CN104820036A - 高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法，包括以下步骤：步骤1：取饲料样品，加入到缓冲溶液中，经过漩涡混合器混合处理后再经过离心处理，取离心处理后的上清液少量；步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2～4分钟；步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有克仑特罗的洗脱液，步骤4：采用高效液相色谱法对步骤3得到的洗脱液进行检测。本发明的目的在于提供一种分离效率高、操作简单的高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法。

Description

高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法

技术领域

本发明涉及动物饲料的检测领域，特别是一种高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法。

背景技术

样品前处理是分析检测过程的关键环节，是浓缩被测定的痕量组分，提高方法的灵敏度，及除去对分析系统有干扰的物质的重要手段。萃取是从样品集体中分离出目标化合物的一项技术，是样品预处理中最重要的方法之一。目前，液液萃取仍然是应用最广泛的样品制备方法之一，但是，传统的液液萃取的操作繁琐费时、有机溶剂消耗量大，而且容易出现乳化现象的缺陷，使得在实际应用中具有一定的局限性。

1998年，科学家提出了在传统的液液萃取的基础上，利用一种具有吸附性和较大的比表面积的惰性多空填料作为介质，建立的一种新型高效样品的制备方法-介质液液萃取(supported liquid extraction简称SLE)，SLE萃取技术就是选用一种多孔性惰性材料-煅烧硅藻土作为介质，取代分液漏斗，增大了两相接触时的作用面积，实现高效、快速的萃取过程。

当水溶液样品加样到固定的聚丙烯注射管中的煅烧硅藻土上后，经过一定时间(一般分为几分钟)，水相溶液以一层薄薄的液膜形式分布在填料表面，之后，将有机溶剂从柱管上端加入，当互不相溶的两相在硅藻土表面接触的同时萃取立即发生，最后萃取液在重力作用下流出，必要情况下，可以施加较小的压力，而水相保留在介质中。盛接的流出液直接将溶剂吹干，复溶后，即可用于下一步分析检测。

现有的国标和现有公开的文献并未涉及动物饲料中的克仑特罗的分离方法和检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离效率高、操作简单的高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法。

本发明的技术方案为：一种高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法，包括以下步骤：

步骤1：取饲料样品，加入到缓冲溶液中，经过漩涡混合器混合处理后再经过离心处理，取离心处理后的上清液少量；

步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2～4分钟；

步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有克仑特罗的洗脱液；

步骤4：采用高效液相色谱法对步骤3得到的洗脱液进行检测，所述的高效液相色谱法的具体参数为：

色谱柱：C18柱，150mm*3.9mmID

柱温：室温

流动相：0.05％磷酸水溶液和乙腈的混合液，其中0.05％磷酸水溶液和乙腈的体积比为100:12；

检测器：UV检测器；

检测波长：210nm；

进样量：50μL；

其中，所述的缓冲溶液为：Ph范围为6.0～6.5的磷酸缓冲液，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，其中乙酸乙酯和乙酸甲酯的重量比为1:0.5～1。

在上述的高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法中，所述的饲料样品为1g，缓冲溶液为5ml，步骤2中所取的上清液为0.5ml，所述的步骤3中，每次洗脱时所用的洗脱剂为0.5ml。

在上述的高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法中，所述的步骤1中，漩涡混合器混合处理的时间为0.5～1.5分钟。

在上述的高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法中，所述的步骤1中，所述的离心处理的具体操作为：将经混合处理的溶液在离心机中以9000～11000转/分钟的速度离心0.5～1.5分钟。

在上述的高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法中，所述的SLE柱为奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE柱，所述的高效液相色谱法所采用的仪器型号为LC-2010型高效液相色谱仪。

本发明的有益效果如下：

采用SLE法分离饲料中的克仑特罗分离效率高，本发明的缓冲溶液能够有效的分离样品中的克仑特罗，二元洗脱剂对克仑特罗有特别优异的萃取效果，可以应用于以96孔板结构为代表的高通量体系。结合HPLC法分析，本发明的方案的萃取率为：95.4％，同时检测方法准确，其误差范围符合相关规定。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

步骤1：取饲料样品1g，加入到5ml的缓冲溶液中，经过漩涡混合器混合处理处理1分钟后再经过离心处理，取离心处理后的上清液0.5ml；离心处理的转速为10000转/分钟，离心时间1分钟。所述的缓冲溶液为：ph为6.0的磷酸缓冲液。

步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置3分钟；

步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱(奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE柱)洗脱2次，接收洗脱液，得到含有克仑特罗的洗脱液；每次消耗的洗脱剂为0.5ml，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，乙酸乙酯和乙酸甲酯的重量比1:0.8。

实施例2

步骤1：取饲料样品1g，加入到5ml的缓冲溶液中，经过漩涡混合器混合处理处理1分钟后再经过离心处理，取离心处理后的上清液0.5ml；离心处理的转速为9000转/分钟，离心时间1分钟。所述的缓冲溶液为：ph为6.5的磷酸缓冲液。

步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2分钟；

步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱2次，接收洗脱液，得到含有克仑特罗的洗脱液；每次消耗的洗脱剂为0.5ml，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，乙酸乙酯和乙酸甲酯的重量比1:0.6。

实施例3

步骤1：取饲料样品1g，加入到5ml的缓冲溶液中，经过漩涡混合器混合处理处理1分钟后再经过离心处理，取离心处理后的上清液0.5ml；离心处理的转速为9000转/分钟，离心时间1分钟。所述的缓冲溶液为：ph为6.3的磷酸缓冲液。

