CN109521136A - 衍生化hplc-dad法测定药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种衍生化HPLC‑DAD法测定药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的方法。本发明方法通过使用苯甲醛类衍生化试剂与苯肼及其衍生物反应后生成在近可见光‑可见光区有较强吸收的产物；以衍生化反应液作为样品，基于反相高效液相色谱的原理在近可见光‑可见光区测定苯肼及其衍生物的反应产物，从而实现苯肼及其衍生物的定性或定量检测，由于衍生化产物的吸收波长明显红移，可以有效地避免药物或合成中间体的基质干扰，此外，方法学验证的结果显示该方法专属性和灵敏度良好。
Description
技术领域
本发明属于药品分析检测领域，尤其涉及一种衍生化HPLC-DAD法测定药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的方法。
背景技术
药物中的杂质是在活性药物成分(Active Pharmaceutical Ingredients,APIs)或制剂的生产和贮藏过程引入的其他物质[1]。有些杂质即使以微量的水平存在于药物之中，同样会影响到药物的活性和安全性，对药品的风险评估产生严重影响。基因毒性杂质(Genotoxic impurities,GTIs)是一类可以与生物体遗传物质发生作用而产生毒性的化合物，其特点是在低浓度时即可造成遗传物质的损伤，进而导致基因突变，并可能促使肿瘤的发生[2]。近几年来，随着基因毒性杂质法规的逐步完善，美国食品和药物管理局(Food andDrug Administration,FDA)以及欧洲药物管理局(European Medicines Agency,EMA)等部门对基因毒性杂质的监管要求越来越高[3]。因此，在药物生产过程中，基因毒性杂质的控制十分重要。
人用药品注册技术要求国际协调会(International Council forHarmonisation,ICH)将基因毒性杂质分为5大类，其中第3类和第4类杂质是具有警示结构的化合物，具备潜在的基因毒性，需要对其基因毒性进行评估并制定合理限度[4]。苯肼是ICH列出的警示结构之一。在药物合成方面，苯肼及其衍生物是合成吲唑、吡唑、吡唑啉等活性成分的常用中间体[5-7]。作为起始物料，使用量很大，残留的风险较高，需进行严格控制。例如，对-磺酰胺基苯肼盐酸盐是合成塞来昔布的原料，同时因其具有肼基这一警示结构，属于基因毒性杂质，需要明确规定其限度。USP最新的讨论稿中收载塞来昔布中的对-磺酰胺基苯肼盐酸盐的限度为3.75ppm。
已报道的测定苯肼的分析技术主要包括分光光度法[8-10]、毛细管气相色谱法[11]、毛细管电泳法[12]、电化学法[13-15]等。这些方法的检测对象主要面向水体和生物样品。药物中苯肼及其衍生物的杂质检查是必要的。高效液相色谱-紫外检测(HPLC-DAD)法是药物质量控制的常用手段，开发一种简单、灵敏、稳定的HPLC-DAD法用于药物中苯肼及其衍生物的检测具有重要意义。然而该方法的开发面临一个重要挑战。虽然苯肼及其衍生物的结构中有苯环，具有紫外吸收特性，可以直接进行HPLC-UV检测。但是大多数药物或合成中间体均有较强的紫外吸收，而且药物或合成中间体本身含量大，需要建立一个色谱条件去分离药物和杂质，干扰多，灵敏度低(基线噪音大)，会干扰痕量杂质的定量检测。
发明内容
发明目的：为了解决常规HPLC-UV检测中某些基质如药物或合成中间体对苯肼及其衍生物的干扰，发明人提供了一种衍生化HPLC-DAD法测定苯肼及其衍生物特别是药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的方法。
技术方案：
一种衍生化HPLC-DAD法测定苯肼及其衍生物的方法，包括：
(1)使用苯甲醛类衍生化试剂与苯肼及其衍生物反应，生成在紫外-可见光区330～460nm内有较强吸收的产物；
(2)以步骤(1)反应后的反应液为样品，利用HPLC-DAD法，基于反相分配色谱法原理，在紫外-可见光区330～460nm进行测定，从而实现对苯肼及其衍生物的定性或定量检测。
