CN102866226A - 一种使用吡嘧磺隆分子印迹聚合物分析磺酰脲类除草剂的方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用吡嘧磺隆分子印迹聚合物分析磺酰脲类除草剂的方法。该方法包括MISPE柱准备、除草剂标准物质贮备液制备、除草剂HPLC标准曲线的绘制、净化样品溶液制备与待分析样品HPLC分析等步骤。该方法使用的吡嘧磺隆固相萃取柱能特异性地吸附吡嘧磺隆等多种结构类似物，具有非常明显的选择性，流速快50%，因此分析时间减少50%，模板化合物残留量几乎为0，避免了残留模板化合物导致的假阳性。该固相萃取柱净化效果显著，简化对样品富集和净化，提高预处理效率，并可重复使用。还可以建立分子印迹固相萃取柱与HPLC仪器联用检测方法，最终能建立各种农产品、水和土壤等生物样品的标准检测方法。

Description

一种使用吡嘧磺隆分子印迹聚合物分析磺酰脲类除草剂的方法与用途

【技术领域】

本发明属于分析检测技术。更具体地，本发明涉及一种使用吡嘧磺隆分子印迹聚合物分析磺酰脲类除草剂的方法，还涉及所述方法在食品、农业等技术领域中的应用。 

【背景技术】

磺酰脲类除草剂是目前世界上使用量最大的一类除草剂，目前在我国广泛应用的磺酰脲类除草剂有氯磺隆、甲磺隆、苄嘧磺隆、胺苯磺隆、吡嘧磺隆、醚磺隆等。除草剂的应用最大程度地节省了劳动力，提高了农业生产效率，也提高了农业现代化的程度，还大大降低了人工除草的强度及成本。随着该类除草剂在农业生产中的广泛使用，其残留问题以及对后茬作物产生的危害已经引起人们关注。由于在环境和生物样品中存在痕量磺酰脲类除草剂，且其化学和热不稳定性差，在酸性条件下易水解，以及在各国贸易往来中对最大残留限量值采用日益严格的标准，使其残留分析成为一项极具挑战性的工作。另外，由于发达国家设置进口贸易技术壁垒措施，美国、欧盟、日本等国已制定了多种磺酰脲类除草剂在食品、饲料中的最高残留限量（Maximum residue limits MRLs）。美国规定自2007年2月起，稻米产品中的磺酰脲类除草剂残留限量为0.05mg/kg。日本规定青花菜的氟啶嘧磺隆、啶嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆的MRL均为0.02mg/kg。欧盟规定荔枝中甲酰胺磺隆和啶嘧磺隆为0.01mg/kg。而我国在2005年的国标（GB 2763-2005）中仅制定了吡嘧磺隆的残留限量标准，却没有制定标准检验方法。我国2007年10月16日才实施“进出口粮谷中咪唑磺隆残留量检测方法液相色谱法”行业标准。目前文献报道对吡嘧磺隆类的磺酰脲除草剂的检测以HPLC、LC-MS或CE等仪器检测为主，其前 处理需要经过液-液多次分配或固相萃取柱富集、净化，而目前使用较多的C18固相萃取填料缺乏特异性，会引入许多杂质，干扰检测结果，无法准确定量。 

由于环境污染和食品安全日益受到人们的重视，国内外除草剂的分子印迹研究已经成为热点课题，目前有较多文献均报道了应用固相萃取技术测定磺酰脲类除草剂的残留量的文章。叶贵标等人在题为“高效液相色谱/质谱法测定土壤中10种磺酰脲类除草剂多残留”，《分析化学学报》，34（9），p1207-1212（2006）中研究了高效液相色谱-质谱同时检测土壤中10种磺酰脲类除草剂残留量的方法，并比较了CleanertC、CleannertHXN和OasisHLB3种SPE商品柱的净化效果。赵永刚等人在题为“固相萃取/高效液相色谱法测定地表水中磺酰脲类农药的研究”，《分析科学学报》，24（3），p287-300（2008）中对Bond ElutC18、SupelcoC18、OasisHLB SPE固相萃取小柱对水中磺酰脲类农药的保留效果进行了比较，Bond ElutC18和OasisHLB SPE的保留效果较好。李军等人在题为“粮谷中四唑嘧磺隆、啶嘧磺隆和氯吡嘧磺隆残留的高效液相色谱检验方法”，《检验检疫科学》，15（1），p24-26（2005）中对其三种磺酰脲类除草剂残留量检测进行了研究，并考察了Bond Elut SAX柱、PRS柱、NH柱和SCX柱等离子交换柱对样品的净化效果。 

针对传统固相萃取柱（C18、硅胶柱或硅酸镁柱）在磺酰脲类除草剂检测中存在的一些技术缺陷，本发明人研究出采用吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱分析磺酰脲类除草剂的方法。 

【发明内容】

[要解决的技术问题] 

本发明的目的是提供一种使用吡嘧磺隆分子印迹聚合物分析磺酰脲类除草剂的方法。 

本发明的另一个目的是提供所述分析方法的用途。 

[技术方案] 

