CN101565483B - 苄嘧磺隆分子印迹聚合物的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苄嘧磺隆分子印迹聚合物的制备方法及其应用。该制备方法是见一种或多种功能单体和苄嘧磺隆溶于溶剂中，再分别加入交联剂、引发剂和分散剂，超声混合、溶解，充N₂保护，加热或用紫外光引发聚合反应，洗脱模板分子，真空干燥得到所述的苄嘧磺隆分子印迹聚合物。使用该苄嘧磺隆分子印迹聚合物对磺酰脲类除草剂的净化富集效果明显优于现有的非特异性C18柱，硅胶柱、硅酸镁柱，因此，提高了分析仪器的检测限和灵敏度。

Description

苄嘧磺隆分子印迹聚合物的制备方法及其应用

【技术领域】

本发明涉及高分子合成技术领域。更具体地，本发明属于分析检测技术，涉及苄嘧磺隆分子印迹聚合物的制备方法及其应用。

【背景技术】

磺酰脲除草剂自1978年，由美国杜邦公司Levitt博士开发了第一个品种---氯磺隆以来，于80年代开始大规模商品化生产，由于其具有高效性、广谱性、低毒性等优点，随后经过对氯磺隆结构进行改造后，现已发明了30多个品种，我国常用的磺酰脲类除草剂有21个品种，已成为水稻、玉米、大豆、油菜、麦类及草坪、林地、非耕地和部分旱地作物杂草防治的当家品种。对水稻和旱地禾本科杂草、阔叶杂草、莎草、看麦娘、稗草等均有较好的防除效果。随着该类除草剂使用量及使用范围的不断加大，其在农作物中的残留、对环境的污染及对人类健康造成的危害也越来越为人们所重视。另外，由于发达国家设置进口贸易技术壁垒措施，美国、欧盟、日本等国已制定了多种磺酰脲类除草剂在食品、饲料中的最高残留限量(Maximum residue limits MRLs)。如美国2007年4月16日和24日，分别拟定了苯磺隆和噻吩磺隆在大田玉米草料、大田玉米谷粒、大田玉米秣草、稻谷粒、稻杆、高粱谷草料、高粱谷粒、高粱谷秣草、大豆种子和葵花种子等MRLs为0.05mg/kg。氯吡嘧磺隆在紫花苜蓿草料的MRLs为1.0mg/kg；紫花苜蓿干草的MRLs为2.0mg/kg。日本也于2006年5月29日实施了肯定列表制度，其中对苯磺隆、甲磺隆、苄嘧磺隆、咪唑磺隆、氯嘧磺隆等在不同农作物中制定了相应的MRLs。而我国在2005年国标中仅制定了苄嘧磺隆的残留限量标准，并没有制定检验方法。我国2007年10月16日实施了进出口粮谷中咪唑磺隆残留量检测方法液相色谱法行业标准。

分子印迹固相萃取技术由于对目标物具有特异识别性，在痕量分析方面具有独特的优势。分子印迹技术(Molecular imprinting technology，MIT)是一种新兴的分子识别技术，是指模拟自然界所存在的分子识别作用机理如酶与底物、抗体与抗原等特异性识别相互作用，以目标分子为模板合成具有特殊分子识别功能的高分子聚合物的一种技术。分子印迹聚合物(Molecular imprinting polymers MIP)具有构效预定性、选择识别性和广泛实用性。构效预定性使人们可以根据不同的目的制备不同的MIP，以满足不同研究所需；选择识别性是指MIP的合成是根据印迹分子“度身量制”的，具有预定的分子结构和官能团，能选择性地与印迹分子结合；其广泛实用性表现在它具有抗恶劣环境的能力，如耐酸、耐碱和耐高温，而且MIP制备简单，成本低，因此MIP被广泛使用在模拟酶催化，手性药物分离、化学传感器、生物制药、药物传递和固相萃取等领域。

