CN104820054A - 高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法 - Google Patents
高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法，包括以下步骤：步骤1：样品预处理；收集猪尿，首先加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行酶解；取离心后的上清液；步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2～4分钟；步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇的洗脱液，步骤4：采用高效液相色谱法对步骤3得到的洗脱液进行检测。本发明的目的在于提供一种高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法。
Description
技术领域
本发明涉及动物组织和排泄物的检测领域，特别是一种高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法。
背景技术
样品前处理是分析检测过程的关键环节，是浓缩被测定的痕量组分，提高方法的灵敏度，及除去对分析系统有干扰的物质的重要手段。萃取是从样品集体中分离出目标化合物的一项技术，是样品预处理中最重要的方法之一。目前，液液萃取仍然是应用最广泛的样品制备方法之一，但是，传统的液液萃取的操作繁琐费时、有机溶剂消耗量大，而且容易出现乳化现象的缺陷，使得在实际应用中具有一定的局限性。
1998年，科学家提出了在传统的液液萃取的基础上，利用一种具有吸附性和较大的比表面积的惰性多空填料作为介质，建立的一种新型高效样品的制备方法-介质液液萃取(supported liquid extraction简称SLE)，SLE萃取技术就是选用一种多孔性惰性材料-煅烧硅藻土作为介质，取代分液漏斗，增大了两相接触时的作用面积，实现高效、快速的萃取过程。
当水溶液样品加样到固定的聚丙烯注射管中的煅烧硅藻土上后，经过一定时间(一般分为几分钟)，水相溶液以一层薄薄的液膜形式分布在填料表面，之后，将有机溶剂从柱管上端加入，当互不相溶的两相在硅藻土表面接触的同时萃取立即发生，最后萃取液在重力作用下流出，必要情况下，可以施加较小的压力，而水相保留在介质中。盛接的流出液直接将溶剂吹干，复溶后，即可用于下一步分析检测。
农业部1025号公告-11-2008公开了猪尿中β-受体激动剂多残留检测，其采用酶解后异丙醇-乙酸乙酯进行萃取，并通过内标法可以得到相关的检测结果，但是在实际应用中，采用酶解后然后在采用传统方法萃取后通过色谱检测有时无法检出残留项。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离效率高、操作简单的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法。
本发明的技术方案为：一种高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法，包括以下步骤：
步骤1：样品预处理；收集猪尿，首先加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4倍猪尿体积的Ph范围为5.5～6的乙酸铵缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液；
步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2～4分钟；
步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇的洗脱液；
步骤4：采用高效液相色谱法对步骤3得到的洗脱液进行检测，所述的高效液相色谱法的具体参数为：
色谱柱：C18柱，150mm*3.9mmID
柱温：室温
流动相：0.05％磷酸水溶液和乙腈的混合液，其中0.05％磷酸水溶液和乙腈的体积比为100:12；
检测器：UV检测器；
检测波长：217nm；
其中，所述的二元洗脱剂为正丁醇和乙酸甲酯的混合物，其中正丁醇和乙酸甲酯的重量比为4:1～5:1。
在上述的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法中，所述的猪尿为1ml，缓冲溶液为4ml，步骤2中所取的上清液为0.5ml，所述的步骤3中，每次洗脱时所用的洗脱剂为0.5ml。
在上述的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法中，每毫升的尿液中加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶12μL。
在上述的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法中，所述的三氯乙酸和猪尿的质量比为1:98～100。
在上述的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法中，所述的步骤1中，漩涡混合器混合处理的时间为0.5～1.5分钟。
在上述的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法中，所述的步骤1中，所述的离心处理的具体操作为：将经混合处理的溶液在离心机中以9000～11000转/分钟的速度离心0.5～1.5分钟。
在上述的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法中，所述的SLE柱为奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE柱。
本发明的有益效果如下：
采用SLE法分离猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇，先进行酶解使蛋白质和莱克多巴胺分离，采用缓冲溶液进行混合，然后通过SLE柱分离出莱克多巴胺，萃取剂为正丁醇和乙酸甲酯，本发明的分离效率好、分离时间短，同时结合HPLC法测量萃取得到的洗脱液，能够准确的测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇的含量。特别是本发明采用正丁醇和乙酸甲酯分离三种β-受体激动剂，可以保证其在色谱柱上有效出峰，相比于传统的检测方法，其检出难度降低，检测精度升高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
步骤1：取猪尿1g，首先加入12μLβ-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，酶解时间为3-4小时，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4ml的Ph为5.6的乙酸铵缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液0.5ml；三氯乙酸和猪尿的质量比为1:99。