本发明是通过下述技术方案实现的。 

本发明涉及一种使用吡嘧磺隆分子印迹聚合物分析磺酰脲类除草剂的方法。 

该分析磺酰脲类除草剂的方法包括下述步骤： 

A、MISPE柱的准备： 

称取150~250mg吡嘧磺隆分子印迹聚合物，装填到4~8ml固相萃取空柱中，得到吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱MISPE；所述的MISPE柱在使用前使用2~10ml二氯甲烷、乙腈或它们的混合物进行活化处理。 

分子印迹技术(Molecular imprinting technology，MIT)是一种新兴的分子识别技术，是指模拟自然界所存在的分子识别作用机理如酶与底物、抗体与抗原等特异性识别相互作用，以目标分子为模板合成具有特殊分子识别功能的高分子聚合物的一种技术。分子印迹技术MIT是在溶液中将模板分子与功能单体、交联剂进行聚合得到高分子聚合物，再通过物理或化学的方法除去聚合物中的模板分子，得到在空间和结合位点上与模板分子完全匹配的聚合物。分子印迹聚合物能够特异性识别模板分子，具有类似抗体的特异性、高选择性、高稳定等优点，与天然抗体相比制备简单、且耐强酸、碱及高温。分子印迹固相萃取（Molecular imprinting solid phase extractMISPE）技术是分子印迹技术应用最为成熟的方向之一，MISPE由于对目标物具有特异识别性，在痕量分析方面具有独特的优势。根据分子印迹聚合物的独特优点，将其用作固相萃取的吸附剂材料，近年来被成功用于农药、兽药分析检测的前处理过程中。 

固相萃取（solid phase extract，SPE）技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化，是一种包括液相和固相物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。较常用的方法是使液体样品溶液通过吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附 干扰杂质，而让被测物质流出；或同时吸附杂质和被测物质，再使用合适的溶剂选择性洗脱被测物质。固相萃取柱是目前市场上销售的产品，例如北京明尼克分析仪器设备中心销售的固相萃取柱。 

所述吡嘧磺隆分子印迹聚合物是采用下述制备方法得到的： 

（i）聚合反应步骤： 

在聚合反应瓶中，按照α-甲基丙烯酸功能单体与吡嘧磺隆的摩尔比4:1~8:1，将α-甲基丙烯酸功能单体和模板分子吡嘧磺隆溶于二氯甲烷溶剂中，超声混合4~6min，于是得到一种二氯甲烷预聚合体系；然后，按照α-甲基丙烯酸功能单体、交联剂与引发剂的摩尔比4:4:1，往所述的二氯甲烷预聚合体系中加入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯交联剂与偶氮二异丁腈引发剂，接着再进行超声混合脱气4~6min，最后充氮气除氧气4~6min，再在温度50~70℃的水浴中加热反应20~30h，得到一种高分子聚合物； 

（ii）模板分子洗脱步骤： 

用力摇动步骤（i）使用的聚合反应瓶，得到具有一定粒径的高分子聚合物，然后在烘箱中在温度65~75℃的条件下进行干燥，再使用索氏提取装置加入洗脱剂洗脱所述模板分子，洗脱10~14h；然后，把洗脱的高分子聚合物进行干燥，再加入甲醇，在搅拌下加热至温度65~75℃，直到无乙酸味放出，接着再加入丙酮洗去细小聚合物颗粒，最后移入烘箱进行干燥，得到颗粒度D₅₀为9.15μm的吡嘧磺隆分子印迹聚合物。 

同时，按照与上述相同的方式制备空白印迹聚合物（NIP），即除不加模板分子外，其他步骤均与上述印迹聚合物制备方法相同。 

所述的吡嘧磺隆分子印迹聚合物、α-甲基丙烯酸、吡嘧磺隆与空白印迹聚合物进行了红外光谱分析，其分析条件如下： 

红外光谱仪：美国Thermo Nicolet公司生产的Nexus 470傅立叶变换（原位）红外光谱仪。 

红外光谱测定条件：采用溴化钾压片法，扫描波数在4000–400cm^-1 范围。 

吡嘧磺隆分子印迹聚合物、模板分子吡嘧磺隆及空白聚合物的红外光谱图列于附图1-3中。由吡嘧磺隆分子印迹聚合物红外光谱图1可以清楚地看出，在1577.23cm^-1和1608.99cm^-1分别出现了模板分子吡嘧磺隆的仲酰胺-NH弯曲振动吸收峰和苯环C=C伸缩振动吸收峰；而在1369.17cm^-1出现了-SO₂-的反对称伸缩振动吸收峰。由模板分子吡嘧磺隆红外光谱图2可以清楚地看出，在1577.23cm^-1和1614.26cm^-1分别出现了模板分子吡嘧磺隆的仲酰胺-NH弯曲振动吸收峰和苯环C=C伸缩振动吸收峰；而在1361.86cm^-1出现了-SO₂-的反对称伸缩振动吸收峰。附图3的空白聚合物红外光谱图没有出现上述这些吸收峰。由这些附图可以认为吡嘧磺隆印迹聚合物具有明显的印迹效果，含有典型的模板分子吸收峰。 

本发明人还进行了本发明吡嘧磺隆分子印迹聚合物在不同溶剂中的吸附实验，其实验方法是分别称取制备的吡嘧磺隆印迹聚合物和空白聚合物各0.200克置于离心试管中，加入5ml浓度为4mmol/l吡嘧磺隆在不同溶剂中的溶液，在室温下震荡吸附4h，然后以转速4000r/min离心10min，上清液采用0.45μm的有机滤头过滤，得到的滤液采用本说明书描述的高效液相色谱法（HPLC）测定其中游离吡嘧磺隆的浓度，根据下述公式计算吡嘧磺隆印迹聚合物对吡嘧磺隆的单位吸附量。 