由于环境污染和食品安全日益受到人们的重视，国内外除草剂的分子印迹研究已经成为热点课题，目前文献报道有关磺酰脲类除草剂印迹聚合物的制备仅有甲磺隆、单嘧磺隆等。王宁等人(王宁等，2004年)研究了以单嘧磺隆为印迹分子的印迹聚合物，并以该印迹聚合物制备固相萃取柱研究了对加标土壤样品的萃取效果；Xiangjun Liu等人(Xiangjun Liu et al，2007年)研究了以甲磺隆为印迹分子通过一步溶胀法制备了球形印迹聚合物，进行水中甲磺隆的富集，检测限为ng/mL；Qing-Zhi Zhu等人(Qing-ZhiZhu et al，2002年)研究了甲磺隆的分子印迹技术，探讨了不同的功能单体、交联剂和致孔剂对印迹聚合物的吸附性能的影响；J.Bastide等人(J.Bastide etal，2005年)采用了本体聚合的方法合成了甲磺隆与4-乙烯吡啶的分子印迹聚合物，用该分子印迹-固相萃取技术富集水中的甲磺隆及其类似物，检测限达μg·L^-1。由于现有方法中使用非特异性C18柱、硅胶柱、硅酸镁柱对磺酰脲类除草剂的富集和净化效果还不能满足要求，而且在现有技术中预处理中的净化和富集步骤繁杂，需要反复液-液分配和多柱净化处理，效率不高。因此，本发明人针对这些问题进行了广泛而深入的探索，终于完成了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种苄嘧磺隆分子印迹聚合物的制备方法。

本发明的另一个目的是提供使用所述苄嘧磺隆分子印迹聚合物对样品中含痕量磺酰脲类除草剂样品预处理的方法。

本发明的另一个目的是提供所述苄嘧磺隆分子印迹聚合物分析方法在分析磺酰脲类除草剂中的用途。

[技术方案]

本发明包括制备出能选择性吸附苄嘧磺隆及其结构类似物的分子印迹聚合物，然后以该聚合物为填料制备分子印迹固相萃取柱(MI-SPE)，该柱对含磺酰脲类除草剂的各种生物样品的预处理步骤简便快速，还可以建立分子印迹固相萃取柱与HPLC、HPLC-MS仪器联用检测方法，最终能建立各种农产品、水和土壤等生物样品的标准检测方法。

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及苄嘧磺隆分子印迹聚合物的制备方法。该方法包括如下步骤：

(1)聚合反应步骤：

将一种或多种功能单体和苄嘧磺隆溶于溶剂中，超声混合脱气3-5min，在温度8-20℃下混合过夜；

所述的功能单体选自丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯、4-乙基苯稀酸、4-乙烯基吡啶、丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺；

所述的溶剂是氯仿或二氯甲烷；

所述的功能单体与苄嘧磺隆的量以摩尔比计是1∶1～1∶6；

然后将上述混合物转入三颈瓶中，分别加入交联剂、引发剂和分散剂，超声混合使其完全溶解，充N₂保护，在搅拌速度为60-200r/min下进行加热或使用紫外光引发进行聚合反应12-48h，得到一种高分子聚合物；

所述的交联剂、引发剂与分散剂的量以重量份计分别是1∶0.5～1∶1.5；

(2)模板分子洗脱步骤：

上述高分子聚合物用乙醇或丙酮进行反复洗涤，除去其中存在的细颗粒，得到颗粒直径4μm以上的均匀聚合物；

把这种均匀聚合物装填到液相色谱柱中，用1500-3000psi的压力反复冲填，直至色谱柱充填实；

然后，该色谱柱使用以体积计7-9∶3-1的甲醇∶乙酸混合溶剂作为色谱流动相反复冲洗该色谱柱，洗脱模板分子，然后再以乙腈作为流动相冲洗该色谱柱相，直至在235nm波长下未检测出模板分子；

(3)把液相柱中已经被洗脱模板分子的印迹聚合物采用液相高压冲出于磨口减压浓缩器中，在温度48-52℃真空进行干燥，得到所述的苄嘧磺隆分子印迹聚合物。

采用红外光谱技术鉴定由上述方法得到的产物是苄嘧磺隆分子印迹聚合物。通过红外光谱技术能判别在制备的MIP中是否存在氢键，能研究氢键类型的强弱，还能判别在制备的MIP中是否存在模板分子BSM的苯环、-SO2-和仲酰胺-NH等基团的特征吸收峰。

