CN104251898A

CN104251898A - 膜透析-液相色谱串联质谱测定畜产品中多种β-受体兴奋剂残留的方法

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Publication number: CN104251898A
Application number: CN201410562385.0A
Authority: CN
Inventors: 杨丽君; 徐成钢; 梁君妮; 王美玲; 宋晓华; 安代志
Original assignee: WEIHAI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU INSPECTION AND QUARANTINE CENTER
Current assignee: HUNAN ACADEMY OF INSPECTION AND QUARANTINE
Priority date: 2014-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2034-10-22
Also published as: CN104251898B

Abstract

本发明属于化学分析领域，涉及膜透析-液相色谱串联质谱测定畜产品中多种β-受体兴奋剂残留的方法。本发明根据待测物的分子量和膜的截留分子量(MWCO)，用膜透析技术对样品进行前处理，将大分子物质截留在透析袋内，目标化合物通过透析渗入透析液中，选用适当的有机溶剂对透析液中的药物残留进行萃取，应用膜透析技术建立了一种同时测定畜产品中18种β-受体兴奋剂残留量的高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法。本发明灵敏度高，重现性好，经济，可用于畜产品中β-受体兴奋剂动剂残留的检测确证。

Description

膜透析-液相色谱串联质谱测定畜产品中多种β-受体兴奋剂残留的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及畜产品中β-受体兴奋剂的检测方法，具体涉及利用膜透析-高效液相色谱串联质谱法测定畜产品中18种β-受体兴奋剂残留的方法。

背景技术

β-受体兴奋剂是天然的儿茶酚胺类化学合成的衍生物，选择性作用于β-肾上腺受体。欧盟、日本、韩国等国家都规定禁止进口含有此类药物的肉制品。2002年我国农业部公告第176号明确规定盐酸克伦特罗等7种β-受体激动剂为禁用药物，2010年农业部公告第1519号明确规定禁止在饲料和动物饮水中使用苯乙醇胺A等9种β-受体兴奋剂，两个公告共禁用16种β-受体兴奋剂。目前，动物源性食品中β-受体兴奋剂残留的检测方法主要有酶联免疫法、高效液相色谱法、气质联用法和液质联用法等。高效液相色谱串联质谱法因具有抗干扰能力好、灵敏度高、确证能力强等优点, 已成为目前主要的检测和确证方法。

透析（dialysis）是通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。目前透析在医学上和废水处理方面应用较多，应用透析技术与分析仪器结合检测β-受体兴奋剂的方法主要局限于单一药物的检测，例如Gonzalez等（1997）建立了双向渗析膜技术与气质联用仪结合技术检测奶牛肝中盐酸克伦特罗含量，回收率达到99.3%，检测限为250 ppt（P. Gonza′lez, C.A. Fente, C. Franco, B. Va′zquez, E. Quinto, A. Cepeda, Journal of Chromatography B, 693 (1997) 321–326）。Fente等（1999）建立了双向渗析膜技术与气质联用仪结合技术检测肉牛毛中盐酸克伦特罗含量，检出限达5 ng/g, 日内和日间相对标准偏差（RSD）为7.1%和9.5%（C.A. Fente , B.I. Va′zquez, C. Franco, A. Cepeda, P.G. Gigosos,Journal of Chromatography B, 726 (1999) 133–139）。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以同时检测畜产品中18种β-受体兴奋剂残留的方法，本发明 18种β-受体兴奋剂是莱克多巴胺(ractompamine ract)、克伦特罗(clenbuterol clen)、沙丁胺醇(salbutamol sal)、溴布特罗(bromburerol bro )、特布它林(terbutalin ter)、班布特罗(bambuterol bam)、喷布特罗(penbutolol pen) 、非诺特罗(fenoterol fen) 、齐帕特罗(zilpaterol zil) 、苯乙醇胺A (phenylethanolamine A phe)、阿福特罗（arformorerol arf）、西马特罗(cimaterol cima) 、苯氧丙酰胺(isoxsuprine iso) 、妥布特罗(tulobuterol tul) 、西布特罗(cimbuterol cimb) 、马布特罗(mabuterol mab) 、氯丙那林(clorprenaline clo) 、普奈洛尔（Propranolol pro），该方法样品处理方法简单、灵敏度高、重现性好，应用于畜产品中β-受体兴奋剂残留检测可以缩短检测时间，提高检测效率。

