接使用BLAST功能进行比对，故在该序列前加入K和R分别进行比对。本发明所选择的多肽序列无法在数据库中其他蛋白质中测得。然而，数据库中包含的已知蛋白质序列无法覆盖所有食品基质中的蛋白质，故本文采用in vitro方法测试上述多肽的特异性。

花生过敏源常污染烘焙类食品以及巧克力类食品，所以本文选择了该类食品的几种常见原料，例如面粉、可可粉、杏仁、榛子、牛奶、鸡蛋，根据上文所述的样品预处理以及UPLC-TQ-MS分析方法(具体内容均如上文所述)。

检测结果表明，本实施例所选择的8条多肽无法在上述食品基质中测得。所以，从in silico以及in vitro的实验中都证明，本实施例所选择的候选多肽具有高度特异性。

多肽易受到基质影响，造成信号抑制或信号增益。本文应用花生悬浊液与水配制不同浓度的悬浊液，并且酶解后进样分析，应用外标法建立标准曲线。在这些酶解液中，不但候选特异多肽的浓度有所变化，而且基质浓度亦随着特异多肽的浓度有所变化。

表3罗列的8条标准曲线中，CQSQLER和CDLEVESGGR不能用线性，而只能以二项式方式拟合，在较高的基质浓度下，其响应值受到抑制。由于这两个多肽的基质抑制作用，可能会对后续检测工作带来不可预期的问题，所以不适宜作为候选特征肽。在剩余的6条多肽里，除了QQEQQFK的响应值过低导致其相关因子仅为0.9787外，其余的多肽相关因子均大于0.99，均可作为蛋白质的特征肽使用。

表3：候选特征肽外标法标准曲线

鉴于每个蛋白质只需要一条特征肽进行定量检测，所以本文选择灵敏度最高的DLAFPGSGEQVEK和NLPQQCGLR分别作为Ara h1和Ara h2的特征肽进行下一步研究。由于样品受到基质作用的影响，导致酶解过程和检测过程的不稳定性增加；同时也会导致被测物质的响应信号受到抑制，使最终测得值低于真实值。故本发明按照Zhang等人的内标策略(Zhang，J.，et al.，Determination of bovine lactoferrin in dairy products by ultra-highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry based on tryptic signature peptidesemploying an isotope-labeled winged peptide as internal standard.Analytica chimica acta.2014.829：p.33-39)，设计并合成了IEKQAKDL*AFPGSGEQV*EKLIKNQ和QFKRELRNL*PQQCGL*RAPQRCD分别作为Ara h1和Ara h2的内标使用。应用该内标，本发明对三个阳性样品进行检测，结果见表4。由结果可见，采用外标法的检测结果显著地低于内标法，并且具有较高的相对标准偏差。

表4：外标法和内标法的检测结果比较

实施例2样品预处理(酶切条件的优化)

研究表明，Ara h2具有典型的胰蛋白酶抑制剂的结构。通过水解二硫键破坏该蛋白质空间结构可以降低其胰蛋白酶抑制剂活性，提高酶解效率。本实施例通过提高DTT浓度和优化加热过程来提高蛋白质二硫键破坏的程度。

配制浓度为50、100、200、300、400、500、600、700、800和900mmol/L的DTT，为了使多余的DTT和游离的二硫键充分反应，IAA溶液的浓度与DTT保持一致，并且加入量为DTT的三倍。按照上文所述的样品预处理方法，得到不同DTT浓度对酶切效率的影响，DLAFPGSGEQVEK和NLPQQCGLR的峰面积如图2所示。

在DTT小于600mmol/L时，多肽DLAFPGSGEQVEK的峰面积一直维持在24000左右，说明其易于水解，在较低的DTT浓度下依然能够完全水解。而多肽NLPQQCGLR的峰面积从7000逐渐上升到23000，Ara h2的三维结构随着DTT浓度增加而逐渐破坏，使其逐渐易于水解，峰面积在600mmol/L时达到顶峰。当DTT浓度进一步加大时，两个特征肽的峰面积均有所下降，这有可能是DTT和IAA浓度过高导致的离子化抑制。综合两个多肽在不同DTT浓度中的表现，DTT的最佳浓度为600mmol/L。

实施例3不同品种花生中过敏源含量的检测

在千余年的花生种植史中，花生通过了品种改良，衍生出大量的花生品种，仅在中国可查到的花生品种有500种以上。所以在不同花生品种之间，蛋白质组成可能有所不同。本文在中国农业科学院油料作物研究所的帮助下，收集了中国最常见的20种花生，按照上文所述的样品预处理方法和UPLC-TQ-MS分析方法以及凯氏定氮法检测上述样品中Ara h1、Ara h2和总蛋白质，计算不同种花生中Ara h1和Ara h2占总蛋白的百分比，结果见表5。

