CN101458238A

CN101458238A - 一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法

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Publication number: CN101458238A
Application number: CNA2008100418337A
Authority: CN
Inventors: 刘罡一; 张梦琪; 陆川; 李水军; 贾晶莹; 余琛
Original assignee: XUHUI DISTRICT CENTRAL HOSPITAL SHANGHAI
Current assignee: XUHUI DISTRICT CENTRAL HOSPITAL SHANGHAI
Priority date: 2008-08-19
Filing date: 2008-08-19
Publication date: 2009-06-17
Anticipated expiration: 2028-08-19
Also published as: CN101458238B

Abstract

一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法，依次包括(1)毛发样品前处理：高温碱水解、有机溶剂萃取、再用酸水反萃取；(2)以浓度为5－500ng/ml的氘代克仑特罗－D9水溶液为内标，以液相色谱－串联质谱法检测毛发中克仑特罗残留量。本发明的优点是：1.采用毛发作为检材采样容易、保存方便、可重复取样、具有简单、快速、微量、高效的优点。2.毛发样品前处理方法进行了优化，缩短了前处理时间，简化了处理步骤，明显降低了成本。3.以同位素化合物为内标，采用液相色谱－串联质谱法为检测仪器，最低检出限达0.01ng/g，最低定量限为0.5ng/g，具有准确可靠的定性与定量检测克仑特罗的能力，可作为大样本的筛查或者小样本的确证工具。

Description

一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法

技术领域

本发明涉及一种毛发中克仑特罗残留量的检测方法，尤其涉及一种利用氘代克仑特罗为内标，以液相色谱-串联质谱法(简称LC-MS/MS法)定量检测毛发中克仑特罗残留量方法。

背景技术

克仑特罗(Clenbuterol)可明显促进动物生长，改善动物体内脂肪分配增加瘦肉率，故俗称“瘦肉精”。基于临床食用动物内脏而导致的克仑特罗中毒事件的不断发生，世界各国普遍禁止在饲料中添加克仑特罗类药物。1997年以来我国已多次明令禁止畜牧行业使用克仑特罗，但各地中毒事件仍频有发生，说明非法使用克仑特罗现象依然存在，食品安全的监管力度尚有待加强。

目前克仑特罗残留量的常用测定方法包括酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。ELISA因操作简便、检测迅速、成本低廉，通常作为筛选法用于动物组织或者尿液中的残留筛查，其缺点是灵敏度低，而且假阳性率高。GC-MS可用于多残留情况下的定性、定量分析，与HPLC和CE相比，具有更高的灵敏度和特异性，因此，我国将CG—MS法定为检测克仑特罗的确证性方法。其缺点是样品需要衍生化、处理过程烦琐、检测时间长。

克仑特罗能特异地与毛发中的色素牢固结合，且残留量大、消除缓慢、维持时间长。即使在较长的停药期下，克仑特罗在毛发中的残留仍能被检出。如牛在停服瘦肉精(0.8μg/kg，2次/日，共10天)60天后，从其毛发中仍能检出瘦肉精。以毛发作为检材，较其他组织、血液和尿液等更可靠，并具有采样方便、非损伤性特点，有利于实现屠宰前连续动态监测，故毛发被认为是检测盐酸克仑特罗非法使用最好的样品。

在2003年公布的地方标准DB33/T 455-2003《动物毛发中盐酸克仑特罗的检测方法》中，采用乙酸乙酯液-液萃取和固相萃取相结合的方法，提取毛发碱水解液中的克仑特罗后供酶联免疫和气质联用(GC-MS)测定，检测限为8.0ng/g。该方法的检测的灵敏度和专一性有限，样品预处理过程烦琐费时(仅固相萃取就约需要2个小时)，可操作性较差，难以应对大批量的毛发样品监测任务。

