CN107064368A - 衍生化hplc法测定水合肼的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了衍生化HPLC法测定水合肼的方法。包括在100℃水浴条件下，使用醛酮类衍生化试剂对肼衍生化生成在紫外可见光区有较强吸收的产物腙；衍生化反应结束后的反应液作为进样样品，利用HPLC法基于反相分配色谱在紫外可见光区测定其中水合肼的衍生产物腙，从而实现对水合肼的定量检测。本发明基于醛酮类衍生化试剂的肼类衍生化产物，大多数原料药及其杂质在远紫外可见光区吸收很弱，建立了一种简单的、通过柱前衍生化HPLC测定水合肼的方法。方法学验证的结果显示该方法专属性良好。

Description

衍生化HPLC法测定水合肼的方法

技术领域

本发明属于原料药分析检测领域，特别涉及一种衍生化HPLC法测定原料药中水合肼的方法。

背景技术

水合肼作为一种重要的精细化工原料，主要用于合成AC、D1PA、TSH等发泡剂；也用作锅炉和反应釜的脱氧和脱二氧化碳的清洗处理剂；在农药工业中用于生产除草剂、植物生长调和剂和杀菌、杀虫、杀鼠药；在医药工业中用于生产抗结核、抗糖尿病的药物，肼可对肝、肾、血液等系统产生毒副作用。有数据显示，肼可能具有致癌作用；因此这类化合物往往容易在药品中残留，过量摄入可能对人体造成危害。目前国际上普遍采用毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern，TTC)来对基因毒性杂质进行限度控制。基因毒性杂质限度通常较低，因此，需要建立高灵敏度的分析方法对药物中的这类化合物进行监控。

如何快速、简便、高灵敏度地监测生产过程中的肼的残留量，一直是药物残留检测研究的一个问题。

现今，大多数文献报道的方法都是针对测定水环境中的水合肼。常用的检测水合肼的方法有流动注射化学发光分析、荧光分析、分光光度法、气相色谱分析法等。分光光度法测定水中水合肼，对于检测药物而言其专属性、灵敏度不高。气相色谱对水合肼分析一般采用直接和衍生化法。直接法是采用热导检测器(TCD)进行，由于热导检测器不是很灵敏，造成此方法分析灵敏度低，另外，由于水合肼是强碱性化合物，对于柱子的选择也有较高的要求。张渝等人用糠醛衍生-气相色谱/质谱法测定地表水中的肼，虽然质谱检测器是一种灵敏度和通用的检测器，然而高昂的价格限制了它的推广使用。

相比于水样分析，测定原料药中残留的水合肼面临着更多的挑战。首先原料药基质的复杂性远高于水样，因此要求分析方法具备高度的专属性，这样才能有效的减少干扰；为此，前处理条件越简单对结果的准确性越有利。考虑到上述事实，我们希望通过液相衍生化技术来改善这些问题。液相衍生化技术通过化学反应给待测物引入特定的基团，不仅可以提高检测灵敏度，还能改善待测物的分离效果，适合于肼残留的定量分析。Jenny Wang等人用液相衍生化技术测定肼，参考他们的衍生化反应条件进行衍生化反应后，发现衍生产物腙的收率只有3.1％，无法测定原料药中低含量的水合肼，因此，对水合肼衍生化反应条件进行了一系列的研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供衍生化HPLC法测定水合肼的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种衍生化HPLC法测定水合肼的方法，包含以下步骤：

(1)在100℃水浴条件下，使用醛酮类衍生化试剂对待测液体进行衍生化反应生成在406nm处有较强吸收的产物；

(2)以步骤(1)中衍生化反应结束后的反应液作为进样样品，利用HPLC法，基于反相分配色谱法原理，在406nm测定其中水合肼的衍生化产物，从而实现对待测液体中水合肼的定性或定量检测。

进一步的，步骤1中衍生化反应是以二甲亚砜-冰醋酸-水为反应体系。

进一步的，二甲亚砜-冰醋酸-水反应体系中冰醋酸体积浓度为10％～50％；水的体积浓度为0％～5％；，2-羟基-1-萘甲醛在反应体系中的浓度为0.6～3mg/mL；衍生化反应时间为20～120min；衍生化反应温度为50～100℃水浴。

进一步的，步骤1中醛酮类衍生化试剂为2-羟基-1-萘甲醛。

进一步的，步骤2中HPLC法采用高效液相色谱仪，采用反相分配色谱法，以非极性键合相为固定相，极性流动相，检测波长为406nm。

进一步的，高效液相色谱仪采用GL Sciences IncInertSustain色谱柱，进样量20μL；流动相梯度：A相为乙腈，B相为三氟乙酸水溶液。

HPLC法优选：采用高效液相色谱仪；采用反相分配色谱法：以非极性键合为固定相，采用极性流动相，检测波长为406nm。

HPLC法更进一步优选使用仪器为Shimadzu LC-20AD液相色谱仪，该色谱仪配制有在线真空脱气机、二元梯度泵，自动进器、柱温箱紫外检测器和Labsolutions工作站；色谱柱采用GL Sciences Inc InertSustain150mm×4.6mm，5μm；进样量20μL；流动相梯度：A相为乙腈，B相为0.4％三氟乙酸(pH1.2)，0min70％A相，5min90％A相，12min90％A相，13min70％A相，23min70％A相；柱温35℃；检测波长406nm。