所述苯甲醛类衍生化试剂的结构如下式所示：
式中，R1、R2、R3各自独立的选自氢、硝基、羟基、未被取代或被至少一个甲基取代的氨基。
优选的，所述的苯甲醛类衍生化试剂选自2-硝基苯甲醛，4-硝基苯甲醛，2,4-二硝基苯甲醛，水杨醛，4-二甲氨基苯甲醛，苯甲醛中的任意一种，更优选为4-硝基苯甲醛。
所述苯肼及其衍生物选自苯肼、对-磺酰胺基苯肼、4-肼基苯磺酸、3-肼基苯磺酰胺和3-肼基苯磺酸中的至少一种。
检测步骤(1)中，所述反应以乙腈-水为反应体系，反应体系中乙腈的体积浓度为10％～90％，优选为60～80％；反应温度为20～90℃，优选为20～60℃；反应时间为0.5～3h，优选为0.5～1.5h；苯甲醛类衍生化试剂在反应体系中的浓度≥0.1mg/mL，优选为0.1～10.0mg/mL，进一步优选为0.5～5.0mg/mL。当采用4-硝基苯甲醛检测苯肼时，较佳的条件为：反应体系中乙腈的体积浓度为70～80％；反应温度为20～30℃；反应时间为0.5～1h；4-硝基苯甲醛在反应体系中的浓度为2～2.5mg/mL。当采用4-硝基苯甲醛检测对-磺酰胺基苯肼时，较佳的条件为：反应体系中乙腈的体积浓度为60～70％；反应温度为60～70℃；反应时间为1～1.5h；4-硝基苯甲醛在反应体系中的浓度为2～2.5mg/mL。
步骤(2)中，所述的HPLC-DAD法采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；以非极性键合相为固定相，采用极性流动相，检测波长位于330～460nm之间。采用4-硝基苯甲醛时，检测波长为390-430nm。
更进一步优选的，所述的HPLC-DAD法使用的仪器为Shimadzu LC 20AT液相色谱仪；色谱柱采用250mm×4.6mm,5μm的DiamonsilTM C18柱；进样量：20μL；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液(含乙腈体积分数为40-80％)，等度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：400-420nm。
本发明还提供了所述的方法在测定药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的应用。
一种衍生化HPLC-DAD法测定药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的方法，包括：
(1)温度20～90℃下，使用苯甲醛类衍生化试剂与药物或合成中间体反应0.5～3h；
(2)以步骤(1)中反应后的反应液为样品，利用HPLC-DAD法，基于反相分配色谱法原理，在紫外-可见光区330～460nm测定其中苯肼及其衍生物的反应产物，从而实现对药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的定性或定量检测。
所述苯甲醛类衍生化试剂的结构如下式所示：
式中，R1、R2、R3各自独立的选自氢、硝基、羟基、未被取代或被至少一个甲基取代的氨基。
优选的，所述的苯甲醛类衍生化试剂选自2-硝基苯甲醛，4-硝基苯甲醛，2,4-二硝基苯甲醛，水杨醛，4-二甲氨基苯甲醛，苯甲醛中的任意一种，更优选为4-硝基苯甲醛。
所述苯肼及其衍生物选自苯肼、对-磺酰胺基苯肼、4-肼基苯磺酸、3-肼基苯磺酰胺和3-肼基苯磺酸中的至少一种。经实验，苯甲醛类衍生化试剂与上述苯肼及其衍生物均可发生专属性反应，产物的吸收波长红移。
检测步骤(1)中，所述反应以乙腈-水为反应体系，反应体系中乙腈的体积浓度为10％～90％，优选为60～80％；反应温度为20～90℃，优选为20～60℃；反应时间为0.5～3h，优选为0.5～1.5h；苯甲醛类衍生化试剂在反应体系中的浓度≥0.1mg/mL，优选为0.1～10.0mg/mL，进一步优选为0.5～5.0mg/mL。当采用4-硝基苯甲醛检测苯肼时，较佳的条件为：反应体系中乙腈的体积浓度为70～80％；反应温度为20～30℃；反应时间为0.5～1h；4-硝基苯甲醛在反应体系中的浓度为2～2.5mg/mL。当采用4-硝基苯甲醛检测对-磺酰胺基苯肼时，较佳的条件为：反应体系中乙腈的体积浓度为60～70％；反应温度为60～70℃；反应时间为1～1.5h；4-硝基苯甲醛在反应体系中的浓度为2～2.5mg/mL。