$Q=\frac{(C_0-C_t)\×V}{m}$

式中： 

Q为吸附量(μg.g^-1); 

C₀为吡嘧磺隆的初始浓度（μg.mL^-1）; 

C_t为在吸附不同时间后的吡嘧磺隆浓度（μg.mL^-1）; 

m是吡嘧磺隆印迹聚合物的质量(g)； 

V是所述滤液的体积。 

该吸附实验结果列于附图4中。该图是吡嘧磺隆分子印迹聚合物在吸附4h后在吸附溶剂中游离吡嘧磺隆的高效液相色谱图。该实验结果表明， 在正己烷中游离吡嘧磺隆的液相色谱峰面积最小，也即该吡嘧磺隆分子印迹聚合物的吸附量最大，可以达到1150.71±4.87μg g^-1。 

该吡嘧磺隆分子印迹聚合物还进行了吸附动力学实验，其具体实验方法是称取20mg吡嘧磺隆印迹聚合物，加入浓度为5.70mg L^-1正己烷吡嘧磺隆溶液5ml，采用100转/分钟的速度震荡吸附，分别于3h、4h、5h、7h与9h后取出吸附液，离心和过滤，然后采用高效液相色谱方法测定游离吡嘧磺隆的含量，所述的高效液相色谱法是本说明书描述的高效液相色谱法。该吸附动力学实验结果见附图5，从附图5可以清楚地看出：吡嘧磺隆分子印迹聚合物在3-4h吸附量增加较快，而4h后吸附量几乎没有明显的增加，还可以看出该合成的吡嘧磺隆分子印迹聚合物吸附速度比较快,与刘秋叶等人在题为“硅胶修饰-表面分子印迹牛血红蛋白及其识别性能的研究”，《化学学报》，66（1）：p56-62（2008）中制备的大分子牛血红蛋白印迹聚合物相比较（7小时后达到饱和）,本发明制备的吡嘧磺隆印迹聚合物具有较快的吸附速度。 

在本发明中，所述的活化处理应该理解为一种润湿其聚合物并使该聚合物达到良好吸附效果的处理方法。 

根据本发明，所述的磺酰脲类除草剂是吡嘧磺隆、苄嘧磺隆、甲磺隆、苯磺隆和烟嘧磺隆，当然，还包括在化学结构、化学性质与除草功能上与本发明所述磺酰脲类除草剂结构相近或相似的那些化合物。 

根据本发明的另一种优选实施方式，在制备吡嘧磺隆分子印迹聚合物的步骤（ii）中，所述的洗脱剂是甲醇、乙腈与乙酸按照其体积比1.5~2.5:0.8~1.2:0.8~1.2混合的混合溶剂。 

根据本发明的另一种优选实施方式，在制备吡嘧磺隆分子印迹聚合物的步骤（ii）中，在洗脱模板分子的过程中每隔3~5h更换一次洗脱剂，洗脱温度控制在80-100℃。 

根据本发明的另一种优选实施方式，在制备吡嘧磺隆分子印迹聚合物的步骤（ii）中，洗脱的高分子聚合物在温度60~80℃的条件下干燥1~3h。 

根据本发明的另一种优选实施方式，在制备吡嘧磺隆分子印迹聚合物的步骤（ii）中，所述的丙酮洗涤进行2~3次。 

B、磺酰脲类除草剂标准物质贮备液的制备 

分别称量5mg吡嘧磺隆、苄嘧磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆和苯磺隆标准物质放于50mL容量瓶中，用乙腈充分溶解后并定容，于是配制得到100μg/mL标准物质贮备液。 

制备的标准物质贮备液进行超声混匀5min后，再进行密封保存，在冰箱中在温度为0至-4°C下保存可以稳定使用约1个月。 

本发明使用的吡嘧磺隆、苄嘧磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆和苯磺隆标准物质都是纯度在96%以上的标准品。 

C、磺酰脲类除草剂HPLC标准曲线的绘制 

分别移取一定量的在步骤B制备的标准物质贮备液于10mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，得到其浓度分别为1.00、5.00、10.00、15.00、20.00μg/mL标准物质的标准溶液，然后在下述条件下进行HPLC分析。 

本发明使用的HPLC仪是目前市场上销售的产品，例如Waters、Agilent、岛津等品牌。 

高压液相色谱柱为C18柱，它是美国Waters公司销售的产品，250mm×4.6mm，填料粒径5μm，使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含有0.01重量%磷酸的乙腈-水混合物，乙腈与水的体积比为20：80，流动相B为含有0.01重量%磷酸的乙腈-水混合物，乙腈与水的体积比为80：20；流速0.8mL/min；柱温30℃；检测波长241nm，进样量10μL。 

其HPLC的流动相洗脱梯度如下： 

流动相使用前用0.45μm滤膜抽滤装置进行脱气，其脱气方法是采用抽滤瓶抽滤，中间放置0.45μm有机相滤膜。 

每个标准物质浓度重复进样3次，然后以液相色谱峰面积积分对其相应标准物质浓度进行绘图，于是得到所述标准物质的HPLC标准曲线，由其相应标准曲线线性部分得到其相应的线性方程。在本发明中，由其标准曲线线性部分获得线性方程的方法是本技术领域里技术人员熟知的方法。 

