CN110501437B - 一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取及检测分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取及检测分析方法。本发明采用丙酮沉淀法，充分裂解后的蛋白溶液加入冷丙酮和30mM DTT，涡旋混匀，‑20℃沉淀，离心时去掉上清后采用质谱更兼容的溶液重悬蛋白，SDS等表面活性剂能够和蛋白结合，丙酮沉淀蛋白时会一起沉淀下来，所以丙酮沉淀一次只能去掉部分的SDS，待重悬的蛋白进行还原烷基化后，再次加入冷丙酮和10mM DTT，‑20℃沉淀，离心去掉上清后再次采用质谱更兼容的溶液重悬蛋白，经过两次丙酮沉淀与裂解液重悬置换，SDS对后续实验的影响基本消除，并且每个样品只需3ml左右的丙酮，成本大约0.1元，相较于超滤管，节省了更多成本。

Description

一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取及检测分析方法

技术领域

本发明涉及蛋白质提取及分析技术领域，具体涉及一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取及检测分析方法。

背景技术

蛋白质在甲醛中仅20min就形成二聚体、三聚体甚至多聚体，交联后亚甲基桥的形成导致某些活性裂解位点被掩埋，阻碍胰蛋白酶或其他内肽酶到达其活性裂解位点，导致酶解不完全，交联的多肽依然存在，影响质谱检测。

对石蜡包埋样品进行蛋白质组学定量分析的方法，主要包括以下步骤：脱蜡剂去除石蜡；加入合适的蛋白裂解液提取蛋白；水浴加热孵化裂解甲醛的共价交联；FASP(Filter-aided sample preparation，超滤管辅助样品制备)酶解；除盐及分级；质谱上机检测分析。

研究发现用单纯加热方法仅使2-6％的蛋白质溶解，而加用2％SDS(十二烷基硫酸钠)可使蛋白质溶解度增加15倍，即＞80％的蛋白质溶解。然而，由于SDS会干扰胰蛋白酶的酶解，在胰蛋白酶消化前，SDS的最终浓度应稀释至0.15；另外，SDS抑制了被分析物的电离作用，干扰了下游的反相分离，因此在质谱分析之前，对样本溶液的SDS进行适当的去除是必不可少的。采用FASP法去除样品中的SDS需要超滤离心至少十次，每次15min，操作十分繁琐，并且超滤管的成本较高，一个超滤管需要花费30元。

另外，通过对标本中蛋白提取工艺的优化也能一定程度的减少人为降解和修饰，释放尽可能多的肽段，能够尽可能准确地对尽可能多的蛋白进行检测，全面的分析和判断标本中的蛋白类型。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种新的石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，经过该方法处理后的样本对后续检测影响小，且每个样本只需3ml左右的丙酮，成本大约0.1元，节省成本。

本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的:

本发明提供了一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，包括以下步骤：去石蜡、冷冻干燥、裂解、加热、离心、丙酮沉淀、离心复溶、还原、烷基化、二次丙酮沉淀、离心。

本发明所提供的石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，先用脱蜡剂去除包埋样本中的石蜡，待石蜡脱净后，去除脱蜡液，再采用冷冻干燥的方式对样本进行完全干燥，避免样本中残留的有机溶剂影响后续试验，导致质谱无法检测到样本中的肽段，再进行蛋白裂解，加热解除甲醛的共价交联作用，增加蛋白的溶解度，再采用丙酮进行沉淀，沉淀后进行离心复溶，然后依次进行还原、烷基化，最后再重复进行丙酮沉淀和离心得到去除了SDS用于后续试验的蛋白质。采用该方法处理后的样本对后续检测影响小，且每个样本只需3ml左右的丙酮，成本低。

其中，裂解的条件为：用液氮研磨组织，完全磨成粉末后加入裂解液，混匀后冰浴超声破碎。裂解液包括0.1M Tris-HCl、0.1M DTT、1mM PMSF、2mM EDTA,pH为8.0，裂解液的用量为每0.02g粉末组织添加150-250μl裂解液；超声破碎的条件为超声破碎2秒，间歇时间为3秒，功率为150-250W，超声裂解的时间为10-20min。

