CN105004828A - 盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法 - Google Patents

Abstract

盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法，属于盐酸左旋咪唑检测方法技术领域，包括步骤一、对超高效液相色谱仪UPLC紫外检测器的基础数值进行设定；步骤二、盐酸左旋咪唑在水产品血浆中残留的提取；步骤三、盐酸左旋咪唑在水产品肌肉、肝胰脏以及肾脏中残留的提取；步骤四、盐酸左旋咪唑在水产品中含量的结果测定。本发明通过对前处理技术的优化、合理化组合，获得了良好的提取、净化效果；同时对超高效液相色谱条件进行了摸索和确证；提高了检测方法灵敏度、重复性和准确度，尤其使检测分析速度加快了数倍，减少试剂浪费、降低环境污染，适合大批量样品的残留检测。

Description

盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法

技术领域

本发明属于盐酸左旋咪唑检测方法技术领域，特别是涉及到一种应用超高效液相色谱测定盐酸左旋咪唑在水产品组织中的检测方法。

背景技术

盐酸左旋咪唑，英文名称：Levamisole Hydrochloride，分子式：C11H12N2S·ClH，分子量：240.757，化学结构如图1所示。中文别名：(S)-6-苯基-2,3,5,6-四氢-咪唑[2,1-B]噻唑单盐酸盐；L-2,3,5,6-四氢-6-苯基咪唑[2,1-6]噻唑盐酸盐；驱虫速；左旋四咪唑；(S)-(-)-6-苯基-2,3,5,6-四氢咪唑并[2,1-b]噻唑盐酸盐；左旋咪唑盐酸盐；L-2,3,5,6四氢-6-苯基咪唑并(2,1-B)噻唑的盐酸盐；盐酸左旋四咪唑。

盐酸左旋咪唑为四咪唑的左旋体，活性约为四咪唑(消旋体)的1～2倍，但毒副作用则较低。是农牧业生产和兽医临床上常用的广谱、高效的咪唑类驱虫药，对蛔虫、钩虫、蛲虫和粪类圆线虫病有较好疗效，而且还具有免疫调节功能。在水产动物体内它主要通过提高吞噬细胞和嗜中性粒细胞的活性、刺激淋巴细胞的产生或分泌淋巴因子，提高白细胞的代谢能力以及血清溶菌酶活力，诱发抗体的产生及补体的生成等来增强机体的免疫力，可用于水产动物的抗菌消炎、抗病毒和促进生长以及鱼类粘孢子虫病防治等方面。随着其在养殖业中广泛的应用，盐酸左旋咪唑在水产品中的残留问题也日益突出。为保证水产品食用安全性，保障人民群众的身体健康，加强水产品中的盐酸左旋咪唑残留的监督和检验工作，建立一种简单快速、灵敏度高的检测方法已是刻不容缓。目前，以畜、禽、药品为研究对象的盐酸左旋咪唑检测方法已有少量报道，主要采用的是滴定法、气质联用法和高效液相色谱法。而应用超高效液相色谱法的检测方法未见报道。

现有技术中测定盐酸左旋咪唑的滴定法：利用滴定法测定盐酸左旋咪唑的含量，人为因素误差大，基质干扰大，准确度低，对检出限有一定的限制，对于微量样品或者基质复杂样品的测定来说，滴定法显得力不从心。

现有技术中测定盐酸左旋咪唑的气质联用法：是利用气相色谱和质谱联用对化合物分离鉴定，检出限最低可达0.25ppm，该法虽是一种较好的定性确证方法，但仪器昂贵，不易普及。

现有技术当中测定盐酸左旋咪唑的高效液相色谱法：是利用高效液相色谱对化合物进行分离，然后利用化合物的紫外特性进行定性定量鉴定，但检测时间均较长。近年来,随着科学技术的进步和工业发展,各领域对液相色谱技术的要求日益提高。2004年研发出了基于小颗粒填料的液相色谱技术—超高效液相色谱(UPLC)，并成功地应用于各分析行业。UPLC采用了较小的1.7μm颗粒度的色谱柱填料，提高了柱效和分析速度，减少流动相溶剂消耗，弥补了传统高效液相色谱(HPLC)系统的不足。UPLC超高的分析速度极大地提高了大批量样品的分析效率。因此，本检测方法选用UPLC。

