CN111060696A - 一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法 - Google Patents

一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，包括以下步骤：S1、利用植物原生质体制备总蛋白，再将总蛋白超滤后，收集滤液，将滤液样品先经过还原再进行烷基化处理后，得到待测样品；S2、利用液质联用仪对待测样品进行测定，并对测定后的数据进行分析。该方法从没有细胞壁保护的原生质体中提取蛋白质更容易且原生质体更利于保持蛋白与小肽的完整性，不仅操作简单，而且测定结果中假阳性率更低。

Description

一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法。
背景技术
植物小肽指植物体内介导细胞之间信号转导的小分子信号肽(small signalingpeptides，SSPs)，在植物的生长发育及逆境胁迫响应中起重要的调控作用。与传统植物激素类似，小肽通过其特异性受体感知传导信号而发挥调节功能，因此，小肽逐渐被认为是一类新型的植物激素。成熟具有功能的小肽长度一般不超过20个氨基酸，来源于前体蛋白的降解或剪切。植物小肽既可在胞内传递信号，也可被释放到胞外介导细胞间的信号传递。小肽在动物中的研究已经非常广泛且深入，但在植物中近年来才得到发展。作为小分子信号物质，与植物激素类似，小肽在植物中的含量与作用浓度极低，因此，测定相对困难。随着质谱技术的发展，通过质谱测定分析组学的方法陆续鉴定出一系列小肽。但是由于植物蛋白提取过程复杂，蛋白质断裂形成的小片段较多，质谱测定会产生较多假阳性，如何从植物组织粗提物中分离鉴定出有功能的SSPs，依然是一大挑战。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种方法，能够降低植物小分子信号肽假阳性率。
根据本发明实施例的方法，包括以下步骤：
S1、利用植物原生质体制备总蛋白，再将总蛋白超滤(优选为用5kD超滤管进行超滤)后，收集滤液，将滤液样品先经过还原再进行烷基化处理后，得到待测样品；
S2、利用液质联用仪对待测样品进行测定，并对测定后的数据进行分析；
其中，所述数据的分析过程包括以下步骤：
利用ProteinLynx ProteinPilot软件分析质谱原始数据，自动计算色谱峰宽和质谱峰宽；
利用Paragon Algorithm算法结合ProteinPilot与TAIR蛋白数据库检索蛋白；
利用SignalP5.0在线软件分析所鉴定小肽是否含有信号肽剪切位点。
根据本发明实施例的方法，至少具有如下有益效果：使用植物原生质体代替植物组织进行蛋白质及小肽的提取，避免不必要的较大蛋白质碎裂造成干扰；由于从植物组织中提取蛋白质需要机械粉碎细胞壁且通过机械研磨提取得到的小肽可能是大蛋白中长肽链断裂而产生的假肽，因此，从没有细胞壁保护的原生质体中提取蛋白质更容易且原生质体更利于保持蛋白与小肽的完整性，测定结果中假阳性率更低。
根据本发明的一些实施例，数据分析操作还包括：将蛋白序列比对到GeneOntology Terms(http://geneontology.org/)数据库，鉴定蛋白的功能；
利用NCBI“blastp”蛋白同源比对将以鉴定蛋白注释到TAIR protein database数据库；
利用KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)对所鉴定蛋白进行通路分析；
利用COG数据库(Clusters of Orthologous Groups of Proteins System，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)进行基因的功能注释。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S1还包括通过以下步骤提取得到原生质体：取待提取材料，加入酶液反应完后过滤，收集滤液，离心后弃上清，沉淀即为原生质体；其中，所述酶液的制备方法为取含有质量分数为(0.5％～2％)的纤维素酶、质量分数为(0.05％～0.15％)的果胶酶、质量分数为(0.05％～0.15％)的离析酶和(0.3～0.6)mol/L甘露醇的溶液，在(50～60)℃下水浴(8～15)min冷却后加入氯化钙和牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)，所述氯化钙的终浓度为(0.05～0.15)mol/L和所述BSA在溶液中的质量百分数为(0.05％～0.15％)。
根据本发明的一些实施例，加酶液后的反应条件为：在室温下(可以为15～30℃，优选为25℃)避光摇动(3～5)h。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S1中提取蛋白总样的操作具体为：用质量分数为(6～10)％的甘露醇溶液洗涤后，再用磷酸盐缓冲液(Phosphate缓冲液ed Saline，PBS)重悬原生质体，加入苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)混匀后离心，收集上清即为原生质体蛋白总样。当重悬于PBS缓冲液中时，原生质体因渗透压不平衡而破裂，释放出蛋白质及和小肽等细胞内容物。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S2利用液质联用仪进行检测过程中，液相色谱部分使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为2％乙腈/0.1％甲酸/98％H2O和流动相B为98％乙腈/0.1％甲酸/2％H2O。