其中，加热的条件为：加入终浓度为4％的SDS，95-105℃金属浴震荡80-100min，一般是加入等体积的8％的SDS溶液，金属浴震荡更能充分解除甲醛的共价交联作用，增加蛋白的溶解度。

其中，丙酮沉淀的条件为：加入3-5倍体积的冷丙酮，再加入8-13％体积比的30mMDTT,混匀，-20℃静置沉淀，沉淀时间≥2小时；二次丙酮沉淀的条件为：加入3-5倍体积的冷丙酮，同时加入12-16％体积比的10mM DTT，混匀，-20℃静置沉淀，沉淀时间≥2小时。

其中，离心复溶的条件为：离心后去上清，沉淀中加入含有8M尿素、0.1M TEAB的复溶溶液进行溶解，复溶溶液的添加量为每0.02g粉末组织添加150-250μl复溶溶液。

优选地，本发明所提供的一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，包括以下步骤：

1)去石蜡：去除石蜡包埋样本中的石蜡；

2)冷冻干燥：将去除石蜡的样本进行冷冻干燥至完全干燥；

3)裂解：先液氮研磨再加入裂解液最后采用冰浴超声破碎；

4)加热：向裂解后的样品中加入终浓度为4％的SDS混匀，95-105℃金属浴震荡80-100min，冷却至室温；

5)离心：取上清；

6)丙酮沉淀：加入冷丙酮，同时加入30mM DTT,混匀后，-20℃静置沉淀；

7)离心复溶：离心取上清，沉淀风干后加入含有8M尿素、0.1M TEAB的溶液进行溶解；

8)还原：加入0.5-1.5％体积比的1M DTT，50-70℃水浴25-40min；

9)烷基化：加入8-12％体积比的0.55M IAM，常温暗室静置25-35min；

10)二次丙酮沉淀：加入冷丙酮，同时加入10mM DTT，混匀，-20℃静置沉淀；

11)离心：离心去上清，沉淀即为提取得到的蛋白质。

本发明还提供了一种石蜡包埋样品中蛋白质的检测分析方法，具体包括以下步骤：

按照上述提取方法提取得到蛋白质，对提取得到的蛋白质依次进行复溶、酶解和脱盐处理，经过脱盐处理后的样品进行HPLC分组分、质谱检测和数据分析。

其中，酶解包括以下步骤：取复溶后的蛋白质溶液，依次加入TEAB、CaCl₂溶液、胰酶，震荡混匀离心，37℃水浴过夜，其中每100ug蛋白质用含有8M尿素、0.1M TEAB的溶液补充至100ul，TEAB的用量为0.1M TEAB溶液400-600ul、CaCl₂的用量为0.5M CaCl₂溶液，1.0-1.5ul，胰酶的用量为1ug/ul胰酶1-3ul。

其中，脱盐处理包括以下步骤：

1)将水浴过夜后的样本离心取上清，加入FA酸化，震荡混匀后离心取上清备用；

2)采用甲醇和FA活化和酸化C18柱料；

3)将酸化后的柱料加入步骤2)中的柱料中缓慢旋转反应；

4)用FA和ACN溶液清洗，离心收集上清液并冻干。

其中，脱盐处理步骤1)中离心的条件为4℃，13000rpm,10min,酸化时加入的FA为同等体积的0.1％FA的溶液；步骤2)中每100mg C18柱料活化时需要加入的甲醇为1ml、0.1％FA为1ml；步骤3)中蛋白质与柱料的比例为：每100ug蛋白质需要使用100mg柱料，旋转反应时间为25-35min；步骤4)中FA和ACN溶液清洗三次，100ug蛋白质每次清洗所用的0.1％FA的体积为1ml，3％ACN的体积为1ml，离心条件为9000rpm，4min。

其中，HPLC分组分检测包括以下步骤：用0.5M TEAB溶解提取得到的多肽蛋白质，其中0.5M TEAB的用量为每100ug多肽蛋白质添加100μl 0.5M TEAB溶液，将肽段运用Ultimate 3000 HPLC系统(Thermo DINOEX，USA)对肽段样品进行分离，色谱柱使用的是Durashell C18柱(5μm，