根据本发明的一个优选实施方案，所述的交联剂选自三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯或对二乙烯基苯。

根据本发明的另一个优选实施方案，所述的引发剂是热引发剂偶氮二异丁腈或光引发剂2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮。

根据本发明的另一个优选实施方案，所述的分散剂选自氯仿、二氯甲烷或乙腈。

本发明还涉及所述苄嘧磺隆分子印迹聚合物分析磺酰脲类除草剂的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：

(1)MISPE柱的准备：

称取50-200mg上述苄嘧磺隆分子印迹聚合物，装填到2-5ml固相萃取空柱中，得到苄嘧磺隆分子印迹固相萃取柱MISPE；MISPE柱在使用前使用2-15ml二氯甲烷、丙酮或乙腈进行活化处理；

(2)净化样品溶液制备：

把待分析样品溶液溶于二氯甲烷、丙酮或乙腈溶剂中得到样品溶液，把该样品溶液加到在步骤(1)准备好的MISPE柱上，进行淋洗，洗脱，收集洗脱液，合并洗脱液在N₂气下进行浓缩，除去有机溶剂，其残留物用2-15mL乙腈溶解，得到净化样品溶液；

(3)所述净化样品溶液的HPLC分析：

在上述步骤(2)得到的净化样品溶液在下述条件下进行HPLC分析：色谱条件为C18柱，250mm×4.6mm，直径5μm，流动相A为含有0.01％磷酸，以体积计20∶80的乙腈-水混合物，流动相B为以体积计80∶20的乙腈-水混合物；

(4)所述净化样品溶液的LC-MS分析：

在上述步骤(2)得到的净化样品溶液在下述条件下进行LC-MS分析：

LC条件：色谱柱为Waters Symmetry C18，2.1×150mm，流动相为甲醇-0.2％甲酸梯度洗脱，参见下表1；柱温35℃，流速0.3mL/min，进样量5μL。

表1：色谱分离梯度条件

MS条件：采用电喷雾电离源，正离子检测模式，检测质量范围为m/z200-800μ，N₂气为雾化气和辅助气，He气为碰撞气；毛细管电压3.93KV，锥孔电压20V，离子源温度100℃，脱溶剂气温度250℃，光电倍增器电压650V，真空度2.6×10^-5mBar，辅助汽流速4L/h。

在本发明中，所述的磺酰脲类除草剂是一种或多种选自对苯磺隆、甲磺隆、苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、咪唑磺隆或氯嘧磺隆的除草剂。

该方法还包括绘制磺酰脲类除草剂的HPLC标准曲线和LC-ESI-MS标准曲线。

根据本发明的一个优选实施方案，所述的淋洗溶剂选自乙腈-丙酮、乙腈-甲醇、二氯甲烷-丙酮、二氯甲烷-甲醇或乙腈-甲醇溶剂混合物。

在所述的淋洗溶剂中，两种溶剂的重量比可以是1/10至10/1。

优选地，所述两种溶剂的重量比可以是3/7至7/3。

更优选地，所述两种溶剂的重量比可以是5/5。

优选地，所述的淋洗溶剂选自乙腈-丙酮、乙腈-甲醇或乙腈-二氯甲烷溶剂混合物。

根据本发明的另一个优选实施方案，所述的洗脱溶剂选自甲醇、甲醇-乙酸或甲醇-水溶剂混合物。

在所述的洗脱溶剂中，两种溶剂的重量比可以是1/10至10/1。

优选地，所述两种溶剂的重量比可以是3/7至7/3。

更优选地，所述两种溶剂的重量比可以是5/5。

优选地，所述的洗脱溶剂选自甲醇或甲醇-水溶剂混合物。

下面描述绘制磺酰脲类除草剂的HPLC标准曲线和LC-ESI-MS标准曲线的方法与结果。

HPLC标准曲线测定：

首先配制5个不同浓度(6.7、3.0、0.6、0.3、0.1μg/mL)的混合标准溶液进行色谱测定，以各组分的3次平均峰面积(Y)对浓度(X，μg/mL)绘制标准曲线，烟嘧磺隆(Nicosulfuron，NS)、甲磺隆(Metsulfuron methyl，MSM)、苯磺隆(Tribenuron-methyl，TBM)和苄嘧磺隆(bensulfuron methyl，BSM)四种磺酰脲类除草剂的HPLC标准曲线见图5，这四种除草剂标准曲线的线性关系和相关系数见表2。