本发明的技术方案是：

一种检测畜产品中18种β-受体兴奋剂残留的方法，其包括步骤：将待测组织样品经过样品预处理后，提取上清液装入透析袋中，将透析袋放入透析液中透析，收集透析液调节PH至9-10后用环己烷和乙酸乙酯的混合液萃取药物样品，萃取液浓缩后用于高效液相色谱串联质谱法测定药物含量；其中，

所述透析袋采用标准再生纤维素膜RC，截留分子量MWCO为1000D；

所述透析液为PH为4-5的乙酸铵缓冲溶液；

所述高效液相色谱串联质谱法，是采用外标法测定18种β-受体兴奋剂的含量，其液相色谱柱采用通用性，填料选自十八烷基键合相硅胶，流动相： 0.1%甲酸水溶液A-乙腈B，流速：0.2 mL /min，梯度洗脱：t= 0 min, 96%A,4% B； t= 2 min, 96%A,4%B； t=5 min, 77%A,23% B；t=12 min, 5%A,95% B；t=28 min, 44%A, 56% B； t=24 min，5%A,95% B； t=24.1 min, 96%A,4% B； t=32 min，96%A,4% B；质谱条件为：电喷雾电离源正离子扫描(ESI+)，多反应监测模式(MRM)；电喷雾电压: 5.5 kV；离子源温度: 550 ℃，雾化气压力(GSl): 40 psi；辅助气流速(GS2): 60 psi，气帘气压力(CUR): 40psi；碰撞室入口电压(EP): 10 V；碰撞室出口电压(CXP): 13 V，监测分析物的离子对进行药物残留确证分析。

本发明中，所述样品预处理是准确称取5.00 g粉碎好的样品，加入20 ml0.02mol/L、PH4-5乙酸铵缓冲液，混匀，超声20分钟，8000 转离心5分钟。

本发明中，所述环己烷和乙酸乙酯的混合液优选环已烷：乙酸乙酯=4：1。

本发明，透析时间≥6小时。

本发明，本发明18中β-受体兴奋剂线性范围0.5～10.0 μg/kg。

本发明，本发明18中β-受体兴奋剂的定量限为0.5μg/kg，进样两20μL。

本发明建立了完整的应用膜透析技术检测畜产品中18种β-受体兴奋剂的高效液相色谱-质谱检测方法，通过检测应用表明:该方法灵敏度高、重现性好，几乎没有基质效应，能满足β-受体激动剂类药物的残留检测任务。

附图说明

图1-图18为多反应监测的特征离子色谱图（0.5μg/kg）。

具体实施方式

为了具体说明本发明，结合以下实施例具体说明，但本发明并局限于此。

1.透析袋的制备

把透析膜（标准再生纤维素膜RC，截留分子量MWCO为1000D）剪成适当长度（10cm左右）的小段，蒸馏水彻底清洗透析膜，不使用的透析膜放回储存液中，密封保存，接触透析膜过程中必须戴手套。使用时，一端用下沉透析袋夹子夹紧，灌满水后，用手指适当加压，检查不漏，方可装入样品。通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。装完样品后，用上浮夹子夹紧袋口，可在袋内放一玻璃珠，以使透析袋处于悬浮状态，即可进行透析。

2.样品的前处理

准确称取5.00 g粉碎好的样品，加入20 ml0.02mol/L乙酸铵缓冲液(用乙酸调成PH4-5)，混匀，超声20分钟，8000 转离心5分钟，上清液移入透析袋中，将透析袋浸入盛有400-450 ml 0.02 mol/L乙酸铵缓冲液(PH4-5)的棕色烧杯中，放入转子，将烧杯置于磁力搅拌器上进行透析，搅拌转速以杯内形成涡旋带动透析袋转动，透析袋不下沉为准，杯外罩上不透明袋子，时间为6 h。透析完成后取出透析袋，将烧杯中的透析液调PH至9-10，移入1L的梨形分流漏斗中，加入40ml溶剂（环已烷：乙酸乙酯=4：1）萃取2次，合并萃取液进行旋蒸，用0.1%甲酸水溶液(v/v)定容成1.0 mL，供HPLC-MS/MS 测定分析。

3.液相色谱条件

本实施例采用的色谱柱为Thermo Hypersil Gold (2.1 mm ×100 mm , 3 μm) 色谱柱，Agilent Zorbax SB-C18、XDB-C18等十八烷基键合相硅胶也可以满足分离要求。

柱温35 ℃；进样体积20μL 。

流动相：A ：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈，流速：0.2 mL /min，梯度洗脱见表1：

