CN108956841A - 一种畜肉中左旋咪唑含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种畜肉中左旋咪唑含量的检测方法。所述的畜肉中左旋咪唑含量的检测方法.采用超声提取法以及同位素稀释技术，超高压液相色谱‑串联质谱法测定畜肉中左旋咪唑的方法。

Description

一种畜肉中左旋咪唑含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种畜肉中左旋咪唑含量的检测方法。

背景技术

左旋咪唑（levamisole）为抗蠕虫药，最常用的兽药制剂形式为左旋咪唑盐酸盐（levamisole hydrochlorideh）。盐酸左旋咪唑主要用于治疗畜禽胃肠道线虫、肺线虫病和猪肾虫病，在畜牧业中广泛应用。不合理地使用左旋咪唑会造成动物产品中残留，残留的左旋咪唑对人体的主要潜在危害是致畸作用和致突，变作用。为保证动物源性产品的安全性，美国、加拿大、欧盟和日本等许多国家或国际组织制定了严格的限量标准，一般为 10～100μg/kg。我国规定牛羊、猪、禽产品中左旋咪唑最大残留限量（MRL）为 10μg/kg。目前，左旋咪唑残留检测方法以色谱法为主，主要有液相色谱-紫外检测法和气相色谱-氮磷检测法，这些方法的检出限在10～100μg/kg，且操作较为复杂繁琐。随着世界各国对左旋咪唑残留限量的规定越来越严厉，普通的色谱检测方法已逐渐不能完全满足其残留的检测要求。因此有必要进行改革创新。

发明内容

本发明的目的是提供一种畜肉中左旋咪唑含量的检测方法, 本发明的目的是通过如下技术方案来实现的:

本发明的畜肉中左旋咪唑含量的检测方法,包括以下步骤：

（一）待测物质的提取

称取待测均匀样品2.0g于50mL聚丙烯塑料离心管中，加入40μL内标（100ng/mL），再加入10mL乙腈，于30℃水浴下超声提取30 min。提取结束后， 4500 转/min的转速离心5 min。

（二）提取液的净化

取步骤（一）离心后所得上层提取液5 mL过活化后的HLB固相萃取柱净化（分别用3.0mL乙腈、3mL超纯水活化），收集流出液与5mL玻璃试管中。

（三）提取液的浓缩

将步骤（二）所收集的洗脱液于45℃水浴下氮吹至近干，加入10%乙腈含0.2%甲酸溶液溶解定容至1.0mL，涡旋混匀后过0.22μm滤膜，UPLC-MS-MS分析测试。

（四）仪器条件

色谱柱： BEH C₁₈柱（150 mm×2.1 mm，1.7μm，Waters公司）；柱温：40℃；流速为0.3mL/min；流动相为(A)0.3%甲酸；(B)乙腈；进样方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1所示。进样体积：2.0μm。

表1 流动相的梯度洗脱表

质谱参数：电喷雾电离负离子模式（ESI-）；毛细管电压：3000 V；干燥气温度：160℃；干燥气流速：16L/min；雾化气压力：30 psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L/min；扫描模式：多反应监测（MRM）；左旋咪唑的质谱参数见表2。

表2 质谱参数

注：*为定量离子

（五）本发明所述的左旋咪唑结构为,分子量为204.29，CAS号为：14769-73-4。

（六）标准曲线的制备

分别准确称取适量左旋咪唑标准品和内标于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-18℃冰箱中放置保存。以标准储备液配制出100ng/mL 的中间液和内标中间液，再分别取适量中间液及内标中间液以10%乙腈含0.2%甲酸稀释成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的标准曲线系列，内标浓度均为2.0ng/mL，按照步骤（四）进样分析。

（七）定量方法

UPLC-MS-MS进样分析后，以标准曲线溶液中左旋咪唑的峰面积与其内标的比值为Y值，浓度为X（ng/mL）值，进行标准曲线拟合，得出各物质标准曲线Y=AX+B；样品的测定结果按式（1）计算：

w = ------------------------------------------------（1）

式中：

w ──样品中左旋咪唑的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；

──标准曲线计算出的样品的浓度（ng/mL）；

V ──样品的定容体积，单位为毫升（mL）；

──稀释倍数；

m ──样品称样量，单位为克（g）；

为满足目前猪畜肉中左旋咪唑的准确分析，本发明使用乙腈溶剂超声提取，过HLB固相萃取柱净化，以及同位素稀释技术，建立一种简单、准确、检出限低的超高压液相色谱-串联质谱测定畜肉中左旋咪唑的方法。本发明所提供的方法操作简单，灵敏度高、内标法定量分析结果更准确、检测限低、分析时间快。