按照上述方法得到如下线性方程： 

式中： 

y是峰面积积分； 

x是标准物的浓度μg/mL。 

相关系数R²表明，该分析方法满足其定量要求。 

采用本HPLC方法对同一标准物质样品平行测定6次，其测定结果的相对标准偏差小于5%，上述五种标准物质样品的测定相对标准偏差也小于5%，说明本HPLC方法的精密度很好。 

使用同一标准物质配制三个浓度相同的样品，每个浓度样品重复测定3次，检验其方法的再现性，其测定相对标准偏差小于5%，说明本方法符合高效液相色谱方法相对标准偏差要求，因此，该方法能够满足实际样品检测要求。 

D、净化样品溶液制备： 

称取待分析样品5.000g于50mL离心管中进行预处理。所述预处理是该分析样品先用10mL水润湿并搅拌，然后加入10mL乙腈溶剂，再用 漩涡混匀器混匀，在100转/min的条件下振荡3h，最后双层滤纸过滤，离心，收集上清液用氮气吹除，得到一种残留物。将所述的残留物溶于正己烷溶剂中得到一种样品溶液，把该样品溶液加到在步骤A准备的MISPE柱上，先进行淋洗，然后进行洗脱，收集洗脱液，合并洗脱液在N₂气下进行浓缩，除去有机溶剂，其残留物用0.5~1.5mL乙腈溶解，得到一种净化样品溶液。 

淋洗是本技术领域里的一种常规操作，在本发明中，其淋洗目的在于去除杂质。本发明使用正己烷进行淋洗，其淋洗速度通常保持0.5mL/min，淋洗剂的体积是2.5mL。 

洗脱也是本技术领域里的一种常规操作。在本发明中，使用甲醇-乙酸溶剂混合物进行洗脱。 

所述的甲醇-乙酸溶剂混合物是甲醇与乙酸按照体积比8:2-9:1混合的混合溶剂。 

洗脱速度不能太快，通常保持在0.5mL/min，洗脱剂的体积是3×2.5mL。 

合并洗脱液在N₂气下进行浓缩，除去有机溶剂，这是一种常规浓缩方式，通过氮气挥发带走有机溶剂，而待分析物残留在试管底部，其浓缩是在温度为常温或者50度以下的条件下进行的。 

E、待分析样品的HPLC分析： 

步骤D得到的净化样品溶液在步骤C描述的条件下进行HPLC分析，根据步骤C得到的其线性方程，由其液相色谱峰面积积分计算得到待分析样品的磺酰脲类除草剂含量。 

本发明还涉及在测定农产品、水样、土壤与食品的磺酰脲类除草剂中的用途。该类除草剂现已成为水稻、玉米、大豆、油菜、麦类及草坪、林地、非耕地和部分旱地作物杂草防治的主要品种，对水稻和旱地禾本科杂草、阔叶杂草、莎草、看麦娘、稗草等均有较好的防除效果。因此，本发明的方法具有非常广泛的应用前景。 

本发明的合成方法得到D₅₀为9.15μm的吡嘧磺隆分子印迹聚合物（丙酮沉降洗涤之前的颗粒度），避免了本体聚合法合成得到大块状聚合物需要研磨和过筛的步骤，也避免了沉淀聚合法得到较小颗粒聚合物（粒度1-5微米），从而导致装填固相萃取柱在使用时流速慢，比沉淀聚合法能较大程度地节约溶剂，降低成本，还利于环保。本发明的模板洗脱程序（耗时10-12h），比传统的洗脱程序（耗时24h）要节省时间10-12h，而且洗脱更彻底，其模板化合物残留量未检出（可能是由于模板在97°C高温反复抽提导致结构改变，因此在抽提液中采用高效液相方法未检出模板分子），避免了模板化合物残留在应用时导致的假阳性。 

本发明制备吡嘧磺隆固相萃取柱能特异性地吸附吡嘧磺隆、苯磺隆、甲磺隆、苄嘧磺隆和烟嘧磺隆等结构类似物，具有非常明显的选择性，对吡嘧磺隆吸附和净化效果显著，简化对样品富集和净化步骤，提高预处理效率，同时提高了检测方法的灵敏度和准确性。吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱制备方法简单，成本低，并可重复使用。还可以建立分子印迹固相萃取柱与HPLC仪器联用检测方法，最终能建立各种农产品、水和土壤等生物样品的标准检测方法。 

[有益效果] 

本发明的有益效果： 

本发明合成方法得到D₅₀为9.15μm的吡嘧磺隆分子印迹聚合物（再采用丙酮沉降3-5次，去除细小颗粒，得颗粒度在10μm以上的聚合物装填固相萃取柱），不需要研磨和过筛，采用该方法合成聚合物可以节省溶剂16-20%，固相萃取柱使用时流速快50%，分析时间减少50%，成本降低，有利于环保。其模板化合物残留量几乎为0，避免了模板化合物残留在应用时导致的假阳性。 