现有的盐酸左旋咪唑残留的检测方法中，很少系统地研究流动相的选择与配比以及流动相的pH值对出峰时间、峰形的影响。而且多数选择用磷酸二氢钠(钾)盐，而本方法中研究了不同pH的磷酸、磷酸二氢钠(钾)、水和乙腈作为流动相的区别，根据色谱结果，最终选择了pH＝7的磷酸溶液,一定pH值的磷酸溶液与乙腈的比例定为85:15，避免了使用盐给仪器和实验带来的麻烦。

现有的盐酸左旋咪唑残留的前处理方法中，以猪、牛、鸡等组织为研究对象的盐酸左旋咪唑残留检测方法虽有报道但较少，水产品各组织中残留的检测方法系统研究未见报道。而随着盐酸左旋咪唑在水产养殖业的应用，如果饲养过程中没有正确合理地使用该类药物，将导致其残留，给人体健康造成危害。由于此药物在鱼类体内的药代动力学及药残等方面的基础研究几乎属于空白。所以急需一个适宜的检测方法为此药物在鱼体中的药代动力学参数及其药残方面的研究提供基础。因此现有技术当中亟需要一种新型的技术方案来解决这一问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法，通过对前处理技术的优化、合理化组合，获得了良好的提取、净化效果；同时对超高效液相色谱条件进行了摸索和确证；提高了检测方法灵敏度、重复性和准确度，尤其使检测分析速度加快了数倍，减少试剂浪费、降低环境污染，适合大批量样品的残留检测。

盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法，其特征是：包括以下步骤，

步骤一、对超高效液相色谱仪UPLC紫外检测器的基础数值进行设定

色谱柱为2.1mm×50mm，粒径1.7μm，柱温为35℃，流动相V/V为0.05mol/L磷酸：乙腈＝85:15，三乙胺调pH至7，进样体积为5μl，紫外波检测波长为214nm，流速为0.4mL/min；

步骤二、盐酸左旋咪唑在水产品血浆中残留的提取

取水产品血浆样本1.0ml，放置于规格为15ml的离心管内，且向离心管中加入1ml硼酸缓冲液，振荡1min，继续向离心管中加入10ml的乙酸乙酯，漩涡振荡2min后，在4000r/min的条件下，置于离心机中离心5分钟，将离心管中的上清液转移至48位平行蒸发仪真空管中；

向经过上述操作的离心管中继续加入5mL乙酸乙酯，重复上述操作，合并两次操作获得的提取液，在45℃～55℃条件下，使用48位平行蒸发仪减压蒸发至无液体，向该蒸发后的真空管中加入200μl甲醇，进行震荡溶解，经0.22μm滤膜过滤待超高效液相色谱仪UPLC进行分析；

步骤三、盐酸左旋咪唑在水产品肌肉、肝胰脏以及肾脏中残留的提取

称取水产品肉质待检测样品5.00g放置于规格为50ml的离心管中，同时取5g在650℃下烘干4小时的无水Na₂SO₄加入离心管中，进行搅拌，再向该离心管中加入pH为9的1ml硼酸缓冲液，漩涡振荡2min，再向该离心管中加入15ml乙酸乙酯，涡旋振荡2min，继续超声10min，在4000r/min的条件下，置于离心机中离心10min，将该离心管中的有机相转移至规格为250ml的梨形瓶中；向该离心管中再加入10ml乙酸乙酯，按照上述方法继续对该离心管中的残渣进行提取，将获得的提取液合并至于上述梨形瓶中；

向上述操作后获得的装有乙酸乙酯提取液的250ml梨形瓶中加入0.1mol/L盐酸溶液15ml，震荡2min～3min后静置，分取下层备用；

取混合阳离子固相萃取小柱Waters Oasis MCX，规格为3ml/60mg，向固相萃取小柱中依次加入3ml甲醇、0.1mol/L盐酸溶液3ml进行活化；将所述步骤二中获得的的备用液过上述固相萃取柱，弃去流出液，依次用3ml水和3ml甲醇淋洗上述固相萃取柱，并吹至液体完全流出，取2ml 4％氨水甲醇溶液进行洗脱，保持流速为10滴/分钟～15滴/分钟，收集洗脱液于带刻度的玻璃离心管中，并定容至2ml，经0.22μm滤膜过滤后待超高效液相色谱仪UPLC分析；

