CN117589546A - 一种毛发裂解液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种毛发裂解液及其应用；所述毛发裂解液包括裂解液A和裂解液B；所述裂解液A包括蛋白酶、表面活性剂、NaCl、防腐剂和磷酸缓冲液；所述裂解液B包括PMSF溶液。本发明的毛发裂解液，具有酶裂解时间短，裂解工艺简便，无需研磨设备等特点，可以从人体毛发样本中高效且充分地提取毒品目标物，其测试样本具有很好的敏感度和特异性，有效实现人体毛发痕量毒品快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种毛发裂解液及其应用。
背景技术
对毒品的检测，需要建立一系列准确、快速、高灵敏的检测方法。吸食毒品后，血液中的毒品及其代谢物成分经血液循环输送到毛囊，随着头发的生长，毒品分子会从发根往发梢迁移。毛发作为毒品的的特殊载体，取材方便，携带方便，易长期保存且可反映长时间吸毒的情况，因此毛发中毒品的分析已成为法庭科学和临床分析的研究热点。检测毛发中的毒品及其代谢物需要对毛发进行前处理，将毒品及其代谢物从毛发中释放出来，同时也要消除前处理过程中产生的假阳性干扰。
目前的毛发前处理技术主要包括有机溶剂超声法、酸解、碱解和酶解等。有机溶剂超声法一般是使用甲醇、乙醇、乙腈等为溶剂、辅以超声振荡手段提取毛发中的毒品分子，其存在环境污染、操作复杂、提取时间长、释放不完全等问题。酸水解的条件较为温和，适用范围较广，操作相对简便，但耗时长，且对于部分毒品分子（如可卡因、6-单乙酰吗啡）释放率较低。而碱水解法条件剧烈，可以将毛发完全消化和溶解，使毛发中的苯丙胺类毒品完全释放，但所含的杂质相对比较多，且容易使结构不稳定的化合物在强碱条件下发生降解。酶解反应条件温和，且专一性强，中国专利申请CN110208072A公开了一种用于痕量毒品检测的人体毛发快速裂解液，使用碱性蛋白酶AH-101配合巯基乙酸对毛发中的角蛋白进行分解，同时加入二硫苏糖醇（DTT）作为二硫键的还原剂且增加碱性蛋白酶活性，从而可以充分裂解角蛋白，提高裂解速率和毒品释放率；但该配方中的DTT成分常温下易被氧化，储存条件较为苛刻（要求低温保存），存储不当容易影响使用效果，且该裂解液在使用时需要超声震荡作为辅助手段，操作复杂。中国专利申请CN112213491A公开了一种包含裂解液A和B的毛发消化液，该配方采用在碱性条件下酶裂解后进行酸中和工艺提取毛发中的毒品，但由于A液pH值较高会抑制蛋白酶K及角蛋白酶的活性，从而导致裂解不充分，且含DTT的氢氧化钠溶液长期保存会产生沉淀导致溶液的pH发生变化，可能会影响毛发的裂解效率。现有的毛发裂解液仍存在裂解时间长、释放率较低等问题，通常需要将毛发样本剪段（1~2cm）后使用研磨仪研磨粉碎，以增大毛发样本和裂解液的接触面积，提高裂解效率和毒品释放率。工序繁琐，需配套研磨设备。
因此开发一种简便高效、灵敏高、稳定性好的裂解液对人体毛发样本中的毒品小分子进行充分提取已成为当前毛发中毒品快速检测首要的技术难题。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种毛发裂解液及其应用，可以快速地从人体毛发样本中提取毒品小分子，操作简便，无需研磨设备即能实现高效裂解，毒品释放率高，且检测准确度高。
本发明的目的可通过下述技术方案实现：
一种毛发裂解液，包括裂解液A和裂解液B；所述裂解液A包括蛋白酶、表面活性剂、NaCl、防腐剂和磷酸缓冲液；所述裂解液B包括PMSF（苯甲基磺酰氟）溶液。
优选的，所述的裂解液A包括0.04~0.7mg/mL蛋白酶、0.05wt%~2wt%表面活性剂、0.85wt%~4wt%NaCl、0.05wt%~0.1wt%防腐剂和20~100mM磷酸缓冲液；
进一步优选的，所述的裂解液A包括0.1~0.3mg/mL蛋白酶、0.5wt%~1.5wt%表面活性剂、0.85wt%~3wt% NaCl、0.05wt%~0.1wt% 防腐剂和50~100mM磷酸缓冲液。
本发明mg/mL指蛋白酶在裂解液A中的质量浓度，表示1mL裂解液A中含有蛋白酶的质量；本发明的wt%为质量百分比，表示对应组分占裂解液A的质量百分比；本发明的mM为磷酸缓冲液的摩尔浓度，mM为毫摩尔每升。