步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2分钟；

步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱2次，接收洗脱液，得到含有克仑特罗的洗脱液；每次消耗的洗脱剂为0.5ml，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，乙酸乙酯和乙酸甲酯的重量比1:1。

标准样的制备

称取克仑特罗标准品(纯度≥99％)0.1000g，置于100ml容量瓶中，用重量比为1:0.8的乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物的溶剂溶解定容，其浓度为1000μg/ml；

取上述浓度为1000μg/ml的克仑特罗溶液于100ml容量瓶中，配制成为0.100μg/ml、0.200μg/ml、0.500μg/ml、1.000μg/ml、2.000μg/ml的标准样。

对比例1

与实施例1大体相同，不同的地方在于，步骤3中，洗脱剂为异丙醇与乙酸乙酯的混合物，其体积比为40:60。

分析：

检测方法具体为：

仪器：LC-2010型高效液相色谱仪(日本岛津)

色谱柱：C18柱，150mm*3.9mmID

柱温：室温

流动相：0.05％磷酸水溶液：乙腈＝100:12；

检测器：UV检测器；

检测波长：210nm；

进样量：50μL

以0.100μg/ml、0.200μg/ml、0.500μg/ml、1.000μg/ml、2.000μg/ml的标准样进行测试，回归方程为Y＝982X+0.01，R²＝0.9998，X为待测物浓度，Y为峰面积。

以实施例1所萃取的样品为待测样品，待测样品的具体组分为70wt％玉米、30wt％蛋白质饲料，其中蛋白质饲料由豆粕、棉粕和菜粕组成，所述豆粕、棉粕和菜粕的重量比为4︰1.5︰0.5。此外，每千克待测组分中还加入有含有10mg克仑特罗的克仑特罗溶液。

待测样品分为10份，每份1g，采用实施例1的步骤1所述的方法进行操作，每份样品平行取出2份0.5ml的溶液，同一样品的所取得的两份0.5ml的溶液为一组，共10组，每组的溶液分别按照实施例1的步骤2-3进行操作和按照对比例1的步骤2-3进行操作。共得到按实施例1所取得的10份洗脱液A,编号为A1-A10，和按照对比例1所取得的10份洗脱液B，编号为B1-B10。

按照上述检测方法进样检测，得到如下的检测结果：

实施例1	浓度(μg/ml)	对比例1	浓度(μg/ml)
				A1	0.485	B1	0.441
A2	0.491	B2	0.451
				A3	0.473	B3	0.432
A4	0.477	B4	0.447
				A5	0.484	B5	0.445
A6	0.472	B6	0.433
				A7	0.474	B7	0.444
A8	0.477	B8	0.443
				A9	0.47	B9	0.435
A10	0.469	B10	0.437

萃取效率的计算方式为：萃取前样品中克仑特罗的质量*100％/萃取后洗脱液中克仑特罗的质量。

实施例1的平均萃取率为95.4％，对比例1的平均萃取率为88.2％。

本发明还采用液液萃取法(LLE)进行萃取试验，无论采用何种溶剂，其萃取率均小于85％；

测试方法精确度

采用0.500μg/ml的标准溶液进行平行测试10次，平均值为0.498μg/ml，标准偏差(RSD)％＝1.1％,上述测试方法重复性好，测量准确。

空白试验

采用乙酸乙酯和乙酸甲酯重量比为1:0.8的混合溶液制备的空白样1；

采用体积比为40:60异丙醇与乙酸乙酯的混合溶液制备空白样2；

空白样1和空白样2采用上述检测方法检测，未在克仑特罗出峰位置有出峰，测试结果为阴性，显示上述测试的溶剂对测试结果无影响。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：取饲料样品，加入到缓冲溶液中，经过漩涡混合器混合处理后再经过离心处理，取离心处理后的上清液少量；

步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2～4分钟；

步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有克仑特罗的洗脱液；

步骤4：采用高效液相色谱法对步骤3得到的洗脱液进行检测，所述的高效液相色谱法的具体参数为：

色谱柱：C18柱，150mm*3.9mmID

柱温：室温

流动相：0.05％磷酸水溶液和乙腈的混合液，其中0.05％磷酸水溶液和乙腈的体积比为100:12；

检测器：UV检测器；

检测波长：210nm；

进样量：50μL；

其中，所述的缓冲溶液为：Ph范围为6.0～6.5的磷酸缓冲液，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，其中乙酸乙酯和乙酸甲酯的重量比为1:0.5～1。

2.根据权利要求1所述的高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法，其特征在于，所述的饲料样品为1g，缓冲溶液为5ml，步骤2中所取的上清液为0.5ml，所述的步骤3中，每次洗脱时所用的洗脱剂为0.5ml。

3.根据权利要求1所述的高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法，其特征在于，所述的步骤1中，漩涡混合器混合处理的时间为0.5～1.5分钟。

4.根据权利要求3所述的高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法，其特征在于，所述的步骤1中，所述的离心处理的具体操作为：将经混合处理的溶液在离心机中以9000～11000转/分钟的速度离心0.5～1.5分钟。

5.根据权利要求1至4任一所述的高精度检测饲料中的克仑特罗含量的方法，其特征在于，所述的SLE柱为奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE柱，所述的高效液相色谱法所采用的仪器型号为LC-2010型高效液相色谱仪。