CN113358787A - 一种保健酒指纹图谱分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种保健酒指纹图谱分析方法，主要包括下述步骤：(1)使用高通量平行浓缩仪和全自动固相萃取仪进行供试品溶液的制备；(2)供试品溶液的色谱分析及数据处理；(3)指纹图谱相似度的计算及内控标准的建立；(4)日常检测分析工作的开展。本发明方法具有快速、高效、稳定、安全、自动化的特点。
Description
技术领域
本发明属于图谱分析技术领域，具体涉及一种保健酒指纹图谱分析方法。
背景技术
保健药酒通常具有补气、补肾、滋阴的作用，其由多味中药材制备而成。作为一个中药复方保健酒，指纹图谱分析方法有利于对其物质群整体进行控制，是一个颇为有效且全面的评价方法。中国专利CN100392399C公开了一种用指纹图谱技术检测中国劲酒质量的方法，但原方法采用液液萃取方式进行供试品溶液的制备，样品用量大、处理步骤繁杂、使用溶剂多、过程损失大、处理效率低下，不适用于大量样品的分析。
固相萃取技术(solid phase extraction，SPE)是自1970年发明以来，发展非常迅速的由液固萃取和和柱液相色谱技术结合成一种试样化学分析技术，它利用固体物质作为萃取剂从样品中提取某些组成成分，采用选择性吸附、洗脱的方式，实现样品的富集、分离、纯化。固相萃取技术操作时间短、样品量小、干扰物质少，具有高效、稳定及耗用溶剂量少等优点，目前市场上已经出现了较多种类的固相萃取柱，基本可以满足大部分含量低、基质复杂的样品的萃取。而全自动固相萃取技术可以在无人值守的情况下完成固相萃方法的应用，节约人工时间，同时能将实验中的人为误差降至最低，相对于传统的固相萃取技术具有操作方便、稳定性强、环保等优点，特别适用于大批量样品的处理。
发明内容
本发明的目的是提供一种保健酒指纹图谱分析方法，该方法解决了现有保健酒指纹图谱样品制备方法所存在的样品量大、处理步骤繁杂、使用溶剂多、过程损失大、处理效率低下，不适用于大量样品的分析的问题，具有消耗样品量小、制样稳定、使用溶剂少、安全性高、制备效率高等特点，适用于大批量的保健酒指纹图谱样品分析。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种保健酒指纹图谱样品制备方法，由下述步骤组成：
(1)供试品溶液的制备
①样品浓缩
将从生产现场采集的保健酒样品使用高通量平行浓缩仪进行浓缩，去除乙醇、提高样品中各组分含量，备用。
②浓缩液萃取
将①所得到的浓缩液放入全自动固相萃取仪中，完成浓缩液在固相萃取小柱中的上样、淋洗、洗脱、组分收集步骤，分别收集乙醚部位和5％异戊醇乙酸乙酯部位洗脱液。
③洗脱液浓缩
将②得到的乙醚部位和5％异戊醇乙酸乙酯部位洗脱液通过高通量平行浓缩仪回收溶剂，残渣加入50％甲醇溶解、定容，得到供试品溶液。
(2)供试品溶液的色谱分析及数据处理
将得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行色谱分析，得到相应的样品色谱图。
(3)色谱峰指认
配制阿魏酸、毛蕊花糖苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的对照品溶液，在步骤(2)相同色谱条件下进行色谱分析，得到上述化合物的保留时间信息，用于供试品溶液中色谱峰的指认工作。
(4)指纹图谱相似度的计算及对照图谱的建立
重复步骤(1)、(2)，得到不同批次保健酒的色谱图，通过中药色谱指纹图谱相似度评价软件对得到的多批次色谱图进行指纹图谱相似度计算，并建立对照图谱。
(5)检测分析
按照步骤(1)对日常检测样品进行处理后得到供试品溶液，然后按照步骤(2)进行色谱分析，得到供试品溶液的色谱图，使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件计算样品色谱图与对照图谱的相似度，通过相似度结果判定样品结果是否符合要求。
优选地，步骤①中洗脱液浓缩采用真空度梯度下降浓缩方式，具体参数为：
| 序号 | 绝对真空(mbar) | 持续时间(min) |
| 1 | 250 | 5 |
| 2 | 200 | 5 |
| 3 | 170 | 5 |
| 4 | 150 | 5 |
| 5 | 130 | 8 |
| 6 | 110 | 8 |
| 7 | 95 | 8 |
| 8 | 80 | 4 |
优选地，步骤③中洗脱液浓缩采用真空度梯度下降浓缩方式，具体参数为：
优选地，步骤(2)中色谱分析条件如下：
色谱仪：美国Agilent 1260系列；
色谱柱：Sepax HP-C18柱，5μm，4.6×250mm；
流动相：乙腈-0.01％磷酸水溶液梯度洗脱；