步骤四、盐酸左旋咪唑在水产品中含量的结果测定

分别取浓度为0.1ug/ml、2.0ug/ml、10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml的盐酸左旋咪唑标准工作液上机测定，绘制标准曲线；

将所述步骤二和步骤三中超高效液相色谱仪UPLC分析的结果进行测定，采用外标法定量，且由定量结果得出水产品中盐酸左旋咪唑的含量。

所述步骤二中取水产品血浆样本1.0ml的误差值精确到0.01ml。

所述步骤三中取水产品肉质样本5.0g的误差值精确到0.01g。

所述硼酸缓冲液由6.18g硼酸与980ml水的混合液，加入10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至9.0，补加水到1000ml获得。

所述4％氨水的甲醇溶液由96ml甲醇溶液中加入4ml氨水混合均匀获得。

通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法，通过对前处理技术的优化、合理化组合，获得了良好的提取、净化效果；同时对超高效液相色谱条件进行了摸索和确证；提高了检测方法灵敏度、重复性和准确度，尤其使检测分析速度加快了数倍，减少试剂浪费、降低环境污染，适合大批量样品的残留检测。本发明用于残留检测的仪器选择了使用超高效液相色谱仪Waters ACQUITY UPLC，UPLC系统分析过程中，在保证分析结果质量的同时，实现了从每个样品中节省大量的时间与金钱。

本发明中对比了HPLC(C18,4.6mm×250mm，粒径5μm与4.6mm×150mm，粒径5μm)与UPLC(BEH C18，2.1mm×50mm，粒径1.7μm)两台仪器的不同规格的色谱柱，结果发现，UPLC比HPLC分离度高，而且出峰时间早了3倍～7.5倍,UPLC使色谱系统的工作效率更高，线性速度、流速、耐压范围更宽。

本发明用于测定样品色谱条件，对比了不同流动相组成(磷酸二氢钠溶液+乙腈，磷酸溶液+乙腈，水+乙腈)，以及不同pH值的磷酸二氢钠溶液和磷酸溶液，当流动相变化时色谱特征会随之变化。本实验选用磷酸二氢钠溶液分别用磷酸或三乙胺调到不同pH值2.5,4.5,6.5,7.0，7.5时，其与乙腈的比例为85:15(V/V)。pH＝2.5出峰太早，与溶剂效应峰相干扰；pH＝4.5时，即磷酸二氢钠溶液原酸碱度，不用调节pH值，但峰形出现了前伸；pH＝6.5-7.5时，出峰时间适中，峰形对称且尖锐，在实际残留检测中也无基质干扰。但用到了盐类，而超高液相色谱系统由于有着更细的管路以及色谱柱颗粒更微小，易于形成堵塞，使用过程中应尽量避免。在本发明中流动相直接选用了0.05mol/L磷酸用三乙胺调pH至7.0，其与乙腈比例仍为85:15(V/V)，盐酸左旋咪唑色谱特征峰与使用磷酸二氢钠时相比，紫外响应值更高，峰形对称且尖锐，在实际残留检测中也无基质干扰。故选择了85:15比例。出峰时间适中，且分离度良好。

本发明用于血浆提取的模式，盐酸左旋咪唑在碱性条件下有一定的质子化倾向，可以促进目标物质从组织中提取。而在碱性溶液中，盐酸左旋咪唑的电离受到抑制，导致其易于溶解在弱极性溶剂中如二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯等。本发明中应用乙酸乙酯作为提取剂，乙酸乙酯属于低毒性类别，用乙酸乙酯取代了现有报道中使用的氯仿、乙醚提取血浆中的盐酸左旋咪唑的方法，因为氯仿、乙醚均属于易制毒类药品，而且毒性均比乙酸乙酯大，有致癌性。用乙酸乙酯作为提取剂得到了很好的回收率，而且在加入硼酸缓冲液的前提下，还加快了提取效率。