4.6×250mm)，利用碱性条件下逐渐升高的乙腈浓度来实现肽段的分离，流速为1ml/min，每分钟收集一管，共收集42个次级馏分别合并成6个组分，合并后的组分真空干燥。

其中，液相色谱-质谱联用分析包括以下步骤：质谱数据采集使用的是TripleTOF5600+液质联用系统(SCIEX)，将多肽样品溶解于含有2％乙腈和0.1％甲酸的溶液中，其中2％乙腈和0.1％甲酸溶液的用量为每100ug多肽蛋白质添加100μl，并使用与Eksigent nanoLC系统(SCIEX，USA)偶联的TripleTOF 5600plus质谱仪进行分析，将多肽溶液加到C18捕获柱(5μm，100μm×20mm)上，并以90min时间梯度，300nL/min的流速在C18分析柱(3μm，75μm×150mm)上进行梯度洗脱。对于IDA(信息依赖性采集)，以250ms的离子累积时间进行一级质谱图的扫描，并以50ms的离子累积时间采集30个前体离子的二级质谱图，在350-1500m/z的范围内采集MS1光谱，并且在100-1500m/z的范围内采集MS2光谱。

①LC-MS/MS条件：

A:0.1％甲酸，5％乙腈；

B:0.1％甲酸，95％乙腈；

Loading Buffer:0.1％甲酸，2％乙腈。

②LC-MS/MS的液相方法以90min为例，上样5μl。

其中，蛋白质鉴定包括以下步骤：使用与AB Sciex 5600plus配套的搜索引擎——ProteinpilotTM V4.5，Proteinpilot在搜索时由于考虑了全部可能的修饰种类，同时增加了自动容错匹配功能，在保证鉴定结果可信度的前提下，能够比同类软件检索到更多的结果，对于proteinpilot的鉴定结果，我们做了进一步过滤，对于鉴定到的蛋白，认为unusedscore≥1.3(即可信度水平在95％以上)，每个蛋白至少包含一个unique肽段的蛋白为可信蛋白；对于鉴定的肽段和蛋白质定量，我们以conf≥95过滤，即可信度在95％以上认为可信肽段用于蛋白质定量。

上述描述中Tris-HCl为三(羟甲基)氨基甲烷、DTT为二硫苏糖醇、PMSF为苯甲基磺酰氟、EDTA为乙二胺四乙酸、SDS为十二烷基硫酸钠、TEAB为四乙基溴化铵、IAM为碘代乙酰胺、FA为甲酸、ACN为乙腈。

本发明具有以下有益技术效果：

(1)本发明采用丙酮沉淀法，充分裂解后的蛋白溶液加入冷丙酮和30mM DTT，涡旋混匀，-20℃沉淀，离心时去掉上清后采用质谱更兼容的溶液重悬蛋白，像SDS这类的表面活性剂能够和蛋白结合，丙酮沉淀蛋白时会一起沉淀下来，所以丙酮沉淀一次只能去掉部分的SDS，待重悬的蛋白进行还原烷基化后，再次加入冷丙酮和10mM DTT，-20℃沉淀，离心去掉上清后再次采用质谱更兼容的溶液重悬蛋白，经过两次丙酮沉淀与裂解液重悬置换，SDS对后续实验的影响基本消除，并且每个样品只需3ml左右的丙酮，成本大约0.1元，相较于超滤管，节省了更多成本；