根据本发明的一些实施例，所述检测过程包括通过等度洗脱程序对肽段进行洗脱分离；优选地，所述梯度洗脱程序为：0～4min 96％A～94％A，4～100min 94％A～76％A，100～102min76％A～60％A，102～105min 60％A～20％A，105～110min 20％A，110～110.1min 20％A～95％A，110.1～120min95％A。
根据本发明的一些实施例，所述质谱检测过程中，质谱条件为：毛细管电压3.0kV；温度120℃；采样锥60V；反溶剂温度350℃；流速50L/h；反溶剂气体流速500L/h；扫描在250ms内获得，以50ms/次进行扫描；在350-1500m/z范围内采集MS1光谱，在100-1500m/z范围内采集MS2光谱。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明对照例中不同蛋白提取液提取蛋白对照图；其中A为SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色效果图；B为Bradford法测得总蛋白含量柱状图；*P<0.05，NS表示差异不显著。
图2为本发明对照例中是否经过超声辅助提取的蛋白和小肽的结果图；其中，A为为Bradford法测定总蛋白含量的柱状图；B为Bradford法测定小肽含量的柱状图；C为SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色效果图；NU：未经超声辅助，U：经过超声辅助；*P<0.05，NS表示差异不显著。
图3为本发明实施例中通过原生质体提取蛋白和小肽与对照例中通过组织样本提取的蛋白质和小肽的对照图；其中，A为拟南芥叶片原生质体；B为SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色效果图；C为Bradford法测定总蛋白含量结果的柱状图；D为Bradford法测定小肽含量结果的柱状图；TS代表组织样本，PS代表原生质体样本，M代表标准品；*P<0.05，NS表示差异不显著。
图4为本发发明实施例原生质体与对照例组织样本中鉴定的小肽分析结果图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明对照例为：一种植物小分子信号肽的检测方法，包括以下步骤：
研磨法提取蛋(组织中提取总蛋白)：新鲜材料取样后，用液氮速冻，研磨至粉末状。加入五倍体积不同蛋白提取液，缓冲液A(50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5)，缓冲液B(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM EDTA,5％glycerol,1％TritonX-100,pH 7.5)，缓冲液C(7M urea,2M thiourea,3.5mM SDS,0.01M Tris,2mM EDTA,10mM DTT)。用涡旋仪充分混匀。再加入蛋白酶抑制剂PMSF(终浓度1mM)，混匀。4℃，12000g离心30min，转移上清，即为组织总蛋白样。Bradford assay测定蛋白浓度，并进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示。作为信号分子，SSPs在植物中极低浓度下起重要作用。为了提高SSPs提取的产量，在实验中测试了三种不同的提取缓冲液。从图中可以看出，三种提取缓冲液提取每克组织样品中总蛋白得率分别为1.68μg，2.18μg，2.31μg蛋白。说明缓冲液C(7M尿素，2M硫脲，3.5mM SDS，0.01MTris，2mM EDTA，10mM DTT)是提取总蛋白(包括肽)的最佳裂解液。SDS-PAGE电泳结果显示缓冲液C样品中有更多蛋白条带，尤其55kD以下的蛋白条带，其提取的小分子蛋白种类可能更多，后续实验是以缓冲液C提取得到的样品为基础进行的。
为了提高蛋白与小肽的得率，还可采用超声辅助提取，为验证超声辅助提取是否有效果，进行了对比测试，具体为：通过缓冲液C提取总蛋白(包括肽)，然后使用或不使用超声波仪辅助提取，提取得到的蛋白如图2所示。从图2中可以看出，与非超声提取方法相比，超声辅助提取的总蛋白质(包括肽)并没有显着增加。在用10kD超滤器对总蛋白样品进行超滤后，最终收集了超滤液中的小肽。非超声法提取的小肽(小于10kD)含量占总蛋白质0.72％，而超声提取的小肽含量占总蛋白0.84％(图3B)，其差异并不显著。与动物细胞不同，植物细胞被细胞壁包围，细胞壁由纤维素，果胶及其他成分组成。通常从植物组织中提取蛋白质需要机械粉碎细胞壁。然而，通过机械研磨提取得到的小肽可能是大蛋白中长肽链的断裂而产生的假肽。没有细胞壁的保护，蛋白质(包括小肽)从植物原生质体中提取比从植物组织中提取更容易。
本发明的实施例为：一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，包括以下步骤：S1、利用植物原生质体制备蛋白提取总样，再将蛋白提取总样过滤后，收集滤液，将滤液样品先经过还原再进行烷基化处理后，得到待测样品；S2、利用液质联用仪对待测样品进行测定，并对测定后的数据进行分析。