表2磺酰脲类除草剂在高效液相色谱仪上测定的线性关系

由表2可以看出，四种磺酰脲类除草剂在0.1-7μg/mL范围内线性良好，相关系数(R²)均在0.999以上。可以满足定量分析的要求。

采用本方法对同一标准品平行测定6次，测得各物质的相对标准偏差均小于1％，说明本方法精密度很好。

配制三个相同浓度的标准液，每个浓度重复进样3次，检验方法的重现性，测得RSD＜5％，符合高效液相标准偏差要求，因此，该方法完全能够满足实际样品的检测。

LC-ESI-MS标准曲线测定：

在上述确定的最佳LC-MS分离条件下，配制五种系列浓度(0.01、0.05、0.06、0.1和0.6μg/mL)的BSM、NS、MSM和TBM混合标准溶液进行LC-ESI-MS测定(图6)，以各组分的3次平均峰面积(Y)对浓度(X，μg/mL)绘制标准曲线，线性关系和相关系数见表3。

表3磺酰脲类除草剂在LC-ESI-MS上测定的线性关系

表3的结果表明，四种磺酰脲类除草剂在0.01-0.6μg/mL范围内线性非常好，除苯磺隆的R²为0.9999以外，其他3种被检测物的R²均为1，由此可见，本实验中的方法在0-0.6μg/mL范围可以满足定量分析的要求。

本发明还涉及本发明的方法在测定食品、各种农产品、水、土壤的磺酰脲类除草剂含量的用途。该类除草剂现已成为水稻、玉米、大豆、油菜、麦类及草坪、林地、非耕地和部分旱地作物杂草防治的主要品种，对水稻和旱地禾本科杂草、阔叶杂草、莎草、看麦娘、稗草等均有较好的防除效果。因此本发明的方法具有非常广泛的应用前景。

[有益效果]

本发明合成得到的苄嘧磺隆分子印迹聚合物对模板分子具有特异性的识别作用，对其衍生物如甲磺隆、烟嘧磺隆和苯磺隆等也有一定的识别作用。制备的苄嘧磺隆分子印迹固相萃取柱能直接净化和富集食品、水、土壤、各种农产品，其中包括大豆、大米和面粉等样品的乙腈提取液。对磺酰脲类除草剂的净化富集效果明显优于现有的非特异性C18柱，硅胶柱、硅酸镁柱，提高了仪器的检测限和灵敏度。本发明的方法避免了传统方法的反复液-液分配和多步柱净化步骤，本发明经MISPE柱“一步法”纯化后的样品可以直接采用HPLC或LC-MS仪器进行定量定性分析。

【附图说明】

图1：模板分子BSM、分子印迹聚合物MIP和空白聚合物NIP的红外光谱图。

图2：模板分子BSM在本发明苄嘧磺隆分子印迹柱(a)和空白柱(b)的保留时间。

图3：MISPE柱和ENVITM18-SPE柱处理的大米样品高效液相色谱图的比较，其中：(a)为空白大米样品；(b)为ENVITM18-SPE预处理的大米样品；(c)为MISPE柱预处理的大米样品。

图4：大豆样品液相色谱图，其中：(a)BSM、MSM、NS和TBM四种混标，(b)采用空白NIP柱预处理的加标大豆样品，(c)采用MIP柱预处理的大豆加标样品，(d)采用ENVITM-C18柱处理的大豆样品，(1)NS；(2)MSM；(3)TBM；(4)BSM。

