CN112730380A - 一种检测禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的sers方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的SERS方法，属于食品检测领域。本发明将不同浓度的左旋咪唑盐酸盐标准溶液与金溶胶混合，进行拉曼检测，得到该浓度范围的SERS光谱图；将左旋咪唑盐酸盐固体、甲醇与标准溶液的SERS谱图的主要特征峰进行对比指认，同时计算模拟液的SERS峰积分强度与左旋咪唑盐酸盐浓度之间的线性关系，判断检测范围和下限；采取一次液液萃取法对禽畜肉中的左旋咪唑盐酸盐进行提取，提取后的上清液氮吹蒸干用水复溶，即得待测样品，待测样品与金纳米溶胶混合后，即可进行检测。本发明利用一次液液萃取法提取禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐进行检测，具有快速、简单、增强效果好的优点。

Description

一种检测禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的SERS方法
技术领域
本发明涉及一种检测禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的SERS方法，属于食品检测领域。
背景技术
左旋咪唑(Levamisole)又名左咪唑、左旋四咪哇、驱虫速等，主要以盐酸盐形式存在。左旋咪唑是一种广谱抗虫药，驱虫机理主要为抑制虫体肌肉的琥珀酸脱氢酶的活性与抑制胆碱酯酶的活性，使虫体能量代谢受阻，肌肉麻痹，达到驱虫效果，被广泛应用于抗牛、羊等牲畜体内的线虫。同时左旋咪唑具有特殊的免疫调节作用，在动物养殖中常用于抗菌消炎、抗病毒、促生长等方面。当左旋咪唑因不合理使用在动物体内形成残留时，随着食物链的蓄积作用，左旋咪唑在人体内的浓度也会不断增加，从而对人体造成危害。研究表明左旋咪唑对于消化系统、神经系统、心血管系统等均有一定的毒副作用，并且左旋咪唑在使用时极易被机体吸收与代谢。
目前，对于禽畜肉中的左旋咪唑盐酸盐常用检测方法主要有高效液相色谱、液相色谱串联质谱法、气相色谱结合质谱和高效液相色谱串联质谱法。这些方法具有灵敏度和准确度较高、应用范围广的优点，但是存在设备昂贵、前处理复杂等限制，在实际检测中使用受到一定的限制。
发明内容
为了解决上述至少一个问题，本发明提供了一种检测禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的表面增强拉曼光谱的方法，操作简单、检测快速、成本低廉，检测限可达到限量值，对于SERS(表面增强拉曼光谱)检测兽药残留具有重要意义。
本发明的第一个目的是提供一种检测左旋咪唑盐酸盐的表面增强拉曼光谱的方法，包括如下步骤：
(1)确定左旋咪唑盐酸盐的特征峰627cm-1、969cm-1；
(2)取左旋咪唑盐酸盐加入待测样液中，制备得到多组梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐待测样液作为标准曲线模拟液；将标准曲线模拟液进行拉曼检测，得到标准曲线模拟液的拉曼光谱；通过计算模拟液特征峰627cm-1、969cm-1处的积分峰强与模拟液中左旋咪唑盐酸盐浓度之间的线性关系，做出标准曲线；其中，模拟液中左旋咪唑盐酸盐浓度为左旋咪唑盐酸盐的质量和待测样液体积的比值；忽略待测样液中左旋咪唑盐酸的质量，待测样液只是作为溶剂；
(3)将待测样液进行拉曼检测，之后根据步骤(2)的标准曲线，得到待测样液中左旋咪唑盐酸盐的浓度。
在本发明的一种实施方式中，所述的待测样液包括禽畜肉提取液。
在本发明的一种实施方式中，所述的待测样液的制备方法为：
将待测样品与硫酸钠、氢氧化钠溶液、提取溶剂混合均匀、离心后取上清液；残留物重复提取一次，将两次提取得到的上清液合并，氮吹至干，复溶得到待测样液。
在本发明的一种实施方式中，所述的提取溶剂为正己烷。
本发明的第二个目的是提供一种检测禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的表面增强拉曼光谱的方法，包括如下步骤：
(1)确定左旋咪唑盐酸盐的特征峰：