本发明所述的方法可用于多种样品中水合肼的定性与定量检测，优选在测定原料药中水合肼的应用。

本发明基于水合肼在紫外区吸收很弱，通过醛酮类衍生化试剂的衍生化反应，生成在近可见紫外区吸收较强的物质。大多数药物及其杂质在近可见光区紫外吸收很弱，建立了一种简单的、通过柱前衍生化HPLC测定水合肼的方法。方法验证的结果显示药物中常见的有机酸和其它杂质均不会对分析造成干扰，表明该方法专属性良好。此方法的最低检测限为 0.6504ng/mL，最低定量限为2.168ng/mL，线性关系良好(r＞0.999)；平均回收率在96.7％～106.9％之间(RSD为4.3％)，无基质干扰；且衍生化产物在72小时内稳定性良好。

附图说明

图1是实施例原料药、衍生试剂(HNA)、衍生产物的紫外光谱图，确定检测波长。

图2是实施例反应条件对水合肼衍生化的影响：(A)体系中水的比例对衍生化效率的影响；(B)反应时间对衍生化效率的影响；(C)反应温度对衍生化效率的影响；(D)体系中冰醋酸比例对衍生化效率的影响；(E)HNA浓度对衍生化效率的影响。待测物的浓度均为1mg/ml。

图3是实施例水合肼浓度与衍生化产物峰面积线性回归方程。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的说明。

1.1.仪器

Shimadzu LC-20AD液相色谱仪(含在线真空脱气机、二元梯度泵，自动进样器、柱温箱、紫外检测器和Labsolution色谱工作站)Sartorius BT125D电子天平(北京赛多利斯有限公司)。

1.2.试剂

冰醋酸(99.5％)、水合肼(98％)、2-羟基-1-萘甲醛(98％)、二甲亚砜(99％)、纯化水、乙腈(TEDIA,色谱纯)、三氟乙酸(色谱纯)。

1.3.溶液的制备

2-羟基-1-萘甲醛(以下简称HNA)：取试剂250mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，用二甲亚砜稀释至刻度，溶解摇匀即可。

水合肼：称取试剂10mg置于10mL容量瓶，用二甲亚砜溶解稀释制成每1mL中含1mg的溶液作为水合肼贮备液1；从贮备液1中移取0.1mL至10mL容量瓶中，用二甲亚砜稀释制成每1mL中含10μg的溶液，作为水合肼贮备液2；从贮备液2中移取1mL至10mL容量瓶中，

用二甲亚砜稀释制成每1mL中含1μg作为水合肼贮备液3。

1.4.衍生化实验条件

精密称定适量供试品，置于10mL容量瓶中，分别加入0.3mL水、3mL冰醋酸和3mLHNA，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，沸水浴加热20min，取出、冷却后取20μl直接进样。

反应原理：

供试品溶液制备：精密称定适量供试品，置于10mL容量瓶，分别加入0.3mL水、3mL冰醋酸和3mL HNA，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，沸水浴加热20min，取出、冷却后取20μl直接进样。

对照品溶液制备：精密称定适量供试品，置于10mL容量瓶，分别加入0.3mL水、3mL冰醋酸和3mL HNA、0.1mL水合肼溶液贮备液3，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，沸水浴加热20min，取出、冷却后取20μL直接进样。

色谱条件：Shimadzu LC-20AD液相色谱仪，该色谱仪配制有在线真空脱气机、二元梯度泵，自动进样器、柱温箱、紫外检测器和Labsolutions工作站；色谱柱采用GL SciencesIncInertSustain150mm×4.6mm,5μm；进样量20μL；柱温35℃；检测波长406nm。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

标曲绘制方法：精密称取供试品10mg置10mL容量瓶中，加3mL HNA，3mL冰醋酸，0.3mL水，分别移取水合肼贮备液(200ng/mL)0mL、0.05mL、0.2mL、0.35mL、0.5mL、0.65mL、0.8mL，用DMSO稀释至刻度，摇匀，沸水浴加热20min取出，摇匀，冷却，按上述最佳色谱条件取20μL注入液相色谱仪，测定衍生化产物的峰面积。以水合肼浓度c(ng/mL)为横坐标，衍生化产物峰面积A为纵坐标，采用最小二乘法进行线性回归分析，计算线性回归方程及相关系数。每个浓度平行测定3次，扣除样品中残留后按所得峰面积平均值(y)对水合肼浓度做标准曲线。