LC-MS/MS法兼有液相色谱良好的分离能力和串联质谱灵敏特异的检测能力，是近年来迅速发展的检测技术，但在毛发样品中检测克仑特罗残留量未见报道。

现有克仑特罗检测技术大多存在采样不便、样品处理过程复杂、样品处理成本较高、检测灵敏度和特异性低等不足，限制了克仑特罗残留检测在我国食品安全供给保障体系中的作用，因此研究选择方便可靠的检材、简单快速的样品前处理方法及准确有效的检测手段具有非常重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于，鉴于当前食品安全供给保障体系建设的迫切需求及现有克仑特罗检测方法的不足，提供一种准确可靠、灵敏度高，可适用于大批量毛发样品中克仑特罗残留量检测的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。

本发明的另一目的在于提供简单快速、成本较低的毛发样品前处理方法。

为达到上述目的，采用的技术方案是：一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法，其特征在于：依次包括(1)毛发样品前处理：高温碱水解、有机溶剂萃取、再用酸水反萃取；(2)以浓度为5-500ng/ml的氘代克仑特罗-D9水溶液为内标，以液相色谱-串联质谱法检测毛发中克仑特罗残留量。

所述毛发样品前处理是指：毛发样品用清洗溶剂清洗，晾干，剪碎；取适量毛发，加所述内标溶液，再加入碱溶液在高温下使毛发水解，然后加入固体盐盐析和有机溶剂旋涡混合提取，离心分层，取有机层用酸水反萃取，再离心分层后，取水层作液相色谱-串联质谱法进样样品。

所述毛发清洗剂是水和甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷或稀盐酸。

所述水解用碱溶液是氢氧化钠、或氢氧化钾、或氨水，浓度为0.5-5mol/L，水解温度为60-100℃，加热2min-1h。

所述固体盐是Na₂SO₄、或NaCl；所述有机溶剂是乙醚、乙酸乙酯、特丁基甲醚、二氯甲烷、氯仿中的一种；所述反萃取的酸水溶液是甲酸或乙酸，浓度为0.5-5％(v/v)。

所述液相色谱法的流动相由流动相A和流动相B组成，pH为1-7，流速为0.3ml/min。其中流动相A为甲醇或乙腈，流动相B为水，或者所述在流动相A和流动相B中分别添加体积浓度为0.02-0.5％的甲酸、或分别添加0.02-0.5％乙酸或分别添加0.02-0.5％三氟乙酸；分析柱采用硅胶键合相填料柱，包括C18，C8，氰基、苯基等类型的分析柱，内径为1.0-5.0mm，长度为30-250mm；洗脱方法有等度洗脱或梯度洗脱，等度洗脱时的流动相比例为A 15-75％，B 25-85％；梯度洗脱时的流动相比例随洗脱时间梯度变化，可根据不同类型的分析柱进行设计和调整。对于C18柱，当A为乙腈，B为0.1％(体积)甲酸水溶液时，可参考表1方法进行：

表1 梯度洗脱时流动相A+B体积比例

所述质谱检测法检测，电喷雾离子源，正离子扫描；雾化气(GAS1)：50，辅助加热气(GAS2)：50，气帘气(CUR)：30，碰撞气(CAD，N2)：Medium，离子源电压(IS)：5500V，离子源温度(TEM)：550℃。克仑特罗的定量离子通道为277.1→202.9amu，定性离子通道为277.1→168.0和277.1→132.1amu，内标的离子通道为286.1→204.1amu。各离子通道的质量范围可±1.0amu。

最后按内标法以峰面积或峰高法，计算克仑特罗在毛发中的残留量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益结果：

1.本发明采用毛发作为检材测定克仑特罗的残留，具有简单、快速、微量、高效的优点。不但采样容易、保存方便、可重复取样、非损伤性，更重要的是毛发可以不断生长，可以动态监测瘦肉精非法滥用的历程，为保障食品安全提供有力的武器。

2.本发明对样品前处理方法进行了优化，采用高温碱水解破坏毛发结构的方法，大大缩短了样品前处理的时间；毛发样品经有机溶剂提取后直接用酸水反萃取，无需进一步溶剂吹干或者固相萃取等步骤，不仅使处理步骤简化，而且减少了提取过程中溶剂的消耗量和避免使用比较昂贵的固相萃取装置，因而明显降低了成本。