本发明制备吡嘧磺隆固相萃取柱能特异性地吸附吡嘧磺隆、苯磺隆、甲磺隆、苄嘧磺隆和烟嘧磺隆等结构类似物，具有非常明显的选择性，对吡嘧磺隆的净化效果显著，简化对样品富集和净化，提高预处理效率。与 现有技术同类方法相比，以大米为例，采用该MISPE比SPE的回收率高10-30%。吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱制备方法简单，成本低，并可重复使用。还可以建立分子印迹固相萃取柱与HPLC仪器联用检测方法，最终能建立各种农产品、水和土壤等生物样品的标准检测方法。 

【附图说明】

图1是吡嘧磺隆分子印迹聚合物的红外光谱图。 

图2是吡嘧磺隆模板分子的红外光谱图。 

图3是空白印迹聚合物的红外光谱图。 

图4是吡嘧磺隆分子印迹聚合物在不同溶剂中吸附后的液相色谱图。 

图5是吡嘧磺隆分子印迹聚合物吸附动力学曲线图。 

图6是苄嘧磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、苯磺隆和吡嘧磺隆的标准曲线； 

TBM-苯磺隆，PS-吡嘧磺隆，BSM-苄嘧磺隆，MSM-甲磺隆，NS-烟嘧磺隆。 

图7是吡嘧磺隆分子印迹固体萃取柱、空白柱加混标（13.00μg mL-1）的HPLC色谱图。 

B-大米试验液直接进样的HPLC分析所得到的液相色谱图； 

C-大米样品加标样后未经MISPE柱子处理而直接进行HPLC分析所得到的液相色谱图； 

D-正己烷淋洗MISPE柱时所收集淋洗液的HPLC液相色谱图；（从D可以看出正己烷淋洗效果非常好，淋洗液中几乎不含有任何一种磺酰脲类除草剂。这样说明该柱子对这五种磺酰脲类除草剂吸附效果比较好。） 

E-洗脱剂洗脱MISPE柱时所收集洗脱液的HPLC液相色谱图； 

F-正己烷淋洗NISPE（空白印迹聚合物）柱时所收集淋洗液的HPLC液相色谱图； 

G-洗脱剂洗脱NISPE柱时所收集洗脱液的HPLC液相色谱图； 

H-五种混标（13.00μg mL-1）的HPLC液相色谱图。 

图8是土壤试验溶液处理液的HPLC色谱图： 

A-土壤试验溶液的HPLC色谱图； 

B-土壤试验溶液加混标的HPLC色谱图； 

C-土壤试验溶液通过MISPE柱后的淋洗液的HPLC色谱图； 

D-土壤试验溶液通过MISPE柱的洗脱液的HPLC色谱图； 

E-五种标准磺酰脲类除草剂混合液的HPLC色谱图。 

图9是水稻田水试验溶液处理液的HPLC色谱图： 

A-水稻田水试验溶液的HPLC色谱图； 

B-水稻田水试验溶液加混标的HPLC色谱图； 

C-水稻田水试验溶液通过MISPE柱的淋洗液的HPLC色谱图； 

D-水稻田水试验溶液通过MISPE柱的洗脱液的HPLC色谱图； 

E-五种标准磺酰脲类除草剂混合液的HPLC色谱图。 

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。 

实施例1：大米中磺酰脲类除草剂的分析 

该实施例的实施步骤如下： 

首先，制备吡嘧磺隆分子印迹聚合物： 

（i）聚合反应步骤： 

在聚合反应瓶中，将170μL α-甲基丙烯酸功能单体与0.2g 吡嘧磺隆（它们的摩尔比4:1）溶解于16mL二氯甲烷中，超声混合脱气5min，于是得到一种二氯甲烷预聚合体系；然后，往所述的预聚合体系中加入750μL三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）交联剂、0.1g偶氮二异丁腈引发剂，所述α-甲基丙烯酸功能单体、交联剂与引发剂的摩尔比是4:4:1；接着再进行超声混合脱气5min，最后充氮气5min，立即封口，将盖子绑紧，于温度60℃的水浴中加热反应24h，于是得到一种高分子聚合物； 

（ii）模板分子洗脱步骤： 

用力摇动步骤（i）使用的聚合反应瓶，得到具有一定粒径的高分子聚合物，得到粒度D₅₀为9.15μm的吡嘧磺隆分子印迹聚合物。然后在烘箱中温度为70℃的条件下进行干燥，把它装填到索氏提取筒中并加入洗脱剂（甲醇、乙腈与乙酸的体积比为2:1∶1）洗脱模板分子，洗脱12h，每4h 更换一次洗脱剂，洗脱温度控制在80℃以上；然后，洗脱的高分子聚合物在温度80℃的条件下进行干燥，然后加入甲醇，在搅拌下加热至温度70℃，直到无乙酸味放出，接着再加入丙酮洗去小颗粒聚合物，用丙酮洗涤3次，最后移入烘箱中进行干燥，与此同时，制备空白印迹聚合物（NIP），除不加模板分子外，其他步骤均与印迹聚合物制备相同。 

其次，准备吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱 

称取200mg上述干燥吡嘧磺隆分子印迹聚合物，干法手工装填到3ml固相萃取空柱中，反复压实，得到吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱（MISPE）；所述的MISPE柱在使用前用5ml二氯甲烷与乙腈的混合物（其体积比1:1）进行活化处理。 