(2)本发明采用的丙酮沉淀法较FASP酶解法操作更简单，无需多次离心；

(3)本发明所提供的石蜡包埋样品中蛋白质的检测分析方法，实现了石蜡包埋样品中蛋白质鉴定分析的流程化，流程鉴定的通量更高，定量重复性好、可重现性高。

附图说明

图1为本发明的操作流程结构示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

一、取实验室的宫颈癌石蜡切片进行提取蛋白质,具体操作步骤如下：

1)去石蜡：采用江原实业的环保透明脱蜡液对宫颈癌石蜡切片进行脱蜡处理，待石蜡脱净后，完全去除脱蜡液；

2)冷冻干燥：将去除脱蜡液后的样本放入冷冻干燥离心机中，至样本完全干燥；

3)蛋白裂解：用液氮研磨脱蜡后的组织，完全磨成粉末，取0.02g研磨后的粉末加入到1.5ml EP离心管中，加入200μl裂解液，混匀后冰浴超声破碎，其中裂解液中包括0.1MTris-HCl、0.1M DTT、1mM PMSF、2mM EDTA，pH为8.0，超声破碎的条件为：超声破碎2秒，间歇时间为3秒，功率为200W,超声破碎时间为15min；

4)加热：向裂解后的样本中加入200μl质量浓度为8％的SDS，涡旋混匀，99℃金属浴、600rpm震荡90min,自然冷却至室温；

5)离心：20℃，13000rpm，离心15min，取上清加入到2ml EP离心管中，其中上清的体积为360μl。

6)丙酮沉淀：加入1440μl-20℃预冷的冷丙酮，同时加入200μl30mM DTT，涡旋混匀，-20℃沉淀2小时；

7)离心复溶：4℃，13000rpm,离心15min，去上清，沉淀风干后加入200μl含有8M尿素、0.1M TEAB的U2溶液进行溶解；

8)还原：加入2μl的1M DTT，56℃水浴30min；

9)烷基化：加入20μl的0.55M IAM，常温暗室静置30min；

10)二次丙酮沉淀：加入888μl的冷丙酮，同时加入180μl的10mM DTT，涡旋混匀，-20℃沉淀2小时；

11)离心：4℃，13000rpm，离心15min，去上清，沉淀风干即为提取得到的蛋白质；二、对上述提取后的蛋白质进行Bradford定量：

绘制标准曲线如下：

检测得到的离心复溶后的样本中蛋白的浓度为4.65ug/ul。

三、对提取得到的蛋白样品进行酶解，酶解步骤如下：取离心风干后的蛋白样品100ug用含有8M尿素、0.1M TEAB的U2溶液补充体积至100ul进行复溶，依次加入500ul 0.1MTEAB、1.2ul 0.5M CaCl₂溶液、2ul 1ug/ul胰酶，震荡混匀离心，37℃水浴过夜。

四、对酶解后的样品进行脱盐处理，采用C18脱盐，具体步骤如下：

1)将水浴过夜后的样本进行离心，离心条件为13000rpm,15min，取上清580ul至1.5ml EP离心管中，加入同等体积的0.1％FA进行酸化，震荡混匀后离心取上清备用；

2)称取10mg C18柱料置于1.5ml的离心管中，分别加入1ml的甲醇、1ml 0.1％FA活化和酸化柱料；

3)将步骤1)中酸化后的样本加入步骤2)中的C18柱料中，缓慢旋转反应30min；

4)用0.1％FA和3％ACN溶液清洗三次,具体每次清洗的步骤为：加入800ul ACN和200ul 0.1％FA的洗脱液于C18柱料中，在混匀仪上缓慢旋转反应30min，9000g，离心4min，收集上清液；

5)将收集到的上清液进行冻干保存待用；

五、HPLC分组分检测包括以下步骤：用100μl 0.5M TEAB溶解100ug提取得到的多肽蛋白质，将肽段运用Ultimate 3000 HPLC系统(Thermo DINOEX，USA)对肽段样品进行分离，色谱柱使用的是Durashell C18柱(5μm，

4.6×250mm)，利用碱性条件下逐渐升高的乙腈浓度来实现肽段的分离，流速为1ml/min，每分钟收集一管，共收集42个次级馏分别合并成6个组分，合并后的组分真空干燥。