3.本发明以同位素化合物为内标，采用特异性强、灵敏度高、检测通量大的液相色谱-串联质谱法为检测仪器。本法的克仑特罗分析测定的最低检出限达0.01ng/g(检测信噪比≥3)，最低定量限为0.5ng/g，远低于现行行业标准中酶联免疫和气质联用(GC-MS)的检测限8.0ng/g。在0.5-200ng/g的浓度范围内，克仑特罗呈良好的线性关系(r>0.9990)。准确度为90-110％，精密度<5％，回收率>95％。故本发明具有准确可靠的定性与定量检测克仑特罗的能力，可作为大样本的筛查或者小样本的确证工具。

附图说明：

图1A～图1D为等度洗脱毛发样品中克仑特罗和内标的色谱图；

图2A～图2D为梯度洗脱毛发样品中克仑特罗和内标的色谱图。

其中：A为毛发空白样品中克仑特罗的色谱图；B为毛发空白样品中内标的色谱图；C为最低定量限(0.5ng/g)克仑特罗色谱图；D为最低定量限(0.5ng/g)内标的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但并不限制本发明。

一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法，依次包括：

(1)毛发样品前处理：高温碱水解、有机溶剂萃取、再用酸水反萃取；

(2)以浓度为5-500ng/ml的氘代克仑特罗-D9水溶液为内标，以液相色谱-串联质谱法检测毛发中克仑特罗残留量。

实施例中所用试剂盐酸克仑特罗(纯度99.9％)来源于中国药品生物制品检定所；盐酸克仑特罗-D9(内标，纯度98％)来源于TorontoRe search Chemical Inc；乙腈和甲酸来源于美国Tedia试剂公司；其他试剂为分析纯，水为自制双蒸馏水。

实施例中所用仪器3200 QTRAP LC-MS/MS串联质谱仪(美国应用生物系统公司)，Analyst 1.4.1分析软件；岛津系列液相色谱仪(日本岛津公司)，由LC-20AD液相泵、SIL-HTc自动进样器和在线脱气仪组成。

实施例1 猪毛样品前处理方法

将1例阴性空白猪毛和从某屠宰厂疑似喂养过瘦肉精的生猪上收集到的3例阳性猪毛，毛发样品分别用水和甲醇清洗，在室温下晾干，然后剪碎至2-3mm的片段。取50mg毛发至离心管中，加25ng/ml内标工作液50μl和2mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，旋涡混合1min，90℃水浴加热10min，取出，加入过量的Na2SO4固体，混匀，加入2.5ml乙醚，涡旋5min，15,000×g离心10min；吸取上层有机相，加入2％(v/v)甲酸溶液100μl，涡旋5min，15,000×g离心10min；吸取下层水相，转移至进样瓶进样。

实施例2 猪毛样品的另一前处理方法

另取实施例1中的阴性空白猪毛1例和阳性猪毛3例，分别用水和二氯甲烷清洗，在室温下晾干，然后剪碎至2-3mm的片段。取50mg毛发至离心管中，加25ng/ml内标工作液50μl，和1ml浓度为1mol/L氢氧化钾溶液，旋涡混合1min，65℃水浴加热15min，取出，加入过量的NaCl固体，混匀，加入2ml特丁基甲醚，涡旋5min，15,000×g离心10min；吸取上层有机相，加入100μl 5％(v/v)乙酸溶液，涡旋5min，15,000×g离心10min；吸取下层水相，转移至进样瓶进样。