将左旋咪唑盐酸盐溶解在甲醇中，得到多梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐标准溶液；之后将多梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐溶液进行拉曼检测，得到多梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐标准溶液的拉曼光谱；对比左旋咪唑盐酸盐固体、多梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐标准溶液、甲醇的拉曼光谱确认左旋咪唑盐酸盐的定量特征峰627cm-1、969cm-1；
(2)标准曲线：
将搅碎禽畜肉与硫酸钠、氢氧化钠溶液、提取溶剂混合均匀、离心后取上清液；残留物重复提取一次，将两次提取得到的上清液合并，氮吹至干，复溶得到禽畜肉空白提取液；
取左旋咪唑盐酸盐加入禽畜肉空白提取液中，制备得到多组梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐禽畜肉提取液作为标准曲线模拟液；将标准曲线模拟液进行拉曼检测，得到标准曲线模拟液的拉曼光谱；通过计算模拟液特征峰627cm-1、969cm-1处的积分峰强与左旋咪唑盐酸盐浓度之间的线性关系，做出标准曲线；其中，模拟液中左旋咪唑盐酸盐浓度为左旋咪唑盐酸盐的质量和待测样液体积的比值；忽略待测样液中左旋咪唑盐酸的质量，待测样液只是作为溶剂；
(3)样品检测：
将待测搅碎禽畜肉按照步骤(2)中禽畜肉空白提取液的提取方法得到禽畜肉提取液；将得到的禽畜肉提取液进行拉曼检测，得到禽畜肉提取液的拉曼光谱，之后根据步骤(2)的标准曲线，得到待测搅碎禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的含量。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的多梯度浓度为0.1～500mg/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)-(3)中拉曼光谱检测的条件是：以金溶胶为拉曼增强基底，按照样品(左旋咪唑盐酸盐固体、多梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐标准溶液、甲醇、标准曲线模拟液)和金溶胶的体积比为1：2将样品和金溶胶混合均匀，之后用激发光源为785nm的激光拉曼光谱仪进行扫描，扫描时间为3-10s，得到样品的拉曼光谱。
在本发明的一种实施方式中，金溶胶的制备方法为：
加入47mL超纯水与3mL10 mg/mL氯金酸钾于圆底烧瓶内，充分混合，放入120℃油浴锅内，磁力搅拌器565r/min搅拌并保持温度恒定至溶液沸腾；加入2mL的质量分数为1％柠檬酸三钠水溶液，继续在120℃下恒温搅拌20min，得金纳米溶胶，冷却至常温，冷藏保存备用。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中搅碎禽畜肉与硫酸钠的质量比为1：2。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中搅碎禽畜肉与NaOH溶液的质量体积比为2.5g：4mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中NaOH溶液的浓度为5mol/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的提取溶剂为正己烷。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中搅碎禽畜肉与提取溶剂的质量体积比为2.5g：10mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的离心是4℃10000r/min离心10min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的氮吹是45℃氮吹。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的复溶是加入超纯水复溶。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的多梯度浓度为0.1～25mg/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中627cm-1处的标准曲线为Y＝4756.98X+7154.53，相关系数为0.9882；969cm-1处的标准曲线为Y＝3400.48X+6326.64，相关系数为0.9692。