六、液相色谱-质谱联用分析包括以下步骤：质谱数据采集使用的是TripleTOF5600+液质联用系统(SCIEX)，将100ug提取得到的多肽蛋白质样品溶解于100μl 2％乙腈和0.1％甲酸溶液中，并使用与Eksigent nanoLC系统(SCIEX，USA)偶联的TripleTOF5600plus质谱仪进行分析，将多肽溶液加到C18捕获柱(5μm，100μm×20mm)上，并以90min时间梯度，300nL/min的流速在C18分析柱(3μm，75μm×150mm)上进行梯度洗脱。对于IDA(信息依赖性采集)，以250ms的离子累积时间进行一级质谱图的扫描，并以50ms的离子累积时间采集30个前体离子的二级质谱图，在350-1500m/z的范围内采集MS1光谱，并且在100-1500m/z的范围内采集MS2光谱。

①LC-MS/MS条件：

A:0.1％甲酸，5％乙腈；

B:0.1％甲酸，95％乙腈；

Loading Buffer:0.1％甲酸，2％乙腈。

②LC-MS/MS的液相方法以90min为例，上样5μl。

七、蛋白质鉴定包括以下步骤：使用与AB Sciex 5600plus配套的搜索引擎——ProteinpilotTM V4.5，Proteinpilot在搜索时由于考虑了全部可能的修饰种类，同时增加了自动容错匹配功能，在保证鉴定结果可信度的前提下，能够比同类软件检索到更多的结果，对于proteinpilot的鉴定结果，我们做了进一步过滤，对于鉴定到的蛋白，认为unusedscore≥1.3(即可信度水平在95％以上)，每个蛋白至少包含一个unique肽段的蛋白为可信蛋白；对于鉴定的肽段和蛋白质定量，我们以conf≥95过滤，即可信度在95％以上认为可信肽段用于蛋白质定量。

通过筛选在宫颈癌样品中共鉴定到4510个蛋白。

实施例2

取实验室的宫颈癌石蜡切片进行提取蛋白质,具体操作步骤如下：

1)去石蜡：采用江原实业的环保透明脱蜡液对宫颈癌石蜡切片进行脱蜡处理，待石蜡脱净后，完全去除脱蜡液；

2)冷冻干燥：将去除脱蜡液后的样本放入冷冻干燥离心机中，至样本完全干燥；

3)蛋白裂解：用液氮研磨脱蜡后的组织，完全磨成粉末，取0.02g研磨后的粉末加入到1.5ml EP离心管中，加入150μl裂解液，混匀后冰浴超声破碎，其中裂解液中包括0.1MTris-HCl、0.1M DTT、1mM PMSF、2mM EDTA，pH为8.0，超声破碎的条件为：超声破碎2秒，间歇时间为3秒，功率为150W,超声破碎时间为10min；

4)加热：向裂解后的样本中加入150μl质量浓度为8％的SDS，涡旋混匀，95℃金属浴、600rpm震荡80min,自然冷却至室温；

5)离心：20℃，13000rpm，离心15min，取上清加入到2ml EP离心管中，其中上清的体积为260μl。

6)丙酮沉淀：加入1300μl-20℃预冷的冷丙酮，同时加入233μl 30mM DTT，涡旋混匀，-20℃沉淀5小时；

7)离心复溶：4℃，13000rpm,离心15min，去上清，沉淀风干后加入150μl含有8M尿素、0.1M TEAB的溶液进行溶解；

8)还原：加入2.25μl的1M DTT，50℃水浴25min；

9)烷基化：加入12μl的0.55M IAM，常温暗室静置25min；

10)二次丙酮沉淀：加入850μl的冷丙酮，同时加入138μl的10mM DTT，涡旋混匀，-20℃沉淀5小时；

11)离心复溶：4℃，13000rpm，离心15min，去上清，沉淀风干后加入150μl含有8M尿素、0.1M TEAB的U2溶液进行溶解；

实施例3

取实验室的宫颈癌石蜡切片进行提取蛋白质,具体操作步骤如下：

1)去石蜡：采用江原实业的环保透明脱蜡液对宫颈癌石蜡切片进行脱蜡处理，待石蜡脱净后，完全去除脱蜡液；

2)冷冻干燥：将去除脱蜡液后的样本放入冷冻干燥离心机中，至样本完全干燥；

3)蛋白裂解：用液氮研磨脱蜡后的组织，完全磨成粉末，取0.02g研磨后的粉末加入到1.5ml EP离心管中，加入250μl裂解液，混匀后冰浴超声破碎，其中裂解液中包括0.1MTris-HCl、0.1M DTT、1mM PMSF、2mM EDTA，pH为8.0，超声破碎的条件为：超声破碎2秒，间歇时间为3秒，功率为250W,超声破碎时间为20min；