操作具体为：
取四周龄野生型拟南芥，分别滴灌10μM NAA作为处理组，对照组以等量蒸馏水滴灌。48h后取地上部分用于小肽测定。
1、原生质体中提取总蛋白：配制原生质体提取酶液：1％cellulose R10,0.1％pectolyase Y23,0.1％macerozyme R10,0.4M mannitol,55℃水浴10min后冷却，加入终浓度0.1M CaCl2、0.1％BSA，0.22μm过滤器过滤，即为原生质体提取酶液。取四周龄叶片，切成细丝状，放入酶液中。25℃避光缓慢摇动4h，直至叶片消化完全。消化液用150μm尼龙布过滤，收集滤液。100g室温下离心5min，弃上清，沉淀即为原生质体，8％甘露醇溶液清洗沉淀两次。PBS重悬原生质体，加入PMSF(终浓度1mM)，涡旋仪混匀，4℃，12000g离心30min，得原生质体蛋白总样。
2、小肽样品制备：10kD超滤管进行超滤，4℃，12000g离心30min，收集滤液，即为小肽样品。加入终浓度50mM DTT，56℃水浴30min，进行还原反应。随后加入终浓度100mM IAM，暗处室温放置30min进行烷基化反应。C18柱进行脱盐纯化，真空冷冻干燥。
3、TOF-MS/MS鉴定小肽：利用AB SCIEX Triple TOF 5600质谱串联SCIEXEksigent nanoLC System液相鉴定小肽。将小肽样品溶于复溶剂(2％乙腈/0.1％甲酸)中，上样。C18柱(3μm，75μm×150mm)用于分离小肽，柱温设置45℃，溶液A(2％乙腈/0.1％甲酸/98％H2O)和溶液B(98％乙腈/0.1％甲酸/2％H2O)作为流动相，流速300nL/min，梯度洗脱程序为0～4min96％A→94％A，4～100min 94％A→76％A，100～102min 76％A→60％A，102～105min60％A→20％A，105～110min 20％A，110～110.1min 20％A→95％A，110.1～120min95％A。采用高分辨率质谱分析方法，在连续正离子分辨质谱模式下，采用高碰撞能量捕获法，对柱内流出液进行质谱分析。设置质谱条件：毛细管电压3.0kV；温度120℃；采样锥60V；反溶剂温度350℃；流速50L/h；反溶剂气体流速500L/h。信号采集，扫描在250ms内获得，以50ms/次进行扫描。在350-1500m/z范围内采集MS1光谱，在100-1500m/z范围内采集MS2光谱。
4、小肽生物信息学分析：利用ProteinLynx ProteinPilot软件分析质谱原始数据，自动计算色谱峰宽和质谱峰宽分辨率。利用Paragon Algorithm算法结合ProteinPilot与TAIR蛋白数据库检索蛋白。将蛋白序列比对到Gene Ontology Terms(http://geneontology.org/)数据库，鉴定蛋白的功能。利用NCBI“blastp”蛋白同源比对将以鉴定蛋白注释到TAIR protein database数据库。利用KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)对所鉴定蛋白进行通路分析。利用COG数据库(Clusters of Orthologous Groups ofProteins System，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)进行基因的功能注释。通过SignalP5.0在线软件分析所鉴定小肽是否含有信号肽剪切位点。
因此，为了避免不必要的较大蛋白质碎裂的干扰，通过使用植物原生质体代替植物组织的提取蛋白质以及小肽可以得到假阳性率更高的小分子信号肽。将拟南芥叶片用纤维素酶和果胶酶消化后，除去细胞壁，其原生质体被释放。通过低速离心收集沉淀中的原生质体。当重悬于PBS缓冲液中时，原生质体因渗透压不平衡而破裂，释放出细胞内容物，包括蛋白质和小肽。结果如图3所示，1g鲜叶产生约4.55×107个细胞/原生质体，如图3A所示。基于原生质体的提取的每克叶子总蛋白质产量为1.65μg。与传统的超声辅助机械破碎组织提取蛋白(tissue sample，TS)相比，虽然原生质体中提取的总蛋白质(protoplast sample，PS)含量略有下降，但两种提取方法中肽的百分比差异不大。考虑到原生质体更利于保持蛋白与小肽的完整性，通过原生质体提取小肽更有利于后续鉴定分析。
将对照例中组织样本(Tissue Sample，TS)和实施例中的原生质体样本(Protoplast Sample，PS)中提取的小肽TripleTOF 5600plus质谱串联仪结合EksigentnanoLC液相系统进行鉴定。鉴定的肽段通过ProteinPilot整合的TAIR蛋白质数据库进行分析数据。以鉴定的肽作为“查询序列”，从TAIR蛋白质数据库中搜索并下载它们的前体序列，分析鉴定的肽及其前体的长度，结果如图4所示。已知成熟的SSPs分子量比较小，一般少于20个氨基酸残基，并且其前体也相对较短，一般不超过200个氨基酸残基。总体而言，基于原生质体的提取肽段分子量小的肽段含量比传统提取肽段中小分子肽占比高。在TS中包含少于200个氨基酸残基的前体为21.05％，但在PS中为41.46％。因此，这些结果表明可以从原生质体中鉴定出相对更多的潜在SSPs。