表1梯度洗脱程序

4质谱条件

电喷雾电离源正离子扫描(ESI+)，多反应监测模式(MRM)；电喷雾电压: 5.5 kV；离子源温度: 550 ℃，雾化气压力(GSl): 40 psi；辅助气流速(GS2): 60 psi，气帘气压力(CUR): 40psi；碰撞室入口电压(EP): 10 V；碰撞室出口电压(CXP): 13 V。监测离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)如表2所示。

表2 18 种受体兴奋剂及内标优化的质谱分析参数

5.方法的线性范围、线性方程和检出限

将混合标准中间液用流动相配制成一系列标准工作溶液，上机测定，以峰面积(Y 轴)对相应的β-受体兴奋剂的浓度(X 轴)绘制标准曲线。结果表明，β-受体兴奋剂在0.5～10.0 μg/kg (相当于样品)浓度范围内，18种β-受体兴奋剂的校正曲线的线性良好, 相关系数r 均大于0.99 (见表3)。经实际样品检测，考虑到回收率和基质的影响，确定本方法在检测牛肉时的定量限为0.5 μg/kg。

表3 18 种β-受体兴奋剂的线性回归方程、相关系数

6.回收率和精密度

选用不含分析物的空白样品, 分别添加浓度为0.5、1.0和2.5 μg/kg 3 个浓度水平的混合标准溶液，每个水平6平行, 按建立的方法进行测定，校正曲线定量分析并计算其回收率和精密度, 测得平均回收率在64.3%～93.9%之间, 变异系数在3.2%～13.2%之间(表4和表5)。说明该方法具有较好的回收率、稳定性和重复性，完全可以满足畜产品中18种β-受体兴奋剂的日常检测要求。

表4 牛肉、猪肉中18 种β-受体兴奋剂的平均回收率和变异系数(n=6)

表5猪肝、牛肾中18 种β-受体兴奋剂的平均回收率和变异系数(n=6)

本发明灵敏度高，重现性好，经济，可用于畜产品中β-受体兴奋剂动剂残留的检测确证。

Claims

1. 膜透析-液相色谱串联质谱测定畜产品中多种β-受体兴奋剂残留的方法，特征在于，其包括步骤：将待测组织样品经过样品预处理后，提取上清液装入透析袋中，将透析袋放入透析液中透析，收集透析液调节PH至9-10后用环己烷和乙酸乙酯的混合液萃取药物样品，萃取液浓缩后用于高效液相色谱串联质谱法测定药物含量；其中：

所述β-受体兴奋剂为以下18种β-受体兴奋剂：莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗、特布它林、班布特罗、喷布特罗、非诺特罗、齐帕特罗、苯乙醇胺A、阿福特罗、西马特罗、苯氧丙酰胺、妥布特罗、西布特罗、马布特罗、氯丙那林、普奈洛尔；

所述透析液为PH为4-5的乙酸铵缓冲溶液；

所述高效液相色谱串联质谱法，是采用外标法测定18种β-受体兴奋剂的含量，其液相色谱柱采用通用性，填料选自十八烷基键合相硅胶，流动相： 0.1%甲酸水溶液A-乙腈B，流速：0.2 mL /min，梯度洗脱：t= 0 min, 96%A,4% B； t= 2 min, 96%A,4%B； t=5 min, 77%A,23% B；t=12 min, 5%A,95% B；t=28 min, 44%A, 56% B； t=24 min，5%A,95% B； t=24.1 min, 96%A,4% B； t=32 min，96%A,4% B；质谱条件为：电喷雾电离源正离子扫描ESI+，多反应监测模式MRM；电喷雾电压: 5.5 kV；离子源温度: 550 ℃，雾化气压力GSl: 40 psi；辅助气流速GS2: 60 psi，气帘气压力CUR: 40psi；碰撞室入口电压EP: 10 V；碰撞室出口电压CXP: 13 V，监测分析物的离子对进行药物残留确证分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样品预处理是准确称取5.00 g粉碎好的样品，加入20 ml0.02mol/L、PH4-5乙酸铵缓冲液，混匀，超声20分钟，8000 转离心5分钟。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述环己烷和乙酸乙酯的混合液优选环已烷：乙酸乙酯=4：1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：透析时间≥6小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：18中β-受体兴奋剂线性范围0.5～10.0 μg/kg。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：18中β-受体兴奋剂的定量限为0.5μg/kg，进样量20μL。