在本发明的一种实施方式中，所述的禽畜肉空白提取液的提取方法具体为：称取2.5g搅碎的禽畜肉放入50mL离心管中，之后加入5g无水硫酸钠，4mL 5mol/L的NaOH溶液和10mL提取溶剂正己烷，涡旋混匀；之后4℃10000r/min离心10min，取上清液；离心管中残留物按上述步骤再重复提取一次；将两次提取得到的上清液合并；取全部上清液45℃氮吹至干，加入2.5mL超纯水复溶得到禽畜肉空白提取液。
本发明的第三个目的是本发明的方法在食品检测领域中的应用。
本发明的第四个目的是本发明的方法在检测禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的应用。
本发明的有益效果：
(1)与采用液相色谱、气相色谱等大型仪器对样品进行检测相比，本发明对禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的检测方法，操作简便，处理时间短，对操作人员的专业水平要求低。
(2)本发明采用金纳米溶胶作为SERS基底，合成简单，激发光波长785nm条件下检测，检测精度高，时间短。单个样品处理检测全过程(提取+检测)约30分钟，多个样品检测时，平均每个样品仅需要6分钟，适用于禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的现场快速处理检测。
(3)本发明对禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的检测灵敏性高，对左旋咪唑盐酸盐的检出限达到0.5mg/L，符合现场快速检测的要求。
附图说明
图1为实施例1提供的左旋咪唑盐酸盐标准溶液SERS光谱图，其中(a)为左旋咪唑盐酸盐固体；(b)甲醇；(c)为浓度100mg/mL左旋咪唑盐酸盐标准溶液。
图2为实施例1提供的左旋咪唑盐酸盐模拟液SERS光谱图。
图3为627cm-1峰处SERS峰强信号值与左旋咪唑盐酸盐浓度对数的线性关系图。
图4为969cm-1峰处SERS峰强信号值与左旋咪唑盐酸盐浓度对数的线性关系图。
图5为实施例1提供的不同加标浓度得到的禽畜肉提取液的SERS光谱图，其中(a)为左旋咪唑盐酸盐固体；(b)为猪肉空白提取液，(c)为加标浓度0.5mg/mL左旋咪唑盐酸盐猪肉加标提取液，(d)为加标浓度1mg/mL左旋咪唑盐酸盐猪肉加标提取液，(e)为加标浓度10mg/mL左旋咪唑盐酸盐猪肉加标提取液。
图6为对照例1提供的不同溶剂提取猪肉中左旋咪唑盐酸盐后得到的SERS光谱图，其中(a)为左旋咪唑盐酸盐固体；(b)为三氯甲烷提取空白，(c)为乙酸乙酯提取空白，(d)为正己烷提取空白，(e)为三氯甲烷提取加标浓度100mg/mL左旋咪唑盐酸盐，(f)为乙酸乙酯提取加标浓度100mg/mL左旋咪唑盐酸盐，(g)为正己烷提取加标浓度100mg/mL左旋咪唑盐酸盐。
图7为对照例1提供的左旋咪唑盐酸盐不同特征峰强度随提取溶剂种类变化的曲线图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1
一种检测禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的表面增强拉曼光谱的方法，包括如下步骤：
(1)金溶胶的制备：
加入47mL超纯水与3mL10 mg/mL氯金酸钾于圆底烧瓶内，充分混合，放入120℃油浴锅内，磁力搅拌器565r/min搅拌并保持温度恒定至溶液沸腾；加入2mL的质量分数为1％柠檬酸三钠水溶液继续在120℃下恒温搅拌20min，得金纳米溶胶，冷却至常温，冷藏保存备用；
(2)确认特征峰：
用分析天平称取100g左旋咪唑盐酸盐于50mL烧杯中，加入甲醇用玻璃杯搅拌，转移至100mL容量瓶定容至1g/mL；得到左旋咪唑盐酸盐标准溶液；
取10μL左旋咪唑盐酸盐标准溶液(左旋咪唑盐酸盐固体、甲醇)与20μL金溶胶混合后滴加到玻片上，用激发光源为785nm的激光拉曼光谱仪进行扫描，扫描时间为3-10s，得到左旋咪唑盐酸盐溶液的SERS光谱图，如图1所示；对比左旋咪唑盐酸盐固体、左旋咪唑盐酸盐溶液、甲醇的拉曼光谱，确定左旋咪唑盐酸盐的特征峰为469cm-1，516cm-1，627cm-1，969cm-1，1126cm-1。