流速：流速1.0mL/分钟；
检测波长：280nm；
柱温：30℃。
优选地，步骤(5)中相似度大于0.900时认为符合要求。
本发明提供的一种保健酒指纹图谱分析方法，采用高通量平行浓缩仪和全自动固相萃取仪来实现中国劲酒指纹图谱样品的快速、高效、自动化制备，根据高通量平行浓缩仪和全自动固相萃取仪的配置情况，可以一批制备多个样品，同时具有消耗样品量小、制样稳定、使用溶剂少、安全性高、制备效率高等特点，适用于大批量的中国劲酒指纹图谱分析。
附图说明
图1是10批保健酒乙醚部位色谱图；
图2是10批保健酒5％异戊醇乙酸乙酯部位色谱图；
图3是保健酒乙醚部位对照色谱图；
图4是保健酒5％异戊醇乙酸乙酯部位对照色谱图；
图5是本发明与对比例保健酒乙醚部位的谱图对比；
图6是本发明与对比例保健酒5％异戊醇乙酸乙酯部位的谱图对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做出详细说明，应当了解，实施例只用于说明本发明，而不是用于对本发明进行限定，任何在本发明基础上所做的修改、等同替换等均在本发明的保护范围内。
实施例
本实施例以中国劲酒保健酒作为待测样品，说明本发明保健酒指纹图谱具体分析方法：
(1)供试品溶液的制备
①样品浓缩
量取适量中国劲酒于玻璃试管中，置于高通量真空平行浓缩仪上浓缩，水浴温度50℃，并设置适应的真空度下降梯度，进行样品浓缩，方法具体参数见表1。
表1中国劲酒样品浓缩方法(真空度)
| 序号 | 绝对真空(mbar) | 持续时间(min) |
| 1 | 250 | 5 |
| 2 | 200 | 5 |
| 3 | 170 | 5 |
| 4 | 150 | 5 |
| 5 | 130 | 8 |
| 6 | 110 | 8 |
| 7 | 95 | 8 |
| 8 | 80 | 4 |
②浓缩液萃取
将浓缩好的样品放置在全自动固相萃取仪上，根据已设置好的运行方法，完成固相萃取小柱的活化、上柱、淋洗及洗脱过程，分别收集乙醚部位及5％异戊醇乙酸乙酯部位洗脱液到玻璃试管中，方法具体内容及参数见表2。
表2全自动固相萃取仪方法及参数设置
③洗脱液浓缩
将收集好的洗脱液再置于高通量真空平行浓缩仪上回收溶剂，方法具体参数见表3。待溶剂挥干后，加入50％甲醇溶解、定容，得到乙醚部位及5％异戊醇乙酸乙酯部位的供试品溶液。
表3中国劲酒洗脱液浓缩方法(真空度)
| 序号 | 绝对真空(mbar) | 持续时间(min) |
| 1 | 800 | 2 |
| 2 | 500 | 2 |
| 3 | 300 | 2 |
| 4 | 200 | 2 |
| 5 | 160 | 2 |
| 6 | 130 | 2 |
| 7 | 100 | 2 |
| 8 | 70 | 2 |
(2)供试品溶液的色谱分析及数据处理
将得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行色谱分析，通过适当的色谱分析条件和数据处理得到相应的色谱图。
色谱分析条件如下：
色谱仪：美国Agilent 1260系列；
色谱柱：Sepax HP-C18柱，5μm，4.6×250mm；
流动相：乙腈-0.01％磷酸水溶液梯度洗脱
流速：流速1.0mL/分钟；
检测波长：280nm；
柱温：30℃。
(3)色谱峰指认
配制阿魏酸、毛蕊花糖苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的对照品溶液，在上述色谱条件下进行色谱分析，得到上述化合物的保留时间信息，用于供试品溶液中色谱峰的指认工作。
(4)指纹图谱相似度的计算及内控标准的建立
重复步骤(1)、(2)，得到10批不同批次中国劲酒的色谱图，通过中药色谱指纹图谱相似度评价软件(国家药典委员会2012版)对得到的多批次色谱图进行指纹图谱相似度计算，并建立对照图谱，作为中国劲酒指纹图谱分析的内控标准。
供试品指纹图谱与标准图谱比较，在相应的保留时间应出现相同的色谱峰，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(国家药典委员会2012版)计算供试品指纹图谱与标准图谱的相似度，其相似度应大于0.900。
(5)日常检测分析工作的开展
按照步骤(1)对日常检测样品进行处理后得到供试品溶液，然后按照步骤(2)进行色谱分析，得到供试品溶液的色谱图，使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(国家药典委员会2012版)计算样品色谱图与标准图谱的相似度，通过相似度是否大于0.900判定样品结果是否符合要求。
对比例采用现有技术中的液液萃取法进行检测分析
本对比例的方法由以下步骤组成：