图5：四种磺酰脲类除草剂的HPLC标准曲线。

图6：四种磺酰脲类除草剂的LC-ESI-MS标准曲线。

图7大豆样品的选择离子LC-ESI-MS色谱图，(a)MISPE柱预处理；(b)ENVITM18-SPE柱预处理。

【具体实施方式】

实施例1

苄嘧磺隆分子印迹聚合物的制备

该制备方法描述如下：

(1)聚合反应步骤：

将0.4071g苄嘧磺隆和500μL甲基丙烯酸溶于50mL二氯甲烷中，该混合物用超声波脱气3min。在温度10℃下混合过夜；

然后将上述混合物转入三颈瓶中，分别加入1.1704g三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯交联剂、0.2090g 2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮光引发剂和0.1127g二氯甲烷，然后超声混合使其完全溶解，充N₂保护，在搅拌速度为60r/min与室温下，在紫外光引发下进行聚合反应24h。聚合反应结束后，以丙酮反复洗涤数次，以除去细小颗粒和未反应物，然后在温度50℃减压下干燥后备用。

(2)模板分子洗脱步骤：

上述高分子聚合物用甲醇进行反复洗涤，除去其中存在的细颗粒，得到颗粒直径4μm以上的均匀聚合物；

把这种均匀聚合物装填到液相色谱柱中(100×4.6mm)，用1800psi的压力反复冲填，直至色谱柱充填实；

然后，该色谱柱使用以体积计9∶1的甲醇∶乙酸混合溶剂作为色谱流动相反复冲洗该色谱柱，洗脱模板分子，然后再以乙腈作为流动相冲洗该色谱柱相，直至在235nm波长下未检测出模板分子；

(3)把液相柱中已经被洗脱模板分子的印迹聚合物采用液相高压冲出于磨口减压浓缩器中，在温度48-52℃真空进行干燥，得到所述的苄嘧磺隆分子印迹聚合物。

同时，空白印迹聚合物(NIP)制备方法与上述苄嘧磺隆分子印迹聚合物制备方法相同，只是不加模板分子。

(4)产物鉴定：

步骤1：采用红外光谱技术比较MIP、NIP和BSM的微观结构，可以看到在MIP的红外图中有3500-3050cm^-1，它属于仲酰胺-NH的伸缩振动；1575.76cm^-1和1608.83cm^-1，它们分别属于仲酰胺-NH的弯曲振动和苯环C＝C伸缩振动，以及1373.75cm^-1，它属于-SO^2-的反对称伸缩振动，另外在MIP红外谱图中还出现了苯环C-H的弯曲振动(773.91cm^-1)，这些吸收峰都是模板分子BSM的红外特征峰。而空白聚合物NIP的红外图谱中并没有出现苯环、酰胺和-SO^2-等基团的吸收峰，由此表明聚合物MIP中有较多模板分子BSM的印迹位点，见附图1。

步骤2：将步骤(3)干燥后的MIP和NIP分布装填至100×4.6mm的不锈钢液相柱中，以乙腈∶甲醇(8∶2，v/v)为流动相，在235nm下检测。配置14μg/ml的苄嘧磺隆标准液，分别以MIP和NIP为液相固定相，采用Waters-510高效液相色谱仪检测，通过比较BSM在MIP柱和NIP柱上的保留时间长短，来判断制备的MIP对BSM是否具有识别作用，其结果见附图2。BSM在MIP柱中的保留时间明显比NIP柱长，表明制备的MIP对BSM具有明显的识别作用。

实施例2

(1)MISPE柱的准备：

称取200mg实施例1制备的苄嘧磺隆分子印迹聚合物，装填到3ml固相萃取空柱中，该柱上下两端放置0.45μm的筛板，得到苄嘧磺隆分子印迹固相萃取柱MISPE；MISPE柱在使用前应该使用5ml二氯甲烷进行活化处理；

(2)太湖大米样品MISPE-HPLC的测定：

为了比较MISPE柱与ENVI^TM18-SPE柱的净化效果，采用MISPE柱与ENVI^TM18-SPE柱对加标准物质BSM、MSM、NS和TBM的大米样品中的富集和净化效果进行了回收率的测定。BSM、MSM、NS和TBM都配成约2.5μg/mL混标乙腈溶液。