其中469cm-1处为C-N-S五元环变形振动，516cm-1处为苯环变形、苯环上C跟盐酸分子的H作用、苯环和相邻五元环作用，627cm-1处为亚甲基扭曲振动、C-S键伸缩振动、N-C-N面外摇摆，969cm-1处为苯环变形振动，1126cm-1处为苯环H-C-C-H剪式振动。选择峰强响应值较高的627cm-1与969cm-1作为定量特征峰。
(3)标准曲线
称取2.5g搅碎的猪肉放入50mL离心管中，之后加入5g无水硫酸钠，4mL5 mol/L的NaOH溶液和10mL正己烷，涡旋混匀；在4℃10000r/min离心10min，取上清液；离心管中残留物按上述步骤再重复提取一次；将两次提取得到的上清液合并；取全部上清液45℃氮吹至干，加入2.5mL超纯水复溶得到猪肉空白提取液。
在100mL容量瓶中加入10mg左旋咪唑盐酸盐和猪肉空白提取液定容至左旋咪唑盐酸盐的浓度为100mg/L，用超纯水将左旋咪唑盐酸盐猪肉空白提取液依次稀释到25mg/L、10mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L、0.1mg/L。
取10μL左旋咪唑盐酸盐猪肉空白提取液与20μL金溶胶混合后滴加到玻片上，用激发光源为785nm的激光拉曼光谱仪进行扫描，扫描时间为3-10s，得到浓度范围0.1～10mg/L左旋咪唑盐酸盐猪肉提取液的SERS光谱图，如图2所示，检测限为0.5mg/L。
选定627cm-1、969cm-1处峰的SERS信号强度与猪肉提取液中左旋咪唑盐酸盐浓度作图得到标准曲线，如图3所示，627cm-1处标准曲线的线性方程为Y＝4756.98X+7154.53，相关系数为0.988；如图4所示，969cm-1处标准曲线的线性方程为Y＝3400.48X+6326.64，相关系数为0.9692，表明627cm-1、969cm-1处峰的SERS积分强度与猪肉提取液中左旋咪唑盐酸盐的浓度存在良好的线性关系。
(3)加标回收率的测试：
在待测样品(搅碎猪肉)2.5g中加入不同浓度(0.5、1、10mg/mL)的左旋咪唑盐酸盐标准溶液(250μL)混合均匀后，之后加入5g无水硫酸钠，4mL5 mol/L的NaOH溶液和10mL正己烷，涡旋混匀；在4℃10000r/min离心10min，取上清液；离心管中残留物按上述步骤再重复提取一次；将两次提取得到的上清液合并；取全部上清液45℃氮吹至干，加入2.5mL超纯水复溶得到猪肉加标提取液；
取10μL猪肉加标提取液与20μL金溶胶混合后滴加到玻片上，用激发光源为785nm的激光拉曼光谱仪进行扫描，扫描时间为3-10s，得到浓度范围0.5～10mg/L左旋咪唑盐酸盐猪肉加标提取液的SERS光谱图，具体如图5所示。
之后根据步骤(2)的猪肉空白模拟液得标准曲线(627cm-1：y＝4756.98x+7154.53)，得到样品中左旋咪唑盐酸盐的含量，得到加标回收率为80.39％～95.94％，可用于测定猪肉中的左旋咪唑盐酸盐含量。
对照例1
调整实施例1中猪肉提取液中的提取溶剂正己烷为乙酸乙酯或三氯甲烷，其他和实施例1保持一致，进行检测。
检测结果见图6、图7，从图6和图7中可以看出：采用乙酸乙酯或三氯甲烷作为提取溶剂时，得到的猪肉空白提取液SERS图谱中出现杂质峰，对左旋咪唑盐酸盐的检测造成干扰，同时左旋咪唑盐酸盐特征峰的SERS响应值降低，因此选择正己烷作为禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的提取溶剂。
对照例2
调整实施例1中标准曲线模拟液和金溶胶的体积比、左旋咪唑盐酸盐猪肉加标提取液与金溶胶的体积比为1：1或1：3，其他和实施例1保持一致，进行检测。
检测结果为：随着提取液与金溶胶的体积比的增加，左旋咪唑盐酸盐特征峰SERS信号值先增加后减小，当体积比为1：2时SERS信号值达到峰值。当金溶胶体积较小时，体系中的左旋咪唑盐酸盐无法跟金纳米粒子完全结合，导致信号值较低；而当金溶胶体积过大时，多余的金纳米粒子会增加空间位阻，影响热点的产生，导致左旋咪唑盐酸盐与金纳米粒子结合的SERS信号值偏低，因此选择左旋咪唑盐酸盐猪肉加标提取液与金溶胶的体积比1：2为最佳检测条件。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的技术和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种检测左旋咪唑盐酸盐的表面增强拉曼光谱的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)确定左旋咪唑盐酸盐的特征峰627cm-1、969cm-1；