(1)原方法中供试品溶液的制备方法
取中国劲酒100ml，40℃水浴旋转蒸发至近干，上样于装有AB-8的大孔吸附层析柱上(12㎜*300㎜)，用水洗脱至无糖反应(即Molish反应为阴性)，后用80mL95％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压蒸干。加入20mL水，超声使溶解，并转移至分液漏斗中。先用水饱和乙醚萃取3次，每次20mL，合并萃取液，水浴蒸干，用四氢呋喃定容至2ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得乙醚部位供试品溶液；再将乙醚萃取后的溶液用水饱和的5％异戊醇乙酸乙酯萃取3次，每次20mL，合并萃取液，减压蒸干，用四氢呋喃定容至2mL，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得5％异戊醇乙酸乙酯部位供试品溶液。
实施例与对比例的比较
本实施例与对比例在乙醚部位和5％异戊醇乙酸乙酯部位指纹图谱对比见图5、图6。
使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(国家药典委员会2012版)计算实施例与对比例指纹图谱的相似度，结果见表4。
表4实施例与对比例制备的供试品溶液的指纹图谱相似度对比结果
| 实施例 | 对比例 | |
| 乙醚部位 | 0.996 | 0.994 |
| 5％异戊醇乙酸乙酯部位 | 0.998 | 0.998 |
由上述结果可以看出，乙醚部位和5％异戊醇乙酸乙酯部位的相似度结果均＞0.950，表明可以采用本发明对保健酒进行供试品溶液的制备。
新方法与原方法在耗费时间及耗费试剂量的对比
表5新方法与原方法制备供试品溶液耗费时间与试剂量对比
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.一种保健酒指纹图谱样品制备方法，其特征在于，由下述步骤组成：
(1)供试品溶液的制备
①样品浓缩
将从生产现场采集的保健酒样品使用高通量平行浓缩仪进行浓缩，去除乙醇、提高样品中各组分含量，备用。
②浓缩液萃取
将①所得到的浓缩液放入全自动固相萃取仪中，完成浓缩液在固相萃取小柱中的上样、淋洗、洗脱、组分收集步骤，分别收集乙醚部位和5％异戊醇乙酸乙酯部位洗脱液。
③洗脱液浓缩
将②得到的乙醚部位和5％异戊醇乙酸乙酯部位洗脱液通过高通量平行浓缩仪回收溶剂，残渣加入50％甲醇溶解、定容，得到供试品溶液。
(2)供试品溶液的色谱分析及数据处理
将得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行色谱分析，得到相应的样品色谱图。
(3)色谱峰指认
配制阿魏酸、毛蕊花糖苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的对照品溶液，在步骤(2)相同色谱条件下进行色谱分析，得到上述化合物的保留时间信息，用于供试品溶液中色谱峰的指认工作。
(4)指纹图谱相似度的计算及对照图谱的建立
重复步骤(1)、(2)，得到不同批次保健酒的色谱图，通过中药色谱指纹图谱相似度评价软件对得到的多批次色谱图进行指纹图谱相似度计算，并建立对照图谱。
(5)检测分析
按照步骤(1)对日常检测样品进行处理后得到供试品溶液，然后按照步骤(2)进行色谱分析，得到供试品溶液的色谱图，使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件计算样品色谱图与对照图谱的相似度，通过相似度结果判定样品结果是否符合要求。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤①中洗脱液浓缩采用真空度梯度下降浓缩方式，具体参数为：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤③中洗脱液浓缩采用真空度梯度下降浓缩方式，具体参数为：
。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中色谱分析条件如下：
色谱仪：美国Agilent 1260系列；
色谱柱：Sepax HP-C18柱，5μm，4.6×250mm；
流动相：乙腈-0.01％磷酸水溶液梯度洗脱；
流速：流速1.0mL/分钟；
检测波长：280nm；
柱温：30℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中相似度大于0.900时认为符合要求。
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