定量方法：采用外标法定量。

为了确保衍生化反应快速进行同时避免产物降解，需对体系中冰醋酸的比例、水的比例、衍生化试剂的用量、反应时间和反应温度进行考察。以衍生化产物峰面积为指标，单因素考 察了不同浓度的HNA(2.0、5.0、10.0mg/mL)、冰醋酸比例(0、30％、50％)、水的比例(0、1％、3％、5％)、反应时间(20min、40min、60min、90min、120min)和反应温度(25℃、50℃、70℃、100℃)对衍生化反应效率的影响。具体结果见图1的A-E。

方法学验证与应用

3.1专属性

专属性试验主要考察了衍生试剂、供试品、水合肼、空白在衍生产物出峰处无干扰，说明该方法的专属性良好。

3.2线性与范围

精密称取供试品10mg置10mL容量瓶中，加3mL HNA(5mg/mL)，3mL冰醋酸，0.3mL水，分别移取水合肼贮备液(200ng/mL)0mL、0.05mL、0.2mL、0.35mL、0.5mL、0.65mL、0.8mL，用二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为1ng/mL、4ng/mL、7ng/mL、10ng/mL、13ng/mL、16ng/mL的溶液，置沸水浴加热20min，取出，冷却，摇匀，按上述最佳色谱条件取20μL注入液相色谱仪，测定衍生化产物的峰面积。以水合肼浓度c(ng/mL)为横坐标，衍生化产物峰面积A为纵坐标，采用最小二乘法进行线性回归分析，计算线性回归方程及相关系数。每个浓度平行测定3次，扣除样品中残留后按所得峰面积平均值(y)对水合肼浓度进行线性回归，线性回归方程为A＝664.63c-57.676，r＝0.999，说明本品在1ng/mL～16ng/mL范围内线性良好，测定结果见表2。线性图见图3。

表2

3.3检测限与定量限

以信噪比3:1为方法的检测限，以信噪比10:1为方法的定量限。结果显示水合肼的最低检测限为0.6504ng/mL，相当于样品检测浓度的0.6ppm；最低定量限为2.168ng/mL，相当于样品检测浓度的2ppm。

3.4准确度

称取原料药10mg置10mL量瓶中，作为回收率基质样品。以杂质水合肼的含量(0.001％ 基质样品浓度)为基准100％。精密移取水合肼贮备液3：0.07mL、0.10mL、0.13mL，分别置于盛有基质样品的10mL量瓶中，加3mL HNA、3mL冰醋酸、0.3mL水，用DMSO稀释至刻度，摇匀，配制成含杂质70％、100％、130％的溶液，同法平行3次，作为供试品溶液。将供试品溶液置沸水浴加热20min，取出，冷却，摇匀。按上述最佳色谱条件进行测定。测定结果见表3。

表3 药物中水合肼的准确度结果

由表中结果可以看出，该方法的平均回收率在96.7％～106.9％之间，相对标准偏差为4.3％。

3.5稳定性试验

准确称取供试品，按上述衍生化反应配制对照溶液分别在室温下放置0、1、2、3、25、72小时后，按上述测定方法进行测定。结果表明，在室温条件下，衍生产物腙放置至少3天内稳定。

综上所述，本发明方法能够有效的分离原料药与水合肼衍生产物腙，能够准确、快速测定水合肼，该方法简单、快速、准确、有效，精密度高，是测定原料药中水合肼的理想方法。参考文献

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以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式的限制。凡是依据本发明的技术和方法实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术和方法方案的范围内。

Claims (6)

1.一种衍生化HPLC法测定水合肼的方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)在100℃水浴条件下，使用醛酮类衍生化试剂对待测液体进行衍生化反应生成在406nm处有较强吸收的产物；

(2)以步骤(1)中衍生化反应结束后的反应液作为进样样品，利用HPLC法，基于反相分配色谱法原理，在406nm测定其中水合肼的衍生化产物，从而实现对待测液体中水合肼的定性或定量检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1中衍生化反应是以二甲亚砜-冰醋酸-水为反应体系。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述二甲亚砜-冰醋酸-水反应体系中冰醋酸体积浓度为10％～50％；水的体积浓度为0％～5％；，2-羟基-1-萘甲醛在反应体系中的浓度为0.6～3mg/mL；衍生化反应时间为20～120min；衍生化反应温度为50～100℃水浴。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1中醛酮类衍生化试剂为2-羟基-1-萘甲醛。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2中HPLC法采用高效液相色谱仪，采用反相分配色谱法，以非极性键合相为固定相，极性流动相，检测波长为406nm。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪采用GL SciencesIncInertSustain色谱柱，进样量20μL；流动相梯度：A相为乙腈，B相为三氟乙酸水溶液。