4)加热：向裂解后的样本中加入250μl质量浓度为8％的SDS，涡旋混匀，105℃金属浴、600rpm震荡100min,自然冷却至室温；

5)离心：20℃，13000rpm，离心15min，取上清加入到2ml EP离心管中，其中上清的体积为460μl。

6)丙酮沉淀：加入1380μl-20℃预冷的冷丙酮，同时加入275μl30mM DTT，涡旋混匀，-20℃过夜沉淀；

7)离心复溶：4℃，13000rpm,离心15min，去上清，沉淀风干后加入250μl含有8M尿素、0.1M TEAB的U2溶液进行溶解；

8)还原：加入0.75μl的1M DTT，70℃水浴40min；

9)烷基化：加入18μl的0.55M IAM，常温暗室静置35min；

10)二次丙酮沉淀：加入806μl的冷丙酮，同时加入205μl的10mM DTT，涡旋混匀，-20℃过夜沉淀；

11)离心复溶：4℃，13000rpm，离心15min，去上清，沉淀风干后加入250μl含有8M尿素、0.1M TEAB的U2溶液进行溶解。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)去石蜡：去除石蜡包埋样本中的石蜡；

2)冷冻干燥：将去除石蜡的样本进行冷冻干燥至完全干燥；

3)裂解：先液氮研磨再加入裂解液最后采用冰浴超声破碎；其中，裂解液包括0.1MTris-HCl、0.1M二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟、2mM EDTA，pH为8.0；超声破碎的条件为：超声破碎2秒，间歇时间为3秒，功率为150-250W，超声裂解的时间为10-20min；

4)加热：向裂解后的样品中加入终浓度为4％的SDS混匀，95-105℃金属浴震荡80-100min，冷却至室温；

5)离心：取上清；

6)丙酮沉淀：加入3-5倍体积的冷丙酮，再加入30mM二硫苏糖醇,混匀后，-20℃静置沉淀；

7)离心复溶：离心取上清，沉淀风干后加入含有8M尿素、0.1M四乙基溴化铵的溶液进行溶解；

8)还原：加入0.5-1.5％体积比的1M二硫苏糖醇，50-70℃水浴25-40min；

9)烷基化：加入8-12％体积比的0.55M碘代乙酰胺，常温暗室静置25-35min；

10)二次丙酮沉淀：加入3-5倍体积的冷丙酮，同时加入10mM二硫苏糖醇，混匀，-20℃静置沉淀；

11)离心：离心去上清，沉淀即为提取得到的蛋白质。

2.一种石蜡包埋样本中蛋白质的检测分析方法，其特征在于，按照权利要求1所述的方法提取石蜡包埋样本中的蛋白质，对提取得到的蛋白质依次进行复溶、酶解和脱盐处理，经过脱盐处理后的样品进行HPLC分组分、质谱检测和数据分析。

3.根据权利要求2所述的石蜡包埋样本中蛋白质的检测分析方法，其特征在于，酶解包括以下步骤：取复溶后的蛋白质溶液，依次加入四乙基溴化铵、CaCl₂溶液、胰酶，震荡混匀离心，37℃水浴过夜。

4.根据权利要求2所述的石蜡包埋样本中蛋白质的检测分析方法，其特征在于，脱盐处理包括以下步骤：

1)将水浴过夜后的样本离心取上清，加入甲酸酸化，震荡混匀后离心取上清备用；

2)采用甲醇和甲酸活化和酸化C18柱料；

3)将酸化后的样品加入步骤2)中的柱料中缓慢旋转反应；

4)用甲酸和乙腈溶液清洗，离心收集上清液。

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