大米样品提取预处理：称取经粉碎混匀后过50目筛的大米样品约5g，置于50mL离心管中，添加上述混合标准物质溶液，使大米样品分别达到20ng/g和40ng/g混合标准物质，然后漩涡混匀20min，放冰箱中静置过夜，然后加入20mL乙腈溶液，剧烈振荡1h，再以12000r/min高速离心20min，收集上清液，其残留物重复上述步骤，合并上清液，装于浓缩蒸发瓶中，在温度50℃与压力0.01MPa下旋转蒸发至干，再用2×2.5mL二氯甲烷溶解。把该样品溶液加到在实施例2步骤(1)准备好的MISPE柱上，进行淋洗，洗脱，收集洗脱液，合并洗脱液在N₂气下进行浓缩，除去有机溶剂，其残留物用2-15mL乙腈溶解，得到净化样品溶液；

前面得到的净化样品溶液在下述条件下进行HPLC分析：安捷伦1100高效液相色谱仪，色谱条件为C18柱(250mm×4.6mm，i.d.，5μm，Agilent Co.，USA)，流动相A为含有0.01％磷酸，以体积计20∶80的乙腈-水混合物，流动相B为以体积计80∶20的乙腈-水混合物，梯度洗脱程序如(时间，溶剂(A)，v/v)：0min，70％；15min，20％；20min，0％；21min，70％；26min，70％；流速0.8mL min-1、检测波长235nm，进样体积20μL、柱温为30℃。

(3)标准曲线的制作：

分别配制5个不同浓度(6.7、3.0、0.6、0.3、0.1μg/mL)的MSM、NS、BSM和TBM混合标准溶液进行HPLC色谱测定，以各组分的3次平均峰面积(Y)对浓度(X，μg/mL)绘制标准曲线，标准曲线图见图6。

MISPE柱与ENVI^TM18-SPE柱洗脱液经高效液相分析前均浓缩10倍，进样量为10μL。从图3a可见，大米空白样品在MSM附近有一个较大的杂峰，由于该杂质的保留时间与MSM极其接近，因此可推测该物质的极性与MSM也非常接近，采用非特异性的ENVI^TM18-SPE柱富集和净化后，该物质没有被除去，由图3b可见该峰对MSM的定量带来较大的干扰，而从图3c可见，采用MISPE柱处理的加标大米样品，干扰杂质几乎全部被去除。分别采用MISPE柱与ENVI^TM-18柱对加标大米的净化和富集预处理后，经HPLC检测的NS，MSM，TBM和BSM回收率见表4。

表4：以MISPE和SPE柱预处理加标大米的回收率

由表4可以看出：经MISPE柱处理的回收率除TBM以外，其他三种均高于ENVITM18-SPE柱，其中以BSM的回收率最高，由表4可见实验中制备的苄嘧磺隆分子印迹固相萃取柱在实际加标大米样品的预处理是非常有效的。

实施例3

该实施例的实施方式与实施例2相同，只是进行大豆样品的MISPE-HPLC测定。

对大豆样品添加浓度为20ng/g和40ng/g的BSM、MSM、NS和TBM混标，MISPE柱与ENVI^TM18-SPE柱洗脱液经高效液相分析前均浓缩10倍，采用MISPE和ENVI^TM18-SPE柱预处理大豆样品的高效液相色谱图见附图4。表5为大豆加标样品分别采用MISPE和ENVI^TM18-SPE柱预处理后的回收率，从表5结果可见，采用MISPE柱预处理的BSM回收率最高，对加标浓度为20ng/g和40ng/g的回收率均达100％，高于ENVI^TM18-SPE柱的回收率，但是采用MISPE柱预处理的TBM的回收率反而低于ENVI^TM18-SPE柱，这主要是因为TBM与MIP的结合是非特异性吸附，其作用力是以π-π作用为主，当采用乙腈和丙酮(1∶2)淋洗时，这种π-π作用比较容易破坏，所以TBM的回收率较低。

表5MISPE和ENVI^TM18-SPE柱预处理大豆加标样品的回收率

实施例4

(1)MISPE柱的准备：

称取200mg实施例1制备的苄嘧磺隆分子印迹聚合物，装填到3ml固相萃取空柱中，该柱上下两端放置0.45μm的筛板，得到苄嘧磺隆分子印迹固相萃取柱MISPE；MISPE柱在使用前应该使用5ml二氯甲烷进行活化处理；