附图说明

图1是左旋咪唑及其内标的提取离子色谱图（2.0ng/mL）。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明。

实施例1：

猪肉中左旋咪唑含量的检测方法包括以下步骤：

（一）样品的制备

取猪肉样品约500g，全部转移至高速粉碎机中，盖紧粉碎机盖子，以10000 转/min的转速粉碎。样品在-18摄氏度冷冻保存，备用。

（二）待测物质的提取

称取待测均匀样品2.0g于50mL聚丙烯塑料离心管中，加入40μL内标（100ng/mL），再加入10mL乙腈，于30℃水浴下超声提取30 min。提取结束后， 4500 转/min的转速离心5 min。

（三）提取液的净化

取步骤（一）离心后所得上层提取液5 mL过活化后的HLB固相萃取柱净化（分别用3.0mL乙腈、3mL超纯水活化），收集流出液与5mL玻璃试管中。

（四）提取液的浓缩

将步骤（二）所收集的洗脱液于45℃水浴下平行浓缩仪浓缩至近干，加入10%乙腈含0.2%甲酸溶液溶解定容至1.0mL，涡旋混匀后过0.22μm滤膜，UPLC-MS-MS分析测试。

（五）仪器条件

色谱柱： BEH C₁₈柱（150 mm×2.1 mm，1.7μm，Waters公司）；柱温：40℃；流速为0.3mL/min；流动相为(A)0.3%甲酸；(B)乙腈；进样方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序如表3所示。进样体积：2.0μm。

表3 流动相的梯度洗脱表

质谱参数：电喷雾电离负离子模式（ESI-）；毛细管电压：3000 V；干燥气温度：160℃；干燥气流速：16L/min；雾化气压力：30 psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L/min；扫描模式：多反应监测（MRM）；左旋咪唑的质谱参数见表4。

表4 质谱参数

（六）标准曲线的制备

分别准确称取适量左旋咪唑标准品和内标于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-18℃冰箱中放置保存。以标准储备液配制出100ng/mL 的中间液和内标中间液，再分别取适量中间液及内标中间液以10%乙腈含0.2%甲酸稀释成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的标准曲线系列，内标浓度均为2.0ng/mL，按照步骤（四）进样分析。

（七）定量方法

UPLC-MS-MS进样分析后，以标准曲线溶液中左旋咪唑的峰面积与其内标峰面积的比值为Y值，浓度为X（ng/mL）值，进行标准曲线拟合，得出各物质标准曲线Y=AX+B；样品的测定结果按式（1）计算:

w = --------------------------------------------------（1）

式中：

w ──样品中左旋咪唑的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；

──标准曲线计算出的样品的浓度（ng/mL）；

V ──样品的定容体积，单位为毫升（mL）；

──稀释倍数；

m ──样品称样量，单位为克（g）。

通过结果分析，左旋咪唑的回归方程、相关系数、检出限和定量限如表5所示。

结果表明，左旋咪唑在1.0~20.0ng/mL范围线性关系良好，相关系数R都在0.99以上，检出限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg。在30份猪肉样品中共有1份检出含有左旋咪唑，含量为4.5μg/kg，其余均未检出。

表5 左旋咪唑的回归方程、相关系数、检出限和定量限

本发明使用实验仪器及材料：

1290 Infinity超高效液相色谱串联6490三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司）；高速冷冻离心机（Aanti J-E，美国Beckman Coulter公司）；超纯水纯化系统（Milli-Q，美国Millipore公司）；分析天平（BT 224 S，德国Sartorius公司）；超声波振荡器（DS-8510 DTH，上海生析超声仪器有限公司）；旋涡混均器（XH-B，江苏康健医疗用品有限公司）；60位全自动平行浓缩仪（睿科仪器有限公司）；0.22 μm 尼龙滤膜（赛默飞有限公司）；2mL注射器（湖南平安有限公司）；一次性吸管（上海洪飞有限公司）。甲酸、乙腈、甲醇均为色谱纯级（Fisher公司）；实验用水为符合GB/T 6682规定的一级水。

Claims (2)

1.一种畜肉中左旋咪唑含量的检测方法, 其特征在于,所述的畜肉中左旋咪唑含量的检测方法,包括以下步骤：

（一）待测物质的提取:

称取待测均匀样品2.0g于50mL聚丙烯塑料离心管中，加入40μL内标（100ng/mL），再加入10mL乙腈，于30℃水浴下超声提取30 min。提取结束后， 4500 转/min的转速离心5 min;

（二）提取液的净化:

取步骤（一）离心后所得上层提取液5 mL过活化后的HLB固相萃取柱净化（分别用3.0mL乙腈、3mL超纯水活化），收集流出液与5mL玻璃试管中;

（三）提取液的浓缩:

将步骤（二）所收集的洗脱液于45℃水浴下氮吹至近干，加入10%乙腈含0.2%甲酸溶液溶解定容至1.0mL，涡旋混匀后过0.22μm滤膜，UPLC-MS-MS分析测试;

（四）仪器条件:

色谱柱： BEH C₁₈柱（150 mm×2.1 mm，1.7μm，Waters公司）；柱温：40℃；流速为0.3 mL/min；流动相为(A)0.3%甲酸；(B)乙腈；进样方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1所示。进样体积：2.0μm;

质谱参数：电喷雾电离负离子模式（ESI-）；毛细管电压：3000 V；干燥气温度：160℃；干燥气流速：16L/min；雾化气压力：30 psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L/min；扫描模式：多反应监测（MRM）；

（五）所述的左旋咪唑结构为,分子量为204.29，CAS号为：14769-73-4;

（六）标准曲线的制备:

分别准确称取适量左旋咪唑标准品和内标于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-18℃冰箱中放置保存。以标准储备液配制出100ng/mL 的中间液和内标中间液，再分别取适量中间液及内标中间液以10%乙腈含0.2%甲酸稀释成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的标准曲线系列，内标浓度均为2.0ng/mL，按照步骤（四）进样分析;

（七）定量方法

UPLC-MS-MS进样分析后，以标准曲线溶液中左旋咪唑的峰面积与其内标的比值为Y值，浓度为X（ng/mL）值，进行标准曲线拟合，得出各物质标准曲线Y=AX+B；样品的测定结果按式（1）计算：

w = -------------------------------------------------（1）

式中：

w ──样品中左旋咪唑的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；

──标准曲线计算出的样品的浓度（ng/mL）；

V ──样品的定容体积，单位为毫升（mL）；

──稀释倍数；

m ──样品称样量，单位为克（g）。

2.猪肉中左旋咪唑含量的检测方法, 其特征在于,猪肉中左旋咪唑含量的检测方法包括如下步骤:

（一）样品的制备

取猪肉样品约500g，全部转移至高速粉碎机中，盖紧粉碎机盖子，以10000 转/min的转速粉碎,样品在-18摄氏度冷冻保存，备用;

（二）待测物质的提取

称取待测均匀样品2.0g于50mL聚丙烯塑料离心管中，加入40μL内标（100ng/mL），再加入10mL乙腈，于30℃水浴下超声提取30 min。提取结束后， 4500 转/min的转速离心5 min;

（三）提取液的净化

取步骤（一）离心后所得上层提取液5 mL过活化后的HLB固相萃取柱净化（分别用3.0mL乙腈、3mL超纯水活化），收集流出液与5mL玻璃试管中;

（四）提取液的浓缩

将步骤（二）所收集的洗脱液于45℃水浴下平行浓缩仪浓缩至近干，加入10%乙腈含0.2%甲酸溶液溶解定容至1.0mL，涡旋混匀后过0.22μm滤膜，UPLC-MS-MS分析测试;

（五）仪器条件

色谱柱： BEH C₁₈柱（150 mm×2.1 mm，1.7μm，Waters公司）；柱温：40℃；流速为0.3 mL/min；流动相为(A)0.3%甲酸；(B)乙腈；进样方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序如表3所示。进样体积：2.0μm;

质谱参数：电喷雾电离负离子模式（ESI-）；毛细管电压：3000 V；干燥气温度：160℃；干燥气流速：16L/min；雾化气压力：30 psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L/min；扫描模式：多反应监测（MRM）；

（六）标准曲线的制备

分别准确称取适量左旋咪唑标准品和内标于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-18℃冰箱中放置保存。以标准储备液配制出100ng/mL 的中间液和内标中间液，再分别取适量中间液及内标中间液以10%乙腈含0.2%甲酸稀释成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的标准曲线系列，内标浓度均为2.0ng/mL，按照步骤（四）进样分析;

（七）定量方法

UPLC-MS-MS进样分析后，以标准曲线溶液中左旋咪唑的峰面积与其内标峰面积的比值为Y值，浓度为X（ng/mL）值，进行标准曲线拟合，得出各物质标准曲线Y=AX+B；样品的测定结果按式（1）计算:

w = -------------------------------------------------（1）

式中：

w ──样品中左旋咪唑的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；

──标准曲线计算出的样品的浓度（ng/mL）；

V ──样品的定容体积，单位为毫升（mL）；

──稀释倍数；

m ──样品称样量，单位为克（g）。