(2)取左旋咪唑盐酸盐加入待测样液中，制备得到多组梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐待测样液作为标准曲线模拟液；将标准曲线模拟液进行拉曼检测，得到标准曲线模拟液的拉曼光谱；通过计算模拟液特征峰627cm-1、969cm-1处的积分峰强与模拟液中左旋咪唑盐酸盐浓度之间的线性关系，做出标准曲线；
(3)将待测样液进行拉曼检测，之后根据步骤(2)的标准曲线，得到待测样液中左旋咪唑盐酸盐的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样液包括禽畜肉提取液。
3.一种检测禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的表面增强拉曼光谱的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)确定左旋咪唑盐酸盐的特征峰：
将左旋咪唑盐酸盐溶解在甲醇中，得到多梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐标准溶液；之后将多梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐溶液进行拉曼检测，得到多梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐标准溶液的拉曼光谱；对比左旋咪唑盐酸盐固体、多梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐标准溶液、甲醇的拉曼光谱确认左旋咪唑盐酸盐的定量特征峰627cm-1、969cm-1；
(2)标准曲线：
将搅碎禽畜肉与硫酸钠、氢氧化钠溶液、提取溶剂混合均匀，离心后取上清液；残留物重复提取一次，将两次提取得到的上清液合并，氮吹至干，复溶得到禽畜肉空白提取液；
取左旋咪唑盐酸盐加入禽畜肉空白提取液中，制备得到多组梯度浓度的左旋咪唑盐酸盐禽畜肉提取液作为标准曲线模拟液；将标准曲线模拟液进行拉曼检测，得到标准曲线模拟液的拉曼光谱；通过计算模拟液特征峰627cm-1、969cm-1处的积分峰强与左旋咪唑盐酸盐浓度之间的线性关系，做出标准曲线；
(3)样品检测：
将待测搅碎禽畜肉按照步骤(2)中禽畜肉空白提取液的提取方法得到禽畜肉提取液；将得到的禽畜肉提取液进行拉曼检测，得到禽畜肉提取液的拉曼光谱，之后根据步骤(2)的标准曲线，得到待测搅碎禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的含量。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)-(3)中拉曼光谱检测的条件是：以金溶胶为拉曼增强基底，按照样品和金溶胶的体积比为1：2将样品和金溶胶混合均匀，之后用激发光源为785nm的激光拉曼光谱仪进行扫描，扫描时间为3-10s，得到样品的拉曼光谱。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的提取溶剂为正己烷。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中搅碎禽畜肉与硫酸钠的质量比为1：2。
7.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中搅碎禽畜肉与NaOH溶液的比例以g/mL计为2.5：4。
8.根据权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中搅碎禽畜肉与提取溶剂的比例以g/mL计为2.5：10。
9.权利要求1-8任一项所述的方法在食品检测领域中的应用。
10.权利要求1-8任一项所述的方法在检测禽畜肉中左旋咪唑盐酸盐的应用。
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