(2)太湖大米样品MISPE-LC-ESI-MS的测定

为了比较MISPE柱与ENVI^TM18-SPE柱的净化效果，采用MISPE柱与ENVI^TM18-SPE柱对加标准物质BSM、MSM、NS和TBM的大米样品中的富集和净化效果进行了回收率的测定。BSM、MSM、NS和TBM都配成约2.5μg/mL混标乙腈溶液。

大米样品提取预处理：称取经粉碎混匀后过50目筛的大豆样品约5g，置于50mL离心管中，添加上述混合标准物质溶液，使大米样品分别达到20ng/g和40ng/g混合标准物质，然后漩涡混匀20min，放冰箱中静置过夜，然后加入20mL乙腈溶液，剧烈振荡1h，再以12000r/min高速离心20min，收集上清液，其残留物重复上述步骤，合并上清液，装于浓缩蒸发瓶中，在温度50℃与压力0.01MPa下旋转蒸发至干，再用2×2.5mL二氯甲烷溶解。把该样品溶液加到在实施例2步骤(1)准备好的MISPE柱上，进行淋洗，洗脱，收集洗脱液，合并洗脱液在N₂气下进行浓缩，除去有机溶剂，其残留物用2-15mL乙腈溶解，得到净化样品溶液；

前面得到的净化样品溶液在下述条件下进行LC-ESI-MS分析：采用2695型高效液相色谱仪，ZMD4000型质谱仪(配有电喷雾离子化源(ESI)，三重四极杆质谱系统检测)和Masslynx v4.0色谱工作软件分析。色谱柱为Waters Symmetry C18(2.1×150mm)，流动相为甲醇-0.2％甲酸梯度洗脱，梯度条件如本说明书的表1所示，流动相A为甲醇，B为0.2％甲酸；柱温35℃，流速0.3mL/min，进样量5μL。MS条件为：采用电喷雾电离源(ESI)，实验采用正离子(positive ion)检测模式，检测质量范围为m/z 200-800u，N₂气为雾化气和辅助气，He气为碰撞气。毛细管电压3.93kV，锥孔电压20V，离子源温度100oC，脱溶剂温度250oC，光电倍增器电压650V，真空度2.6×10-5mBar，辅助气流速4L/h。

(3)标准曲线的制作：

标准曲线采用外标法。分别取稀释至30μg/mL的单标储备液各1mL于4个50mL的容量瓶中，加入乙腈至刻度，漩涡混匀，得0.6μg/mL的单标溶液。取30μg/mL的单标储备液各1mL于同一个50mL的容量瓶中加入乙腈至刻度，漩涡混匀，得0.6μg/mL的四种混标溶液，再把该混标溶液依次稀释得0.1、0.06、0.05、0.01μg/mL的工作液，供LC-ESI-MS进行分析，每个浓度进样3次，以色谱峰面积积分对浓度作图，得到四种磺酰脲除草剂各自的标准曲线，见图6。

对所述大米空白样品添加20ng.g^-1的BSM、MSM、NS和TBM混合标样，分别经MISPE和ENVITM18-SPE柱处理，同时也大豆样品也进行了同样处理。样品洗脱液进HPLC-ESI-MS分析前不浓缩，进样量为5μL。从图7(a)和7(b)MISPE预处理的加标大米和大豆样品的选择离子LC-ESI-MS色谱图可见，大豆和大米样品提取液经MISPE柱处理后，在BSM、MSM、NS和TBM附近几乎没有杂质峰的干扰，说明制备的MISPE柱对BSM具有明显的识别性和MISPE柱淋洗溶剂选择得当，能把MIP吸附的非选择性杂质完全去除。

Claims (9)

1.使用苄嘧磺隆分子印迹聚合物分析磺酰脲类除草剂的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：

(1)MISPE柱的准备：

称取50-200mg苄嘧磺隆分子印迹聚合物，装填到2-5ml固相萃取空柱中，得到苄嘧磺隆分子印迹固相萃取柱MISPE；MISPE柱在使用前使用2-15ml二氯甲烷、丙酮或乙腈进行活化处理；