优选的，所述裂解液B包括质量浓度为0.25%~2%的PMSF溶液；
进一步优选的，所述裂解液B包括质量浓度为0.25%~0.5%的PMSF溶液。
优选的，所述的蛋白酶选自蛋白酶K、角蛋白酶中的至少一种。
进一步优选的，所述裂解液A中，蛋白酶K为0.02~0.5mg/mL，角蛋白酶为0.02~0.2mg/mL。
更优选的，所述裂解液A中，蛋白酶K为0.05~0.2mg/mL，角蛋白酶为0.05~0.1mg/mL。
优选的，所述防腐剂选自Proclin-300；
优选的，所述表面活性剂选自PVP、TritonX-100中的至少一种。
优选的，所述表面活性剂为PVP和TritonX-100，其中，PVP和TritonX-100的质量比为（10-50）：1。
进一步优选的，所述PVP的K值为10~30。
更优选的，所述PVP的K值为30。
优选的，所述磷酸缓冲液的pH为7.2~7.6；
进一步优选的，所述磷酸缓冲液的pH为7.3~7.5。
优选的，所述PMSF溶液的溶剂为有机溶剂；
进一步优选的，所述PMSF溶液的溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的至少一种。
优选的，在使用时裂解液A和裂解液B的用量体积比为19~39：1。
本发明还提供所述的毛发裂解液在人体毛发中毒品检测的应用。人体毛发包括头发、阴毛、腋毛、胸毛或腿毛等。
本发明提供一种所述毛发裂解液的使用方法，包括以下步骤：
取裂解液A加入毛发样本中，摇匀后静置反应5~10min；反应完成后再加入裂解液B，摇匀，吸取上清液3~5滴，加入毒品免疫层析检测卡的加样孔中进行检测。
优选的，所述毛发样本取样部分为距离发根端3cm左右，经物理剪碎为0.1~0.5cm片段。
优选的，所述的裂解液A的用量为800~1000µL体积裂解液A添加20mg毛发样本。
优选的，所述裂解液A与裂解液B的用量体积比为19~39:1。
本发明有益效果在于：
（1）本发明的毛发裂解液，具有酶裂解时间短（裂解时间缩短至5~10min），裂解工艺简便，无需研磨设备等特点，可以从人体毛发样本中高效且充分地提取毒品小分子，实现人体毛发痕量毒品快速检测。
（2）本发明的毛发裂解液，其测试样本的敏感度和特异性均较好，其中吗啡和甲基安非他明项目阴性符合率均为100%，吗啡、甲基安非他明阳性符合率均≥90%。
（3）本发明的毛发裂解液，稳定性高，经加速稳定性试验验证，其可直接在自然条件下储存，保质期两年。
（4）本发明的裂解液A和裂解液B（PMSF溶液）配合使用，毒品检测结果的假阳性率可明显降低；采用含PVP K30的裂解液A，毛发中的毒品裂解效率更高，可进一步降低检测结果的偏差。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和特点更加清楚，下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
毛发裂解液的配制及测试步骤
（1）按以下配方配制不同含量的毛发裂解液
配方1：裂解液A包括0.05mg/mL蛋白酶K、0.05mg/mL角蛋白酶、0.5wt%PVP K30、0.02wt%TritonX-100、0.85wt%NaCl、0.05wt%Proclin-300、50mM磷酸缓冲液（PB，pH7.3弱碱性磷酸缓冲液）；裂解液B包括99.75wt%异丙醇、0.25wt%PMSF。
配方2：裂解液A包括0.2mg/mL蛋白酶K、0.1mg/mL角蛋白酶、1wt%PVP K30、0.05wt%TritonX-100、3wt%NaCl、0.1wt%Proclin-300、100mM磷酸缓冲液（PB，pH7.5弱碱性磷酸缓冲液）；所述的裂解液B包括99.5wt%异丙醇、0.5wt%PMSF。
配方3：裂解液A包括0.1mg/mL蛋白酶K、0.1mg/mL角蛋白酶、0.5wt%PVP K30、0.05wt%TritonX-100、0.85wt%NaCl、0.1wt%Proclin-300、50mM磷酸缓冲液（PB，pH7.4弱碱性磷酸缓冲液）；裂解液B包括99.5wt%异丙醇、0.5wt% PMSF。