本发明用于血浆浓缩的模式，采用了48位平行蒸发仪减压蒸发至干，向该蒸发干的真空管中各加入200μl甲醇震荡溶解，滤膜过滤后测定，获得了较高的回收率，且无杂质干扰。替代了现有报道中使用的氮吹浓缩方法，因为乙酸乙酯提取液量比较大，氮吹比较耗时，且氮吹时有机溶剂直接挥发到大气中，无法回收。采用48位平行蒸发仪减压蒸发至干的浓缩模式快速、适合大批量样品的检测，正好和超高效液相色谱紫外法检测样品速度相连接，解决了残留检测过程中前处理速度的瓶颈问题。

本发明用于肌肉、肝胰脏、肾脏的提取模式，在进行提取时，pH值可以改变溶质在组织体系中的形态，是影响提取效率的关键因素，盐酸左旋咪唑在碱性条件下其电离受到抑制，更易于溶解到弱极性有机溶剂中。并对比了水产品中常用的几种提取剂乙腈、乙酸乙酯。结果发现，乙酸乙酯的提取效率较高。本发明采用了在碱性环境下，用乙酸乙酯进行提取，提取效率高，试剂相对环保。而且在本发明中为了保证提取效率，对提取过程中的细节问题也做了具体要求，向离心管中加入5g无水Na₂SO₄后，一定要搅拌均匀，再向该离心管中加入1ml硼酸缓冲液(pH＝9)漩涡振荡2min，尽量使样品组织和缓冲液充分接触，再向该离心管中加入15ml乙酸乙酯，涡旋振荡2min，组织样品在溶液中呈糊状，仍要继续超声10min，再在4000r/min的条件下于离心机中离心10min。

本发明用于肌肉、肝胰脏、肾脏的净化模式，采取分部净化的方式，首先是液液萃取模式，再进一步固相萃取净化，最后用洗脱液进行洗脱，洗脱液用量也做了详细比较，根据结果用量定位2ml，即用2ml洗脱液进行洗脱，将洗脱液收集在带有刻度的玻璃管中，更有利于将收集到的洗脱液精确定容。

本发明所涉及的鱼各组织中的盐酸左旋咪唑主要是在碱性环境下用乙酸乙酯提取，通过旋转蒸发浓缩或通过液液萃取后、阳离子交换固相萃取柱富集净化，超高效液相紫外色谱法进行检测。本发明首次利用超高液相色谱紫外法测定水产品类别中的盐酸左旋咪唑残留。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：

图1为本发明盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法检测鱼各空白组织与标准品盐酸左旋咪唑的色谱示意图。

图2为本发明盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法中盐酸左旋咪唑在0.01ug/ml～200ug/ml范围内呈线性关系图。

图3为本发明盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法中不同流动相及PH值的色谱示意图。

图4为本发明盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法中不同仪器的色谱色柱示意图。

图5为本发明盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法中血浆提取效率示意图。

图6为本发明盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法中洗脱液用量对检测结果影响示意图。

图7为本发明盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法的操作流程示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但实施例不限制本发明，且发明中未述及之处适用于现有技术。

1、试剂和材料

除非另有说明，所有的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。乙腈：色谱纯。盐酸左旋咪唑标准品：CAS 16595-80-5，含量≥99.0％。

硼酸缓冲液：称取6.18g硼酸，加入980ml水，待溶解后摇匀，用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至9.0，补加水到1000ml。

含4％氨水的甲醇溶液：向96ml甲醇溶液中加入4ml氨水，混匀。

2、仪器和设备

本检测方法中的色谱仪为Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪，配有紫外检测器。

离心机：转速不低于4000r/min。

漩涡振荡器。

旋蒸仪：步琦48位平行蒸发仪。

固相萃取小柱：Waters Oasis MCX混合阳离子(3mL，60mg)。

以下，结合实施例以及附图详细说明本发明的检测方法。

实施例一、超高效液相色谱条件--不同配比流动相的对比实验。

(1)除流动相以外的其他色谱条件

仪器：Waters ACQUITY UPLC(带紫外检测器)；

色谱柱：Waters BEH C18(2.1mm×50mm，粒径1.7μm)；

柱温：35℃；

进样体积：5μL。

紫外检测波长：214nm。

流速：0.4mL/min；

(2)不同流动相组成

pH值7.0的磷酸溶液与乙腈的比例分别为90:10，85:15，80:20。

(3)结果

色谱分析结果如图3，如图所示，当流动相变化时色谱峰会随之变化，本实验中选用了其中的pH＝7.0磷酸溶液。流动相pH值7.0的磷酸溶液与乙腈的比例变化90:10,85:15,80:20出峰时间会随之变化，乙腈含量越高，出峰越早，而且峰越尖锐，出峰时间晚峰高变低，峰变宽。本发明中在考虑了节省时间同时不受溶剂或基质峰干扰，故选择了85:15比例。