步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置3分钟；
步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱2次，接收洗脱液，得到含有莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇的洗脱液；每次消耗的洗脱剂为0.5ml，所述的二元洗脱剂为正丁醇和乙酸甲酯的混合物，异丙醇和乙酸甲酯的重量比为4:1。
实施例2
步骤1：取猪尿1g，首先加入12μLβ-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，酶解时间为3-4小时，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4ml的Ph为5.8的乙酸铵缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液0.5ml；三氯乙酸和猪尿的质量比为1:100。
步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置3分钟；
步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱2次，接收洗脱液，得到含有莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇的洗脱液；每次消耗的洗脱剂为0.5ml，所述的二元洗脱剂为正丁醇和乙酸甲酯的混合物，异丙醇和乙酸甲酯的重量比为5:1。
标准样的制备
称取莱克多巴胺标准品(纯度≥99％)0.0100g，置于1000ml容量瓶中，用重量比为4:1的正丁醇和乙酸甲酯的混合物的溶剂溶解定容，其浓度为10μg/ml；
取上述浓度为10μg/ml的莱克多巴胺溶液于1000ml容量瓶中，配制成为2μg/L、5μg/L、8μg/L、10μg/L、20μg/L的标准样。
称取克仑特罗标准品(纯度≥99％)0.0100g，置于1000ml容量瓶中，用重量比为4:1的正丁醇和乙酸甲酯的混合物的溶剂溶解定容，其浓度为10μg/ml；
取上述浓度为10μg/ml的克仑特罗溶液于1000ml容量瓶中，配制成为2μg/L、5μg/L、8μg/L、10μg/L、20μg/L的标准样。
称取沙丁胺醇标准品(纯度≥99％)0.0100g，置于1000ml容量瓶中，用重量比为4:1的正丁醇和乙酸甲酯的混合物的溶剂溶解定容，其浓度为10μg/ml；
取上述浓度为10μg/ml的沙丁胺醇溶液于1000ml容量瓶中，配制成为2μg/L、5μg/L、8μg/L、10μg/L、20μg/L的标准样。
分析：
检测方法具体为：
仪器：LC-2010型高效液相色谱仪(日本岛津)
色谱柱：C18柱，150mm*3.9mmID
柱温：室温
流动相：0.05％磷酸水溶液：乙腈＝100:12；
检测器：UV检测器；
检测波长：217nm；
进样量：50μL
采用上述的检测方法分别将标准样分别绘制莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇的回归方程，同时，采用实施例1的样品按上述参数进行检测，根据217nm条件下的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇的回归方程测定莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇的含量，其中，沙丁胺醇出峰时间为7.1min，莱克多巴胺出峰时间为9.2min，克仑特罗的出峰时间为10.1min，尿液中克仑特罗含量为9.5μg/L，莱克多巴胺含量为5.7μg/L，沙丁胺醇含量为4.0μg/L。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：样品预处理；收集猪尿，首先加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4倍猪尿体积的Ph范围为5.5～6的乙酸铵缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液；
步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2～4分钟；
步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇的洗脱液；
步骤4：采用高效液相色谱法对步骤3得到的洗脱液进行检测，所述的高效液相色谱法的具体参数为：
色谱柱：C18柱，150mm*3.9mmID
柱温：室温
流动相：0.05％磷酸水溶液和乙腈的混合液，其中0.05％磷酸水溶液和乙腈的体积比为100:12；
检测器：UV检测器；
检测波长：217nm；
其中，所述的二元洗脱剂为正丁醇和乙酸甲酯的混合物，其中正丁醇和乙酸甲酯的重量比为4:1～5:1。
2.根据权利要求1所述的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法，其特征在于，所述的猪尿为1ml，缓冲溶液为4ml，步骤2中所取的上清液为0.5ml，所述的步骤3中，每次洗脱时所用的洗脱剂为0.5ml。
3.根据权利要求2所述的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法，其特征在于，每毫升的尿液中加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶12μL。
4.根据权利要求2所述的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法，其特征在于，所述的三氯乙酸和猪尿的质量比为1:98～100。
5.根据权利要求1所述的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法，其特征在于，所述的步骤1中，漩涡混合器混合处理的时间为0.5～1.5分钟。
6.根据权利要求5所述的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法，其特征在于，所述的步骤1中，所述的离心处理的具体操作为：将经混合处理的溶液在离心机中以9000～11000转/分钟的速度离心0.5～1.5分钟。
7.根据权利要求1至6任一所述的高精度测量猪尿中的莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇含量的方法，其特征在于，所述的SLE柱为奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE柱，所述的高效液相色谱法所采用的仪器型号为LC-2010型高效液相色谱仪。
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