配方4：裂解液A包括0.1mg/mL蛋白酶K、0.1mg/mL角蛋白酶、0.5wt%PVP K10、0.05wt%TritonX-100、0.85wt%NaCl、0.1wt%Proclin-300、50mM磷酸缓冲液（PB，pH7.4弱碱性磷酸缓冲液）；裂解液B包括99.5wt%异丙醇、0.5wt% PMSF。
（2）分别取上述裂解液A 800µL加入20mg经物理剪碎的0.1~0.5cm毛发，摇匀后静置反应5~10min；
（3）反应完后分别向裂解毛发的A液中加入25µL裂解液B，A液与B液体积比为32:1，摇匀后用吸管吸取上清液3~5滴（约85µL），加入检测卡的加样孔中，重复加样测试2次取平均值；
（4）加样10min后，将检测卡（吗啡、冰毒联合测定试剂盒（AIE荧光免疫层析法），批号：2022060601，下同）插入检测槽中，点击“快速检测”，毒品痕量分析仪（型号：FIC-Q1，下同）将自动进行检测。测试结果如表1~4所示（单位ng/mg）。
表1：1例吗啡阳性样本检测结果
表2：1例甲基安非他明阳性样本检测结果
表3：1例阴性样本吗啡检测结果
表4：1例阴性样本甲基安非他明检测结果
根据检测结果可知，配方3测试结果最佳。以下各实施例中所用裂解液按照配方3配制，对配方3进行样本测试与稳定性验证。
实施例2
毛发裂解液的配制及测试步骤
（1）按配方3配制毛发裂解液
配方3：裂解液A包括0.1mg/mL蛋白酶K、0.1mg/mL角蛋白酶、0.5wt%PVP K30、0.05wt%TritonX-100、0.85wt%NaCl、0.1wt%Proclin-300、50mM磷酸缓冲液（PB，pH7.4弱碱性磷酸缓冲液）；裂解液B包括99.5wt%异丙醇、0.5wt% PMSF。
（2）分别取上述裂解液A 800~1000µL（具体用量见步骤3）加入20mg经物理剪碎的0.1~0.5cm毛发，摇匀后静置反应5~10min；
（3）反应完后分别按以下比例向裂解毛发的A液中加入对应的裂解液B，摇匀后用吸管吸取上清液3~5滴（约85µL），加入检测卡的加样孔中，重复加样测试2次取平均值；
比例1：A液：855µL，B液：45µL，裂解液A：裂解液B=19:1；
比例2：A液：975µL，B液：25µL，裂解液A：裂解液B=39:1；
比例3：A液：825µL，B液：55µL，裂解液A：裂解液B=15:1；
比例4：A液：800µL，B液：20µL，裂解液A：裂解液B=40:1；
比例5：A液：975µL，不加裂解液B；
（4）加样10min后，将检测卡插入检测槽中，点击“快速检测”，毒品痕量分析仪将自动进行检测。测试结果如表5~8所示（单位ng/mg）。
表5：1例吗啡阳性样本检测结果
表6：1例甲基安非他明阳性样本检测结果
表7：1例阴性样本吗啡检测结果
表8：1例阴性样本甲基安非他明检测结果
根据检测结果可知，比例3和4的测试结果偏差较大，比例5不加B液出现假阳，比例1与比例2测试结果最佳，因此，优化A液与B液体积比为19~39:1。为简化操作，实际应用样本裂解液A添加800µL，加入1~2滴（约25µL）样本裂解液B。
实施例3
涉毒人员头发中吗啡（MOP)与甲基安非他明(MET)毒品的检测
（1）样本获取：按《涉毒人员毛发样本检测规范》从检测人毛发距离发根端3cm左右采集。
（2）称取20mg毛发样本，使用剪刀将毛发剪成约0.1~0.5cm小段，加入到含800µL样本裂解液A（配方3）的A管中，摇匀使毛发尽量浸入裂解液中，静置5min，再向A管中加入1~2滴样本裂解液B（配方3），摇匀后备检。
（3）开启毒品痕量分析仪，插入吗啡、甲基安非他明二联试剂盒对应批号的ID芯片，仪器读取试剂盒的标曲数据。
（4）用吸管吸取上述（2）中备检的样本上清液3~5滴（约85µL）加入到检测卡的加样孔中；重复加样测试2次取平均值。
（5）加样10min后，将检测卡插入检测槽中，点击“快速检测”，毒品痕量分析仪将自动进行检测。
（6）毒品痕量分析仪检测完成后，从仪器上读取/打印检测结果。测试结果如表9~12所示（单位：ng/mg）。
表9：40例吗啡阳性样本检测结果
表10：40例甲基安非他明阳性样本检测结果
表11：40例阴性样本吗啡检测结果