实施例二、盐酸左旋咪唑在UPLC与传统的HPLC上色谱行为的比较。

(1)UPLC色谱条件

仪器：Waters ACQUITY UPLC(带紫外检测器)；

色谱柱：Waters BEH C18(2.1mm×50mm，粒径1.7μm)；

流动相：0.05mol/L磷酸(三乙胺调pH至7)：乙腈＝85:15(V/V)；

柱温：35℃；

进样体积：5μL。

紫外检测波长：214nm。

流速：0.4mL/min；

(2)HPLC色谱条件

仪器：Waters 1525(带紫外检测器)；

色谱柱：Waters symmetry C18(4.6mm×150mm，粒径5μm)；

流动相：0.05mol/L磷酸(三乙胺调pH至7)：乙腈＝75:25(V/V)；

柱温：35℃；

进样体积：20μL。

紫外检测波长：214nm。

流速：1.0mL/min；

(3)HPLC色谱条件

仪器：Waters 1525(带紫外检测器)；

色谱柱：Waters symmetry C18(4.6mm×250mm，粒径5μm)

流动相：0.05mol/L磷酸(三乙胺调pH至7)：乙腈＝60:40(V/V)；

柱温：35℃；

进样体积：20μL。

紫外检测波长：214nm。

流速：1.0mL/min；

(4)结果

色谱分析结果如图4，图4是Waters1525HPLC与Waters ACQUITY UPLC色谱工作站得到的谱图，其中图中色谱峰编号对应如上顺序色谱条件。盐酸左旋咪唑在2.5min出峰的是(1)条件下UPLC的色谱行为，即本发明应用的色谱条件；盐酸左旋咪唑在(2)条件下，将色谱柱换成Waters symmetry C18(4.6mm×150mm，粒径5μm)盐酸左旋咪唑在8.2min出现特征峰。盐酸左旋咪唑在(3)HPLC色谱柱为Waters symmetry C18(4.6mm×250mm，粒径5μm)条件下，将流动相比例调整为0.05mol/L磷酸(三乙胺调pH至7)：乙腈＝60:40(V/V)，盐酸左旋咪唑特征峰在6.0min出峰。在如上三种色谱柱条件下，均能实现盐酸左旋咪唑残留的检测。但本发明中选用了时间最短，效率最高的UPLC法。

实施例三、对水产品血浆中盐酸左旋咪唑提取剂的比较。

(1)色谱条件

仪器：Waters ACQUITY UPLC(带紫外检测器)；

色谱柱：Waters BEH C18(2.1mm×50mm，粒径1.7μm)；

流动相：0.05mol/L磷酸(三乙胺调pH至7)：乙腈＝85:15(V/V)；

柱温：35℃；

进样体积：5μL。

紫外检测波长：214nm。

流速：0.4mL/min；

(2)实验步骤

准确吸取血浆样品1mL放置于规格为15mL的离心管中，向该离心管中加入1mL硼酸缓冲液(pH＝9)，再向该离心管中加入10mL乙酸乙酯/乙腈，漩涡震荡2分钟，在4000r/min的条件下于离心机中离心5分钟，将该离心管中的上清液转移至BUCHI 48位平行蒸发仪真空管中；向离心管中再加入5mL乙酸乙酯/乙腈，重复上述操作一次，合并两次提取液，在45℃～55℃条件下，使用BUCHI 48位平行蒸发仪减压蒸发至干，向该蒸发干的真空管中加入200μl甲醇震荡溶解，经0.22μm滤膜过滤后待UPLC色谱仪分析。

(3)结果如图5所示，色谱峰为盐酸左旋咪唑标准品的色谱峰，同样的条件下，乙腈作为提取剂的提取效率相对乙酸乙酯低。

实施例四、盐酸左旋咪唑的标准曲线测定实验。

(1)色谱条件同实施例3。

(2)实验步骤

盐酸左旋咪唑标准溶液的配制：精密称取0.0200g标准品于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配置成质量浓度为200ug/ml的标准储备液。然后用甲醇稀释浓度梯度为0.1ug/ml，2.0ug/ml，10ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml的标准工作液。