实施例3 猪毛样品的又一前处理方法

再另取实施例1中的阴性空白1例和阳性猪毛3例，分别用水和0.01mol/L稀盐酸清洗，在室温下晾干，然后剪碎至2-3mm的片段。取50mg毛发至离心管中，加25ng/ml内标工作液50μl，1ml浓氨溶液(25-28％，v/v)，旋涡混合1min，90℃水浴加热15min，取出，加入过量的Na₂SO₄固体，混匀，加入2ml二氯甲烷，涡旋5min，15,000×g离心10min；吸取上层有机相，加入200μl 0.5％(v/v)甲酸溶液，涡旋5min，15,000×g离心10min；吸取下层水相，转移至进样瓶进样。

经实施例1、2、3三种猪毛样品处理方法处理的样品，用本发明液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等度洗脱法检测毛发样品的克仑特罗残留量，测定结果进行比较，并计算回收率，结果如表2所示。

表2 猪毛样品不同前预处理方法的回收率

结论：采用上述三种不同的样品前处理方法，样品测定结果RSD小于5％，说明本发明所述的毛发样品前处理方法均可完全将毛发中克仑特罗提取出来，获得稳定可靠的结果。

实施例4 等度洗脱液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测毛发样品的克仑特罗残留量

(1)贮备液用甲醇分别配制含1.0mg/ml的克仑特罗和含0.1mg/ml的克仑特罗-D9贮备液。用乙腈∶水为5∶95(v/v)将克仑特罗贮备液稀释成5，10，50，200，1000，2000ng/ml的标准工作液，和5，15，800，1600ng/ml质控品工作液。用水将克仑特罗-D9贮备液稀释成浓度为25ng/ml的内标工作液。上述贮备液和工作液在2-8℃保存。

(2)毛发样品配制取克仑特罗工作液，与剪碎的经预处理的空白毛发样品混合，配制含0.5，1，5，20，100，200ng/g克仑特罗的毛发样品为标准曲线；同样方法配制含0.5，1.5，80，160ng/g克仑特罗的毛发为质控样品。

待测样品按实施例1或2或3方法前处理方法处理后，转移至进样瓶进样。

(3)色谱条件

分析柱为XBridge Phenyl(150×2.1mm，5μm，Waters)；C18保护柱(4.0×3.0mm，5μm，Phenomenex)。流动相A：含0.1％(v/v)甲酸的乙腈，流动相B：含0.1％(v/v)甲酸的水；比例A:B为35:65，流速为0.3ml/min。

(4)质谱条件

电喷雾离子源，正离子扫描；雾化气(GAS1)：50，辅助加热气(GAS2)：50，气帘气(CUR)：30，碰撞气(CAD，N2)：Medium，离子源电压(IS)：5500V，离子源温度(TEM)：550℃。定量和定性离子对如表3所示：

表3.克仑特罗和内标的离子通道和主要的仪器参数

DP：去簇电压，EP：入口电压，CE：碰撞能量，CXP：出口电压。

(5)工作曲线

记录克仑特罗和内标的峰面积或峰高。采用标准曲线法，以添加浓度为X轴，克仑特罗/内标的峰面积或峰高比值为Y轴，进行线性回归，按1/X权重得到回归方程，计算克仑特罗在毛发中的含量。

(6)准确度，精密度，回收率

连续3批测定4种浓度的质控样品，每批重复6次，计算批内、批间精密度和准确度。精密度以质控样品测定值的相对标准差(％RSD)表示，准确度以测定值的平均值与添加浓度的百分比(％)表示。测定质控样品的峰面积，与未经提取的相同浓度的样品的峰面积比较，计算提取回收率(％)。

表4 克仑特罗的批内、批间精密度和准确度

表4显示了3批质控品的批内、批间精密度和准确度的测定结果。本方法的批内RSD小于2.8％，批间RSD小于3.6％，相应的准确度分别为94.4-102.4％和95.5-101.3％。

表5 毛发中克仑特罗的提取回收率

表5显示，在低(1.5ng/g)、中(80ng/g)、高(160ng/g)的质控浓度下，克仑特罗的平均回收率分别为96.6％、100.3％和101.9％，内标的回收率为100.5％。