表5：不同品种花生的Ara h1和Ara h2含量检测结果

本实施例所测得的两种蛋白质含量平均值与文献(Koppelman，S.，et al.，Quantification ofmajor peanut allergens Ara h1 and Ara h2 in the peanut varieties Runner，Spanish，Virginia，andValencia，bred in different parts of the world.Allergy，2001.56(2)：p.132-137)相比较为接近，但是仅在更小的范围内波动(10.38-13.69％和4.25-6.58％)，其标准偏差分别为0.98％和0.61％。可能主要是由于花生样品不同所导致；除此之外，检测方法不同也是另一个主要原因，上文献中所用的是基于SDS-PAGE的半定量法，与本方法相比具有更大的不稳定性。

实施例4待测样品加热条件对检测的影响

在加热过程中，花生蛋白质不可避免地参与到一系列反应中去，从而导致花生蛋白质变性。本文通过模拟花生烘培实验，以研究加热过程对本发明方法的影响。花生在完整颗粒的状态下，置于160℃烘箱内进行烘焙，烘焙时间为10-70分钟。烘焙时间为0分钟的花生表示未经烘焙的生花生。在烘焙完成后将花生磨碎，按照上文所述的样品预处理方法和UPLC-TQ-MS分析方法检测Ara h1和Ara h2的含量。结果如图3所示。

在10-20分钟的烘焙时间内，花生没有完全烘焙熟，两个致敏蛋白含量与生花生相比未有显著性区别。当烘焙时间在30-40分钟时，花生逐渐烘焙成熟，表面出现焦黄色，散发出典型的熟花生气味。Ara h1在30分钟时开始逐渐下降，在40分钟时下降幅度加剧，可测得的Ara h1占生花生的62％。Ara h2含量在30分钟时却与生花生无显著性差异，仅在40分钟烘焙时间时开始下降，可测得的Ara h2降至73％。在更长的烘焙时间下，两个蛋白质继续下降，且Ara h1下降幅度大于Ara h2。上述数据表明，Ara h2耐热性能较Ara h1高，其含量更适合作为标记物，用以指示花生总蛋白含量。

实施例5与经典传统方法的对比

作为另一种基于蛋白质的检测方法，ELISA已经被广泛接受并且应用于食品中过敏源的检测。本实施例采用实施例3所制备的试剂盒和ELISA试剂盒(r-Biopharm，Germany)检测相同样品。为了使结果具有可比性，选择较适宜作为标记物的Ara h2，并且应用表2所获得换算系数，即Ara h2占花生重量的1.42％，将其浓度换算成花生含量，计算回收率，结果见图4。

根据UPLC-TQ-MS的结果显示，没有烘焙的花生的回收率没有达到100％，而仅仅达到90％，主要原因是该实验所选择的花生Ara h2含量为1.29％，低于表2所获得1.42％的平均值。同样的，ELISA的检测回收率仅为80％，可能是由他们使用的标准品与本发明所选择的样品蛋白质含量天然差异造成的。

在30分钟内，随着烘焙时间的增加，两个方法的回收率均有缓慢的下降趋势，但UPLC-MS法下降幅度明显缓于ELISA法。在烘焙了40分钟后，ELISA法的检测回收率迅速下降了53％，而UPLC-MS法仅下降了23％。甚至在70分钟的烘焙时间后，可测得的花生蛋白质已经低于ELISA法的检出限。

导致这些问题的原因主要有两点：1、花生蛋白质必须先从基质中溶解提取至提取液中才能进行下一步的检测分析，然而加热会导致蛋白质变性，形成蛋白质多聚体，从而降低蛋白质的溶解度；UPLC-MS法直接在悬浊液中进行酶切，避免了蛋白质提取步骤，从而提高了回收率。2、ELISA法采用抗原-抗体结合的原理，对被测蛋白质的空间结构有严格的要求，加热导致的蛋白质变性会改变其空间结构，从而使回收率变低；UPLC-MS法仅检测花生蛋白质中的特征肽，所以在特征肽的一级结构保持稳定的情况下，即能测得对应的花生致敏蛋白。

实施例6方法学验证

本实施例从标准曲线线性、回收率、日间精密度和灵敏度四方面来对该方法进行考察。从前面实施例的研究表明，花生致敏蛋白质中最适宜作为标记物的为Ara h2，故本文的方法学以花生作为标准品制作标准曲线和做加标回收率，通过检测Ara h2和换算系数来计算花生蛋白质含量。