第三、磺酰脲类除草剂标准物质贮备液的制备 

分别称量5mg吡嘧磺隆、苄嘧磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆和苯磺隆标准物质放于50mL容量瓶中，用乙腈充分溶解后并定容，于是配制得到100μg/mL标准物质贮备液。 

第四，磺酰脲类除草剂HPLC标准曲线的绘制 

分别移取一定量的在第三步骤制备的标准物质贮备液于10mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，得到其浓度分别为1.00、5.00、10.00、15.00、20.00μg/mL标准物质的标准溶液，然后在下述条件下进行HPLC色谱分析： 

色谱条件为C18柱，250mm×4.6mm，填料粒径为5μm，使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含有0.01重量%磷酸的乙腈-水混合物，乙腈与水的体积比为20：80，流动相B为含有0.01重量%磷酸的乙腈-水混合物，乙腈与水的体积比为80：20；流速0.8mL/min；柱温30℃；检测波长241nm，进样量10μL。 

配制好的流动相在使用前用0.45μm滤膜抽滤装置进行脱气，然后超声处理20min；每个标准物质浓度重复进样3次，以液相色谱峰面积积分对其相应标准物质浓度作图，得到所述标准物质的HPLC标准曲线（见附 图6），由其相应标准曲线线性部分得到其相应的线性方程； 

第五，大米试验溶液的制备 

取江西产的大米样品粉碎通过50目的标准网筛，称取5g筛下大米，放入50mL离心管中，加入10mL蒸馏水，用玻璃棒轻微搅拌后静置浸润2h，接着加入10mL乙腈，经玻璃棒搅拌后静置1h，用涡旋混匀器混匀15min，然后在转速4000r/min的条件下进行离心15min，用双层滤纸过滤，得到的滤液用氮气吹除溶剂后用正己烷溶解进行上MISPE柱分析。 

第六，大米试验溶液的分析 

MISPE柱在使用前先用7.5mL（2.5×3mL）洗脱剂（甲醇与乙酸的混合物，其体积比9:1）将柱子的杂质洗掉，然后用5mL（2.5×2mL）活化剂（乙腈与二氯甲烷的混合物，其体积比1∶1）进行活化。取1mL用正己烷为溶剂配制的混合标准物质（浓度为13μg/mL）将其加入上述制备的大米试验液（已氮气吹除溶剂后的残留物）的试管中，超声混匀，得到一种上样液，全部转移到MISPE柱上样，用2.5mL正己烷进行淋洗。收集的淋洗液用氮气吹干溶剂后再用1mL乙腈溶解，超声混匀，然后进行HPLC分析，通过检测淋洗液可以判断淋洗液中是否有五种磺酰脲类除草剂，如果没有这些除草剂，则说明淋洗时没有将除草剂淋洗下来，于是能保证五种磺酰脲类除草剂全部留在柱上，即能保证洗脱液含有所有除草剂，从而提高回收率。然后用7.5mL（2.5×3mL）所述洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，用氮气吹除溶剂，残留物用1mL的乙腈溶解，超声混匀得到一种大米试验溶液，然后进行HPLC分析。空白NISPE柱子大米上样液与MISPE柱子大米上样液相同。 

第六，HPLC检测结果 

采用Waters 2487高效液相色谱仪，色谱条件为C18柱，250mm×4.6mm，填料粒度为5μm，使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含有0.01重量%磷酸的乙腈-水混合物，乙腈与水的体积比为20：80，流动相B为含有 0.01重量%磷酸的乙腈-水混合物，乙腈与水的体积比为80：20；流速0.8mL/min；柱温30℃；检测波长241nm，进样量10μL。梯度洗脱程序如说明书中所述。大米试验溶液的HPLC检测结果列于附图7中。 

附图7B是本实施例制备的大米试验液直接进行HPLC液相色谱分析所得到的色谱图。 

附图7C是所述大米样品溶液在加五种标准物质后的HPLC液相色谱图。 

附图7D是所述的大米样品溶液通过MISPE柱，用正己烷淋洗MISPE柱时所收集淋洗液的HPLC液相色谱图。从该附图可以看出，正己烷淋洗效果非常好，淋洗液中几乎不含有任何一种磺酰脲类除草剂。这样说明该柱子对这五种磺酰脲类除草剂吸附效果比较好。 

附图7E-洗脱剂洗脱MISPE柱时所收集洗脱液的HPLC液相色谱图。 

附图7F-正己烷淋洗NISPE（空白印迹聚合物）柱时所收集淋洗液的HPLC液相色谱图； 

附图7G-洗脱剂洗脱NISPE柱时所收集洗脱液的HPLC液相色谱图； 

附图7H-五种混标（13.00μg mL^-1）的HPLC液相色谱图。 

然后，根据前面所得到的其线性方程，由其液相色谱峰面积积分得到待分析样品大米的苄嘧磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、苯磺隆和吡嘧磺隆含量分别是10.547、7.936、6.701、5.110与12.92μg/g。 