(7)检测结果

在上述的色质谱分析条件下，克仑特罗和内标的典型保留时间为2.7min，总分析时间为3.5min，代表性色谱图见图1。其中空白毛发的色谱图如图1A所示，在克仑特罗和内标的出峰时间，未见内源性干扰存在。本方法的最低定量限(LL0Q)达0.5ng/g，其色谱图如图1B所示，检测信噪比(S/N)大于10。

在0.5-200ng/g的浓度范围内，克仑特罗呈良好的线性关系，线性相关系数r大于0.9990，3批标准曲线结果如表6所示。

表6 克仑特罗的线性测定结果

实施例5：梯度洗脱条件下的色谱行为

采用分析柱为Capce1l C18(100×2.1mm，5μm，Shiseido)；C18保护柱(4.0×3.0mm，5μm，Phenomenex)。流动相A：含0.1％甲酸的乙腈，流动相B：含0.1％甲酸的水；按表1所列梯度洗脱时流动相A:B体积比例程序梯度洗脱，总分析时间为7min，流速为0.3ml/min。样品处理和质谱条件同实施例1。在该色谱条件下，克仑特罗和内标的保留时间为2.2min，色谱图见图2。

图1和图2分别显示了等度洗脱和梯度洗脱条件下，毛发样品中克仑特罗和内标的色谱图，由图可见：克仑特罗与内标的出峰时间，空白样品在相应时间无干扰。

Claims

1.一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法，其特征在于：依次包括(1)毛发样品前处理：高温碱水解、有机溶剂萃取、再用酸水反萃取；(2)以浓度为5-500ng/ml的氘代克仑特罗-D9水溶液为内标，以液相色谱-串联质谱法检测毛发中克仑特罗残留量。

2.根据权利要求1所述一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法，其特征在于：所述毛发样品前处理方法是：毛发样品用清洗溶剂清洗，晾干，剪碎；取适量毛发，加所述内标溶液，再加入碱溶液在高温下使毛发水解；然后加入固体盐盐析和有机溶剂旋涡混合提取，离心分层，取有机层用酸水反萃取，再离心分层后，取水层作液相色谱-串联质谱法进样样品。

3.根据权利要求2所述一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法，其特征在于：所述毛发清洗剂是水和甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷或稀盐酸。

4.根据权利要求2所述一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法，其特征在于：所述水解用碱溶液是氢氧化钠、或氢氧化钾、或氨水，浓度为0.5-5mol/L，水解温度为60-100℃，加热2min-1h。

5.根据权利要求2所述一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法，其特征在于：加入的所述固体盐是Na₂SO₄、或NaCl；所述有机溶剂是乙醚、乙酸乙酯、特丁基甲醚、二氯甲烷、氯仿中的一种；所述酸水反萃取中的酸是甲酸或乙酸，浓度为0.5-5％(v/v)。

6.根据权利要求1所述一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法，其特征在于：所述液相色谱法流动相：由流动相A和流动相B组成，pH为1-7，流速为0.3ml/min，其中流动相A为甲醇或乙腈，流动相B为水，或者在所述流动相A和流动相B中分别添加体积浓度为0.02-0.5％的甲酸、或分别添加0.02-0.5％的乙酸，或分别添加0.02-0.5％的三氟乙酸；分析柱：采用硅胶键合相填料柱，包括C18，C8，氰基、苯基等类型的分析柱，内径为1.0-5.0mm，长度为30-250mm；洗脱方法：等度洗脱或梯度洗脱，等度洗脱时的流动相比例为A15-75％，B25-85％；梯度洗脱时的流动相比例随洗脱时间梯度变化。

7.根据权利要求1所述一种检测毛发中克仑特罗残留量的方法，其特征在于：所述质谱检测法采用电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测(MRM)进行定量与定性分析，克仑特罗的定量离子通道为277.1→202.9amu，定性离子通道为277.1→168.0和277.1→132.1amu，内标的离子通道为286.1→204.1amu，各离子通道的质量范围可±1.0amu，按内标法以峰面积或峰高法，计算克仑特罗在毛发中的含量。