通过Clastalx比对鉴定的肽及其前体的序列，根据同源性对鉴定的肽进行分类。结果表明，在TS中发现属于同一蛋白的肽段数量比在PS中更多。例如，在TS中属于同一前体蛋白的肽段数目最多59，而在PS中仅为16。推测，这些肽来源于较大蛋白质肽链的断裂，证明传统提取中的机械研磨产生了更多的肽片段。在基于原生质体的提取中，大多数前体蛋白包含少于3种肽，占85.37％，其中56.1％前体蛋白对应唯一小肽。此外，分析已鉴定前体中潜在SSPs(前体链小于200aa)的百分比。显然，在PS中分离出更高比例的潜在SSPs，推测基于原生质体的提取有助于发现潜在的SSPs，是因为其温和的条件可以更好地确保蛋白质/肽的完整性。因此，通过本发明实施例方案能够有效地降低植物小分子信号肽的假阳性率。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、利用植物原生质体提取总蛋白，再将总蛋白超滤后，收集滤液，将滤液样品先经过还原再进行烷基化处理后，得到待测样品；
S2、利用液质联用仪对待测样品进行测定，并对测定后的数据进行分析；
其中，所述数据的分析过程包括以下步骤：
利用ProteinLynx ProteinPilot软件分析质谱原始数据，自动计算色谱峰宽和质谱峰宽；
利用Paragon Algorithm算法结合ProteinPilot与TAIR蛋白数据库检索蛋白；
利用SignalP5.0在线软件分析所鉴定小肽是否含有信号肽剪切位点。
2.根据权利要求1所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：数据分析操作还包括：将蛋白序列比对到Gene Ontology Terms数据库，鉴定蛋白的功能；
利用NCBI“blastp”蛋白同源比对将已鉴定蛋白注释到TAIR protein database数据库；
利用KEGG数据库对所鉴定蛋白进行通路分析；
利用COG数据库进行基因的功能注释。
3.根据权利要求1所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述步骤S1还包括通过以下步骤提取得到原生质体：取待提取材料，加入酶液反应完后过滤，收集滤液，离心后弃上清，沉淀即为原生质体；其中，所述酶液的制备方法为取含有质量分数为(0.5％～2％)的纤维素酶、质量分数为(0.05％～0.15％)的果胶酶、质量分数为(0.05％～0.15％)的离析酶和(0.3～0.6)mol/L甘露醇的溶液，在(50～60)℃下水浴(8～15)min冷却后加入氯化钙和BSA，所述氯化钙的终浓度为(0.05～0.15)mol/L和所述BSA在溶液中的质量百分数为(0.05％～0.15％)。
4.根据权利要求3所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：加酶液后的反应条件为：在室温下避光轻微摇动4h。
5.根据权利要求1所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述步骤S1中提取蛋白总样的操作具体为：用质量分数为(6～10)％的甘露醇溶液洗涤后，再用PBS重悬原生质体，加入PMSF混匀后离心，收集上清即为原生质体总蛋白。
6.根据权利要求1至5任一项所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述步骤S2利用液质联用仪进行检测过程中，液相色谱部分使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为2％乙腈/0.1％甲酸/98％H2O和流动相B为98％乙腈/0.1％甲酸/2％H2O。
7.根据权利要求6所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述检测过程包括通过梯度洗脱程序对肽段进行洗脱分离。
8.根据权利要求7所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述梯度洗脱程序为：0～4min 96％A～94％A，4～100min 94％A～76％A，100～102min 76％A～60％A，102～105min 60％A～20％A，105～110min 20％A，110～110.1min 20％A～95％A，110.1～120min95％A。
9.根据权利要求1至5任一项所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述质谱检测过程中，质谱条件为：毛细管电压3.0kV；温度120℃；采样锥60V；反溶剂温度350℃；流速50L/h；反溶剂气体流速500L/h；扫描在250ms内获得，以50ms/次进行扫描；在350-1500m/z范围内采集MS1光谱，在100-1500m/z范围内采集MS2光谱。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112185460A (zh) * 2020-09-23 2021-01-05 谱度众合(武汉)生命科技有限公司 一种异构数据不依赖型蛋白质组学质谱分析系统及方法
CN117589546A (zh) * 2024-01-19 2024-02-23 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种毛发裂解液及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120178149A1 (en) * 2009-09-22 2012-07-12 Medicago Inc. Method of preparing plant-derived vlps