本实施例首先选择了一个花生作为标准品，应用凯氏定氮法测得其总蛋白含量。根据花生致敏剂量阈值的研究结果以及本发明方法在预处理过程中的稀释倍数，选择了总蛋白含量为5-100mg/L的花生悬浊液为标准曲线溶液，按照上文所述的样品预处理方法进行酶切后，进样UPLC-TQ-MS分析，建立标准曲线。得该线性方程为y＝0.0283x-0.0636，其相关系数R²为0.997。

将一空白馒头作为基质，加入花生悬浊液，使其花生总蛋白含量达到10、50、100mg/kg，分别作为低、中、高加标进行加标回收率测试。每个样品重复处理3天，每天6个平行，低、中、高加标样品的回收率分别为108.35±3.47％、105.74±5.78％和111.88±2.82％。

通过统计上述加标样品的检测结果可计算出本发明方法的日间精密度，低、中、高浓度下的检测结果的相对标准偏差分别为3.18％、5.51％和2.55％。

灵敏度通过考察低加标浓度的样品实现。将低加标浓度的样品重复处理分析6次，计算其定量离子的信噪比，以1∶10信噪比为定量限，计算得本发明方法的定量限约为2.0mg/kg。

实施例7

本实施例从市场上随机采购了9种不以花生作为配料的烘焙食品，其中4个样品标注不含有花生过敏源，2个样品标注可能含有花生过敏源，3个样品在包装上没有任何过敏源信息。通过上文所述的样品预处理方法以及UPLC-TQ-MS分析方法，获得结果如表6所示。

表6：实际样品检测结果

表6的检测结果显示，2个可能含有花生过敏源的样品均测出低含量花生蛋白质，但其含量远远低于致敏阈值。没有过敏源信息的3个样品均无检出花生蛋白质。然而，其中一个标注不含有花生蛋白质的样品却含有52.89±1.07mg/kg的蛋白质，虽然该值依然低于上述实施例中估计的致敏阈值，但是在大量食用该食品的情况下，或者对于较为敏感的过敏源患者依然有不可忽视的风险存在。

Claims (9)

1.一种花生过敏源蛋白的特征肽，其特征在于，氨基酸序列为DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR。

2.一种用于检测花生过敏源蛋白的内标物，其特征在于，氨基酸序列为IEKQAKDL*AFPGSGEQV*EKLIKNQ或QFKRELRNL*PQQCGL*RAPQRCD，其中L*和V*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

3.一种液质联用检测花生过敏源蛋白的试剂盒，包括特征肽和内标物，其特征在于，所述特征肽的氨基酸序列为DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR，所述内标物的氨基酸序列为IEKQAKDL*AFPGSGEQV*EKLIKNQ或QFKRELRNL*PQQCGL*RAPQRCD，其中L*和V*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

4.如权利要求3所述的试剂盒在检测花生过敏源蛋白中的应用。

5.一种液质联用检测花生过敏源蛋白的方法，包括：

(1)配制系列含花生过敏原蛋白的特征肽和同位素标记特征肽的标准溶液，利用液质联用进行分离检测，计算特征肽和同位素标记特征肽的峰面积比，线性回归得到方程Y＝kX+b，其中Y为特征肽和同位素标记特征肽的峰面积比，X为特征肽的浓度；

所述特征肽的氨基酸序列为DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR，所述同位素标记特征肽的氨基酸序列为DL*AFPGSGEQV*EK或NL*PQQCGL*R；

(2)取待测样品，与内标物混合溶于水后进行酶解，在相同条件下对酶解液利用液质联用进行分离检测，计算特征肽和同位素标记特征肽的峰面积比，根据所述方程得到酶解液中所述特征肽的浓度，最后计算得到样品中花生过敏源蛋白的含量。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶解的温度为35～37℃，时间为5～6h。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，所述液质联用的液相色谱条件为：色谱柱：Acquity BEH 300C18柱(1.7μm，2.1×100mm)；柱温：40℃；进样体积：5μL；流动相A：0.1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/乙腈；流速0.3mL/min；洗脱程序为：流动相B起始浓度为7％，8min内线性上升为25％，9min下降至7％并保持3分钟。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，所述液质联用的质谱分析条件为：电喷雾离子源电离模式：ESI+；毛细管电压：3.5kV；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：800L/min；锥孔反吹气流量：150L/h；碰撞室压力：7.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.77V；高端分辨率1：15.09V；离子能量1：0.1；低端分辨率2：2.80V；高端分辨率2：14.79V；离子能量2：0.6；离子源温度：150℃；提取器电压：3.0V；入口透镜电压：0.5V；出口电压：0.5V；碰撞梯度：4.0。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，酶解前，添加浓度为500～700mmol/L的二硫苏糖醇。