(3)结果

上述不同浓度的盐酸左旋咪唑标准溶液上机测定，由色谱工作站绘制标准曲线，如图2所示，盐酸左旋咪唑在0.1ug/ml—200ug/ml范围内，呈现良好线性关系，相关系数均达到0.999，回归方程为Y＝9.926e+004X+4.38e+004。其中，Y表示色谱峰峰面积，X表示盐酸左旋咪唑的质量浓度。

实施例五、用于肌肉、肝胰脏、肾脏的净化洗脱模式中，在目标物吸附模式下洗脱液用量对结果的影响实验。

(1)色谱测定条件

仪器：Waters ACQUITY UPLC(带紫外检测器)；

色谱柱：Waters BEH C18(2.1mm×50mm，粒径1.7μm)；

流动相：0.05mol/L磷酸(三乙胺调pH至7)：乙腈＝85:15(V/V)；

柱温：35℃；

进样体积：5μL。

紫外检测波长：214nm。

流速：0.4mL/min；

(2)实验步骤

(a)取1ml的10ug/ml盐酸左旋咪唑标准溶液3份分别放到10ml带刻度的离心管中，之后用0.1mol/L盐酸溶液定容到10ml，备用；

(b)取Waters Oasis MCX混合阳离子固相萃取小柱3个，规格为3ml/60mg，向该固相萃取小柱中依次加入3ml甲醇、0.1mol/L盐酸溶液3ml活化，将步骤(a)中的备用液过柱，弃去流出液，依次用3ml水和3ml甲醇淋洗柱子并吹干，分别用1ml、2ml、3ml 4％氨水甲醇溶液洗脱，保持流速为10-15滴/分钟，收集洗脱液于带刻度的玻璃离心管中，并分别定容至1ml、2ml、3ml，经0.22μm滤膜过滤后待UPLC色谱仪分析，观察不同用量对结果的影响。

(3)结果

色谱分析结果如图6所示。图6是UPLC工作站得到的色谱图，其中，色谱峰为盐酸左旋咪唑标准品的色谱峰，图中，横坐标表示色谱峰的保留时间，单位是分钟，纵坐标表示紫外强度。图中分别是1ml、2ml、3ml用量，故计算结果分别应该是其1倍、2倍、3倍相等，并相当于10ug/ml标准品的面积，而从结果可以看出，在此条件下用1ml洗脱液，未能完全洗脱回收率稍低，用2ml，3ml均洗脱完全，均完全回收，考虑节省试剂和回收率问题，本实验中选用2ml洗脱液。

实施例六、水产品各组织样品中盐酸左旋咪唑的残留测定，如图7所示。

(1)色谱测定条件

仪器：Waters ACQUITY UPLC(带紫外检测器)；

色谱柱：Waters BEH C18(2.1mm×50mm，粒径1.7μm)；

流动相：0.05mol/L磷酸(三乙胺调pH至7)：乙腈＝85:15(V/V)；

柱温：35℃；

进样体积：5μL。

紫外检测波长：214nm。

流速：0.4mL/min；

(2)实验步骤

(a)盐酸左旋咪唑在水产品血浆中残留的检测方法，其特征是：

准确吸取血浆样品1mL放置于规格为15mL的离心管中，向该离心管中加入1mL硼酸缓冲液(pH＝9)，再向该离心管中加入10mL乙酸乙酯，漩涡震荡2分钟，在4000r/min的条件下于离心机中离心5分钟，将该离心管中的上清液转移至BUCHI 48位平行蒸发仪真空管中；向离心管中再加入5mL乙酸乙酯，重复上述操作一次，合并两次提取液，在45℃～55℃条件下，使用步琦48位平行蒸发仪减压蒸发至干，向该蒸发干的真空管中加入200μl甲醇震荡溶解，经0.22μm滤膜过滤后待UPLC色谱仪分析。