CN104007053A (zh) * 2014-05-30 2014-08-27 湖南农业大学 检测拟南芥叶片细胞数目的方法
CN107192829A (zh) * 2017-05-18 2017-09-22 南京中医药大学 一种板蓝根蛋白质鉴定的方法
US20170332645A1 (en) * 2014-10-27 2017-11-23 Academia Sinica Plant defense signaling peptides and applications thereof
CN109536432A (zh) * 2018-09-30 2019-03-29 华南农业大学 一种稻瘟菌分泌蛋白的提取方法及应用shotgun技术研究其分泌蛋白质组的方法
US20190144874A1 (en) * 2017-11-16 2019-05-16 Bayer Cropscience Lp Paenibacillus-based endospore display platform, products and methods
CN110018256A (zh) * 2019-04-24 2019-07-16 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种鉴定稻米品质差异蛋白的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120178149A1 (en) * 2009-09-22 2012-07-12 Medicago Inc. Method of preparing plant-derived vlps
CN104007053A (zh) * 2014-05-30 2014-08-27 湖南农业大学 检测拟南芥叶片细胞数目的方法
US20170332645A1 (en) * 2014-10-27 2017-11-23 Academia Sinica Plant defense signaling peptides and applications thereof
CN107192829A (zh) * 2017-05-18 2017-09-22 南京中医药大学 一种板蓝根蛋白质鉴定的方法
US20190144874A1 (en) * 2017-11-16 2019-05-16 Bayer Cropscience Lp Paenibacillus-based endospore display platform, products and methods
CN109536432A (zh) * 2018-09-30 2019-03-29 华南农业大学 一种稻瘟菌分泌蛋白的提取方法及应用shotgun技术研究其分泌蛋白质组的方法
CN110018256A (zh) * 2019-04-24 2019-07-16 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种鉴定稻米品质差异蛋白的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LUO WEIGUI等: "Identification of Potential Auxin-Responsive Small Signaling Peptides through a Peptidomics Approach in Arabidopsis thaliana", 《MOLECULES》 *
LUO WEIGUI等: "Identification of Potential Auxin-Responsive Small Signaling Peptides through a Peptidomics Approach in Arabidopsis thaliana", 《MOLECULES》, vol. 24, no. 17, 29 August 2019 (2019-08-29), pages 2 *
TIM XING等: "PROTOPLAST AS A TOOL TO ADDRESS QUESTIONS IN PLANT PHYSIOLOGY", 《JOURNAL OF PLANT DEVELOPMENT》, vol. 25 *
白婷;张朝晖;严伟;徐世昌;潘映红;: "一种简易高效的小麦叶片胞间液蛋白提取方法的建立", 生物技术通报, no. 07 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112185460A (zh) * 2020-09-23 2021-01-05 谱度众合(武汉)生命科技有限公司 一种异构数据不依赖型蛋白质组学质谱分析系统及方法
CN112185460B (zh) * 2020-09-23 2022-07-08 谱度众合(武汉)生命科技有限公司 一种异构数据不依赖型蛋白质组学质谱分析系统及方法
CN117589546A (zh) * 2024-01-19 2024-02-23 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种毛发裂解液及其应用

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