表12：40例阴性样本甲基安非他明检测结果
根据检测结果可知，40例吗啡阳性样本的阳性符合率为90.00%，40例甲基安非他明阳性样本的阳性符合率为92.50%，40例阴性样本的阴性符合率均为100.00%。
实施例4
一种用于痕量毒品检测的人体毛发裂解液的加速稳定性验证。
验证制备的裂解液的加速稳定性，其步骤如下：
（1）将上述所配的裂解液A、裂解液B（配方3）进行常温放置0天和50℃放置14天、20天、40天、60天测试。
（2）分别测试吗啡阳性毛发、甲基安非他明阳性毛发、阴性毛发各1例，称取对应样本20mg毛发样本，使用剪刀将毛发剪成约0.1~0.5cm小段，加入到含800µL样本裂解液A（配方3）的A管中，摇匀使毛发尽量浸入裂解液中，静置5min，再向A管中加入1~2滴样本裂解液B（配方3），摇匀后备检。取3~5滴（约85µL）裂解后的溶液上清液加入到检测卡中；重复加样测试2次取平均值，10min后用荧光读数仪测试，记录测试结果（单位：ng/mg）。
（3）计算阴阳符合率。测试结果如表13~15所示：
表13：裂解液A与B加速稳定性的吗啡阳性样本检测结果
表14：裂解液A与B加速稳定性的甲基安非他明阳性样本检测结果
表15：裂解液A与B加速稳定性的阴性样本检测结果
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根据检测结果可知，裂解液A与裂解液B放置50℃加速至60天后，阴阳符合率均为100%。根据Arrhenius模型及医疗器械加速老化实验确定有效期的基本原则和方法，表明该毛发裂解液试剂室温可保存两年。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种毛发裂解液，其特征在于，包括裂解液A和裂解液B；所述裂解液A包括蛋白酶、表面活性剂、NaCl、防腐剂和磷酸缓冲液；所述裂解液B包括PMSF溶液。
2.根据权利要求1所述的毛发裂解液，其特征在于，所述的裂解液A包括0.04~0.7mg/mL蛋白酶、0.05wt%~2wt% 表面活性剂、0.85wt%~4wt%NaCl、0.05wt%~0.1wt%防腐剂和20~100mM 磷酸缓冲液；所述裂解液B包括质量浓度为0.25%~2%的PMSF溶液。
3.根据权利要求1所述的毛发裂解液，其特征在于，所述的裂解液A包括0.1~0.3mg/mL蛋白酶、0.5wt%~1.5wt%表面活性剂、0.85wt%~3wt% NaCl、0.05wt%~0.1wt% 防腐剂和50~100mM磷酸缓冲液；所述裂解液B包括质量浓度为0.25%~0.5%的PMSF溶液。
4.根据权利要求1所述的毛发裂解液，其特征在于，所述的蛋白酶选自蛋白酶K、角蛋白酶中的至少一种；所述防腐剂选自Proclin-300；所述表面活性剂选自PVP、TritonX-100中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的毛发裂解液，其特征在于，所述表面活性剂为PVP和TritonX-100，其中，PVP和TritonX-100的质量比为（10-50）：1。
6.根据权利要求5所述的毛发裂解液，其特征在于，所述PVP的K值为10~30。
7.根据权利要求1所述的毛发裂解液，其特征在于，所述磷酸缓冲液的pH为7.2~7.6。
8.根据权利要求1所述的毛发裂解液，其特征在于，所述PMSF溶液的溶剂为有机溶剂；所述PMSF溶液的溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的毛发裂解液，其特征在于，在使用时裂解液A和裂解液B的用量体积比为19~39：1。
10.权利要求1~9任一项所述的毛发裂解液在人体毛发中毒品检测的应用。
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| CN202410083875.6A CN117589546A (zh) | 2024-01-19 | 2024-01-19 | 一种毛发裂解液及其应用 |
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