(b)盐酸左旋咪唑在水产品肌肉、肝胰脏、肾脏中残留的检测方法，其特征是：

步骤一、提取

称取样品5.00g放置于规格为50ml的离心管中，向该离心管中加入5g在650°温度下烘干4小时的无水Na₂SO₄，搅拌均匀，再向该离心管中加入1ml硼酸缓冲液(pH＝9)漩涡振荡2min，使样品组织和缓冲液充分接触，再向该离心管中加入15ml乙酸乙酯，涡旋振荡2分钟，组织样品在溶液中呈糊状，继续超声10min，再在4000r/min的条件下于离心机中离心10分钟，将该离心管中的有机相转移至规格为250ml的梨形瓶中；向该离心管中再加入10ml乙酸乙酯，按照上述方法继续对该离心管中的残渣进行提取，合并提取液于上述梨形瓶中；

步骤二、液液萃取

向上述装有乙酸乙酯提取液的250ml梨形瓶中加入0.1mol/L盐酸溶液15ml，震荡2～3分钟，静置，分取下层，备用；

步骤三、固相萃取

取Waters Oasis MCX混合阳离子固相萃取小柱，规格为3ml/60mg，向该固相萃取小柱中依次加入3ml甲醇、0.1mol/L盐酸溶液3ml活化，将步骤二中的备用液过柱，弃去流出液，依次用3ml水和3ml甲醇淋洗柱子并吹干，用2ml 4％氨水甲醇溶液洗脱，保持流速为10～15滴/分钟，收集洗脱液于带刻度的玻璃离心管中，并定容至2ml，经0.22μm滤膜过滤后待UPLC色谱仪分析。

(3)标准曲线的绘制同实施例4。

(4)进样分析，将处理好的样品注入超高液相色谱仪，如图1所示为色谱图。

(5)根据仪器色谱工作站给出的峰面积数据，保留时间定性，外标法定量，计算鱼各组织样品中盐酸左旋咪唑的含量。

(6)测定结果：该水产品各组织样品均未检出盐酸左旋咪唑。

实施例七、水产品各组织样品中盐酸左旋咪唑的残留测定的方法学验证

通过考察方法灵敏度、重复性、回收率指标，对本发明的方法进行方法学验证。

(a)灵敏度实验

按照实施例5(2)项所述方法分别处理各空白组织样品和各组织的加标样品，按照实施例3的色谱测定条件分析测定，得到各空白组织在盐酸左旋咪唑保留时间范围内的基线噪声，按照3倍信噪比计算方法定性检出限，10倍信噪比计算方法定性检出限，并经实际加标验证测得血浆中盐酸左旋咪唑的方法定性检出限为0.01μg/ml,定量检出限为0.03μg/ml。其他组织中盐酸左旋咪唑的方法定性检出限为2μg/kg,定量检出限为6μg/kg。

本检测方法在淡水养殖鱼类血浆中盐酸左旋咪唑在0.03μg/ml、0.10μg/ml、0.3μg/ml添加浓度的回收率为75％～105％；本检测方法在鱼肌肉、肝胰脏、肾脏组织中的盐酸左旋咪唑在6μg/kg、20μg/kg、60μg/kg添加浓度的回收率为70％～110％.

本检测方法检测信号仅与盐酸左旋咪唑有关。色谱峰尖锐且对称，杂质和标样峰分离良好，标准物质、血浆空白、肝胰脏空白、肾脏空白谱图见图2。

本检测方法盐酸左旋咪唑在0.01ug/ml-200ug/ml范围内呈线性关系见图3，相关系数R²＝0.9999。

(b)准确度和精密度实验

按照实施例五所述方法处理测定加标组织样品，以确定不同添加水平下测定结果的准确度和精密度。血浆中盐酸左旋咪唑的添加浓度分别为0.03μg/ml、0.10μg/ml、0.3μg/ml，其他组织中盐酸左旋咪唑的添加浓度分别为6μg/kg、20μg/kg、60μg/kg，各个组织中的每个添加浓度设6个平行试验，连续测定7天，分别计算批内和批间盐酸左旋咪唑的回收率及其变异系数，试验结果表明，在3个不同添加水平下，无论是批内还是批间，各测试样品的平均回收率均在70％～105％之间，变异系数均小于10％，由此可见该方法符合相关标准要求，适用性好，重现性好，准确度高。