其测定的精密度是在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值没有超过算术平均值的10%。 

实施例2：土壤中磺酰脲类除草剂的分析 

使用实施例1制备的吡嘧磺隆聚合物、按照与实施例1相同方式准备固相萃取柱。 

其次，土壤试验溶液的制备 

取农大实验田里的土壤样品晾干、碾碎后通过50目标准网筛，称取5g筛下土壤粉末，放入50mL离心管中，加入10mL蒸馏水，用玻璃棒轻 微搅拌后静置浸润2h，接着加入10mL乙腈，经玻璃棒搅拌后静置1h，用涡旋混匀器混匀15min，然后在转速4000r/min的条件下进行离心15min，用双层滤纸过滤，得到的滤液进行分析； 

第三，土壤试验溶液的分析 

MISPE柱在使用前先用7.5mL（2.5×3mL）洗脱剂（甲醇与乙酸的混合物，其体积比9:1）将柱子的杂质洗掉，然后用5mL（2.5×2mL）活化剂（乙腈与二氯甲烷的混合物，其体积比1:1）进行活化。3mL配制的混合标准物质（13.05μg mL^-1）用氮气吹干，再加入3mL正己烷超声混匀5min，然后将其倒入装有3mL上述制备的土壤试验液（已氮吹干）的试管中，再超声混匀，得到一种用于MISPE柱的上样液体，移取1mL所述液体上MISPE柱，用2.5mL正己烷进行淋洗，然后用7.5mL（2.5×3mL）洗脱剂进行洗脱，收集淋洗液和洗脱液，用氮气吹干，残留物用1mL的乙腈溶解，超声混匀，然后进行HPLC分析。 

第六，HPLC检测结果 

采用Waters 2487高效液相色谱仪，色谱条件为C18柱，250mm×4.6mm，直径5μm，使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含有0.01重量%磷酸的乙腈-水混合物，乙腈与水的体积比为20：80，流动相B为以体积计80：20的乙腈-水混合物；流速0.8mL/min；柱温：30℃；检测波长241nm，进样量10μL；梯度洗脱程序如说明书中所述。得到了土壤试验溶液转移到MISPE柱上样，按照与实施例1相同的方法进行淋洗和洗脱，合并洗脱液经与实施例1相同处理后再进行HPLC测定。HPLC检测结果列于附图8中。 

附图8是土壤试验溶液处理液的HPLC色谱图。图中A为土壤试验溶液的HPLC色谱图；B为土壤试验溶液加混标的HPLC色谱图；C为土壤试验溶液通过MISPE柱后的淋洗液的HPLC色谱图；D为土壤试验溶液通过MISPE柱的洗脱液的HPLC色谱图；E为五种标准磺酰脲类除草剂混合液的HPLC色谱图。 

根据其HPLC色谱图得到的线性方程，由其液相色谱峰面积积分得到待分析样品大米的苄嘧磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、苯磺隆和吡嘧磺隆含量分别是7.4496、5.0021、8.3395、7.6966、12.4943μg/g。 

实施例3：水稻田水中磺酰脲类除草剂的分析 

使用实施例1制备的吡嘧磺隆聚合物、按照与实施例1相同方式准备固相萃取柱。 

其次，水稻田水试验溶液的制备 

取农大水稻田间的水20mL用双层滤纸过滤，所得滤液再用0.45μm的滤膜过滤，所得滤液氮气吹干，然后再加入3mL的正己烷，超声混溶，待用； 

第三，水稻田水试验溶液的分析 

MISPE柱在使用前先用7.5mL（2.5×3mL）洗脱剂（甲醇与乙酸的混合物，其体积比9:1）将柱子的杂质洗掉，然后用5mL（2.5×2mL）活化剂（乙腈与二氯甲烷的混合物，其体积比1∶1）进行活化。分别取上述的待用溶液1mL进MIP柱子及，用2.5mL正己烷进行淋洗，然后用7.5mL（2.5×3mL）洗脱剂进行洗脱，收集淋洗液和洗脱液，用氮气吹干，残留物用1mL的乙腈溶解，超声混匀，然后进行HPLC分析。其中剩下1mL的上述待用溶液直接氮吹干后，加入1mL的乙腈，超声混溶，也进行HPLC分析； 

第四，HPLC检测结果 

采用Waters 2487高效液相色谱仪，色谱条件为C18柱，250mm×4.6mm，直径5μm，使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含有0.01重量%磷酸的乙腈-水混合物，乙腈与水的体积比为20：80，流动相B为以体积计80：20的乙腈-水混合物；流速0.8mL/min；柱温：30℃；检测波长241nm，进样量10μL；梯度洗脱程序如说明书中所述。得到了水稻田水试验溶液转移到MISPE柱上样，按照与实施例1相同的方法进行淋洗和洗脱，合并洗脱液经与实施例1相同处理后再进行 HPLC测定。HPLC检测结果列于附图9中。 

附图9水稻田水试验溶液处理液的HPLC色谱图。图中A为水稻田水试验溶液的HPLC色谱图；B为水稻田水试验溶液加混标的HPLC色谱图；C为水稻田水试验溶液通过MISPE柱的淋洗液的HPLC色谱图；D为水稻田水试验溶液通过MISPE柱的洗脱液的HPLC色谱图；E为五种标准磺酰脲类除草剂混合液的HPLC色谱图。 

根据前面得到的其线性方程，由其液相色谱峰面积积分得到待分析样品田水的苄嘧磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、苯磺隆和吡嘧磺隆含量分别是8.9462、9.1732、8.2273、12.6451、13.5361μg/g。 

Claims (10)