(2)净化样品溶液制备：

把待分析样品溶液溶于二氯甲烷、丙酮或乙腈溶剂中得到样品溶液，把该样品溶液加到在步骤(1)准备好的MISPE柱上，进行淋洗，洗脱，收集洗脱液，合并洗脱液在N₂气下进行浓缩，除去有机溶剂，其残留物用2-15mL乙腈溶解，得到净化样品溶液；

(3)所述净化样品溶液的HPLC分析：

把步骤(2)得到的净化样品溶液在下述条件下进行HPLC分析：色谱条件为C18柱，250mm×4.6mm，直径5μm，流动相A为含有0.01％重量磷酸，以体积计20∶80的乙腈-水混合物，流动相B为以体积计80∶20的乙腈-水混合物；

(4)所述净化样品溶液的LC-MS分析：

在步骤(2)得到的净化样品溶液在下述条件下进行LC-MS分析：

LC条件：色谱柱为Waters Symmetry C18，2.1×150mm，流动相为甲醇-0.2％甲酸梯度洗脱；柱温35℃，流速0.3mL/min，进样量5μL；

MS条件：采用电喷雾电离源，正离子检测模式，检测质量范围为m/z200-800μ，N₂气为雾化气和辅助气，He气为碰撞气；毛细管电压3.93KV，锥孔电压20V，离子源温度100℃，脱溶剂气温度250℃，光电倍增器电压650V，真空度2.6×10^-5mBar，辅助汽流速4L/h；

所述苄嘧磺隆分子印迹聚合物的制备方法包括如下步骤：

(1)聚合反应步骤：

将一种或多种功能单体和苄嘧磺隆溶于溶剂中，超声混合脱气3-5min，在温度8-20℃下混合过夜；

所述的功能单体选自丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯、4-乙烯基吡啶、丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺；

所述的溶剂是乙腈或二氯甲烷；

所述的功能单体与苄嘧磺隆的量以摩尔比计是1∶1～1∶6；

然后将上述混合物转入三颈瓶中，分别加入交联剂、引发剂和分散剂，超声混合使其完全溶解，充N₂保护，在搅拌速度为60-200r/min下进行加热或使用紫外光引发进行聚合反应12-48h，得到一种高分子聚合物；

所述的交联剂、引发剂与分散剂的量以摩尔比计分别是1∶0.5～1∶1.5；

(2)模板分子洗脱步骤：

上述高分子聚合物用甲醇或丙酮进行反复洗涤，除去其中存在的细颗粒和未完全反应的单体，得到颗粒直径4μm以上的均匀聚合物；

把这种均匀聚合物装填到液相色谱柱中，用10-30MPa的压力反复冲填，直至色谱柱充填实；

然后，该色谱柱使用以体积计7-9∶3-1的甲醇∶乙腈混合溶剂作为色谱流动相反复冲洗该色谱柱，洗脱模板分子，然后再以乙腈作为流动相冲洗该色谱柱，直至在235nm波长下未检测出模板分子；

(3)把液相柱中已经被洗脱模板分子的印迹聚合物采用液相高压冲出于磨口减压浓缩器中，在温度48-52℃真空进行干燥，得到所述的苄嘧磺隆分子印迹聚合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的磺酰脲类除草剂是一种或多种选自苯磺隆、甲磺隆、苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、咪唑磺隆或氯嘧磺隆的除草剂。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法包括绘制磺酰脲类除草剂的HPLC标准曲线和LC-ESI-MS标准曲线。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的淋洗溶剂选自乙腈-丙酮、乙腈-甲醇、二氯甲烷-丙酮、二氯甲烷-甲醇或乙腈-甲醇溶剂混合物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗脱溶剂选自甲醇、甲醇-乙酸或甲醇-水溶剂混合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的交联剂选自三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯或对二乙烯苯。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的引发剂是热引发剂偶氮二异丁腈或光引发剂2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的分散剂选自氯仿、二氯甲烷或乙腈。

9.根据权利要求1所述的方法在测定食品、各种农产品、水、土壤的磺酰脲类除草剂中的用途。

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