由以上方法学验证结果可知，本发明的方法准确度高，重现性好。可以用作水产品各组织中盐酸左旋咪唑的残留检测。此法可为盐酸左旋咪唑在水产养殖中合理应用、制定休药期等提供科学的实验基础，以及为食品安全及水产品兽药残留检测具有广阔的应用前景。

Claims (5)

1.盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法，其特征是：包括以下步骤，

步骤一、对超高效液相色谱仪UPLC紫外检测器的基础数值进行设定

色谱柱为2.1mm×50mm，粒径1.7μm，柱温为35℃，流动相V/V为0.05mol/L磷酸：乙腈＝85:15，三乙胺调pH至7，进样体积为5μl，紫外波检测波长为214nm，流速为0.4mL/min；

步骤二、盐酸左旋咪唑在水产品血浆中残留的提取

取水产品血浆样本1.0ml，放置于规格为15ml的离心管内，且向离心管中加入1ml硼酸缓冲液，振荡1min，继续向离心管中加入10ml的乙酸乙酯，漩涡振荡2min后，在4000r/min的条件下，置于离心机中离心5分钟，将离心管中的上清液转移至48位平行蒸发仪真空管中；

向经过上述操作的离心管中继续加入5mL乙酸乙酯，重复上述操作，合并两次操作获得的提取液，在45℃～55℃条件下，使用48位平行蒸发仪减压蒸发至无液体，向该蒸发后的真空管中加入200μl甲醇，进行震荡溶解，经0.22μm滤膜过滤待超高效液相色谱仪UPLC进行分析；

步骤三、盐酸左旋咪唑在水产品肌肉、肝胰脏以及肾脏中残留的提取

称取水产品肉质待检测样品5.00g放置于规格为50ml的离心管中，同时取5g在650℃下烘干4小时的无水Na₂SO₄加入离心管中，进行搅拌，再向该离心管中加入pH为9的1ml硼酸缓冲液，漩涡振荡2min，再向该离心管中加入15ml乙酸乙酯，涡旋振荡2min，继续超声10min，在4000r/min的条件下，置于离心机中离心10min，将该离心管中的有机相转移至规格为250ml的梨形瓶中；向该离心管中再加入10ml乙酸乙酯，按照上述方法继续对该离心管中的残渣进行提取，将获得的提取液合并至于上述梨形瓶中；

向上述操作后获得的装有乙酸乙酯提取液的250ml梨形瓶中加入0.1mol/L盐酸溶液15ml，震荡2min～3min后静置，分取下层备用；

取混合阳离子固相萃取小柱Waters Oasis MCX，规格为3ml/60mg，向固相萃取小柱中依次加入3ml甲醇、0.1mol/L盐酸溶液3ml进行活化；将所述步骤二中获得的的备用液过上述固相萃取小柱，弃去流出液，依次用3ml水和3ml甲醇淋洗上述固相萃取小柱，并吹至液体完全流出，取2ml 4％氨水甲醇溶液进行洗脱，保持流速为10滴/分钟～15滴/分钟，收集洗脱液于带刻度的玻璃离心管中，并定容至2ml，经0.22μm滤膜过滤后待超高效液相色谱仪UPLC分析；

步骤四、盐酸左旋咪唑在水产品中含量的结果测定

分别取浓度为0.1ug/ml、2.0ug/ml、10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml盐酸左旋咪唑标准工作液上机测定，绘制标准曲线；

将所述步骤二和步骤三中超高效液相色谱仪UPLC分析的结果进行测定，采用外标法定量，且由定量结果得出水产品中盐酸左旋咪唑的含量。

2.根据权利要求1所述的盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法，其特征是：所述步骤二中取水产品血浆样本1.0ml的误差值精确到0.01ml。

3.根据权利要求1所述的盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法，其特征是：所述步骤三中取水产品肉质样本5.0g的误差值精确到0.01g。

4.根据权利要求1所述的盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法，其特征是：所述硼酸缓冲液由6.18g硼酸与980ml水的混合液，加入10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至9.0，补加水到1000ml获得。

5.根据权利要求1所述的盐酸左旋咪唑在水产品各组织中残留的检测方法，其特征是：所述4％氨水的甲醇溶液由96ml甲醇溶液中加入4ml氨水混合均匀获得。