1.一种使用吡嘧磺隆分子印迹聚合物分析磺酰脲类除草剂的方法，其特征在于该方法包括下述步骤： 

A、MISPE柱的制备 

称取150~250mg吡嘧磺隆分子印迹聚合物，装填到4~8ml固相萃取空柱中，得到吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱MISPE；所述的MISPE柱在使用前用2~10ml二氯甲烷、乙腈或它们的混合物进行活化处理； 

所述吡嘧磺隆分子印迹聚合物是采用下述合成方法得到的： 

（i）聚合反应步骤 

在聚合反应瓶中，按照α-甲基丙烯酸功能单体与吡嘧磺隆的摩尔比4:1~8：1，将α-甲基丙烯酸功能单体和模板分子吡嘧磺隆溶于二氯甲烷溶剂中，超声混合4~6min，于是得到一种二氯甲烷预聚合体系；然后，按照α-甲基丙烯酸功能单体、交联剂与引发剂的摩尔比4:4:1，往所述的二氯甲烷预聚合体系中加入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯交联剂与偶氮二异丁腈引发剂，接着再进行超声混合脱气4~6min，最后充氮气除氧气4~6min，再在温度50~70℃的水浴中加热反应20~30h，得到一种高分子聚合物； 

（ii）模板分子洗脱步骤 

用力摇动步骤（i）使用的聚合反应瓶，得到具有一定粒径的高分子聚合物，然后在烘箱中温度为65~75℃的条件下进行干燥，再把聚合物装入索氏提取装置中加入洗脱剂洗脱所述模板分子，洗脱10~14h；然后，把洗脱的高分子聚合物进行干燥，再加入甲醇边搅拌边加热至温度65~75℃，直到无乙酸味放出，接着再加入丙酮洗去细小颗粒聚合物，最后移入烘箱中进行干燥，得到颗粒度D₅₀为9.15μm的吡嘧磺隆分子印迹聚合物； 

B、磺酰脲类除草剂标准物质贮备液的制备 

分别称量5mg吡嘧磺隆、苄嘧磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆和苯磺隆标准物质放于50mL容量瓶中，用乙腈充分溶解后并定容，于是配制得到 100μg/mL标准物质贮备液； 

C、磺酰脲类除草剂HPLC标准曲线的绘制 

分别移取一定量的在步骤B制备的标准物质贮备液于10mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，得到其浓度分别为1.00、5.00、10.00、15.00、20.00μg/mL标准物质的工作溶液，然后在下述条件下进行HPLC分析： 

色谱柱C18柱，250mm×4.6mm，填料直径5μm，使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含有0.01重量%磷酸的乙腈-水混合物，乙腈与水的体积比为20：80，流动相B为0.01重量%磷酸的乙腈-水混合物，乙腈与水的体积比为80：20；流速0.8mL/min；柱温30℃；检测波长241nm，进样量10μL； 

流动相在使用前用有机相0.45μm滤膜抽滤装置进行抽滤和超声波超声脱气20min；每个标准物质浓度重复进样3次，以液相色谱峰面积积分对其相应标准物质浓度作图，得到所述标准物质的HPLC标准曲线，由其相应标准曲线线性部分得到其相应的线性方程； 

D、净化样品溶液制备 

把待分析样品经预处理后溶于正己烷溶剂中得到一种样品溶液，把该样品溶液加到在步骤A准备的MISPE柱上，先进行淋洗，然后进行洗脱，收集洗脱液，合并洗脱液在N₂气下进行浓缩，除去有机溶剂，其残留物用0.5~1.5mL乙腈溶解，得到一种净化样品溶液； 

E、待分析样品的HPLC分析 

步骤D中得到的净化样品溶液在步骤C描述的条件下进行HPLC分析，根据步骤C得到的其线性方程，由其液相色谱峰面积积分代入相应的公式得到待分析样品的磺酰脲类除草剂含量。 

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的磺酰脲类除草剂是吡嘧磺隆、苄嘧磺隆、甲磺隆、苯磺隆和烟嘧磺隆。 

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在制备吡嘧磺隆分子印迹聚合物的步骤（ii）中，洗脱模板分子的洗脱剂是甲醇、乙腈与乙酸按 照其体积比1.5~2.5:0.8~1.2:0.8~1.2混合的混合溶剂。 

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在制备吡嘧磺隆分子印迹聚合物的步骤（ii）中，在洗脱模板分子的过程中每隔3~5h更换一次洗脱剂，洗脱温度控制在80-100℃。 

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在制备吡嘧磺隆分子印迹聚合物的步骤（ii）中，洗脱的高分子聚合物在温度60~80℃的条件下干燥1~3h。 

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在制备吡嘧磺隆分子印迹聚合物的步骤（ii）中，所述的丙酮洗涤进行2~3次。 

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤C中，其HPLC的流动相洗脱梯度如下： 

。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤D中，使用正己烷进行淋洗；使用甲醇-乙酸混合溶剂进行洗脱。 

9.根据权利要求1-8中任一项权利要求所述的方法，其特征在于在步骤D中，所述的甲醇-乙酸溶剂混合物是甲醇与乙酸按照体积比8:2~9:1混合的混合溶剂。 

10.根据权利要求1所述的方法在测定农产品、水样、土壤与食品的磺酰脲类除草剂中的应用。 

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