步骤(2)中，所述的HPLC-DAD法采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；以非极性键合相为固定相，采用极性流动相，检测波长位于330～460nm之间。采用4-硝基苯甲醛时，检测波长为390-430nm。
更进一步优选的，所述的HPLC-DAD法使用的仪器为Shimadzu LC 20AT液相色谱仪；色谱柱采用250mm×4.6mm,5μm的DiamonsilTM C18柱；进样量：20μL；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液(含乙腈体积分数为40-80％)，等度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：400-420nm。
所述的药物优选为安替比林、吲达帕胺和塞来昔布，但不局限于上述药物。待测药物不需要进行预处理，精密称定后用反应体系溶解稀释，加入苯甲醛类衍生化试剂，完成衍生反应后进样。药物中苯肼及其衍生物为痕量，反应体系中苯甲醛类衍生化试剂过量。
有益效果：
大多数药物及其有关物质在近可见-可见光区吸收很弱，发明人发现苯甲醛类衍生化试剂与苯肼及其衍生物发生专属性反应，产物的吸收波长明显红移，可以有效地避免药物或合成中间体的基质干扰，通过进一步优化衍生化条件，发明了一种简单、通用的衍生化HPLC-DAD法测定药物或合成中间体中痕量苯肼及其衍生物的方法。方法学验证的结果显示衍生化试剂本身，药物和其他杂质均不会对分析造成干扰，专属性良好。此外，方法的检测限为0.008-0.01μg/mL,定量限为0.02-0.03μg/mL，线性关系良好(r>0.999)；进样精密度小于2.4％；平均回收率在92.9-109.7％之间(RSD<6.2％)，无明显的基质干扰；且衍生化产物稳定性良好，4-硝基苯甲醛的衍生化产物在4h内稳定。
附图说明
图1为分别以苯甲醛(A)，水杨醛(B)，4-二甲氨基苯甲醛(C)，2-硝基苯甲醛(D)，4-硝基苯甲醛(E)，2,4-二硝基苯甲醛(F)作为衍生化试剂与苯肼反应生成的产物的紫外-可见吸收光谱图；衍生化试剂的浓度均为5.0mg/mL，苯肼的浓度为10μg/mL；
图2为4-硝基苯甲醛(2.5mg/mL)在不同波长下的色谱图；其中，264nm(a),300nm(b),340nm(c),380nm(d)和416nm(e)；
图3为反应条件对4-硝基苯甲醛与苯肼衍生化效率的影响：(A)反应体系中的含水量，(B)衍生化试剂的浓度，(C)反应时间，(D)反应温度。苯肼的浓度均为0.10μg/mL；
图4为方法专属性的色谱图：空白溶液(a),安替比林溶液(b),吲达帕胺溶液(c),安替比林加标溶液(d),吲达帕胺加标溶液(e)，苯肼对照溶液(f)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
1.1.仪器
Shimadzu LC 20AT液相色谱仪(含在线真空脱气机、二元梯度泵，自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站)；METTLER TOLEDO AB135-S分析天平(梅特勒瑞典公司)；sartorious BS110分析天平(北京赛多利斯有限公司)。
1.2.试剂
苯甲醛(BA,98％)，2-硝基苯甲醛(2-NBA,97％)，4-硝基苯甲醛(4-NBA,97％)，水杨醛(SA,98％)，2,4-二硝基苯甲醛(2,4-DNBA,98％)，4-二甲氨基苯甲醛(4-DMABA,分析纯)，对-磺酰胺基苯肼(4-SAPH·HCl,98％)，苯肼(PH,98％)，安替比林原料药(antipyrine)，吲达帕胺原料药(indapamide)，塞来昔布原料药(celecoxib)，超纯水，乙腈(色谱纯)，磷酸(分析纯)。
1.3.溶液的制备
1.3.1苯肼储备液：
取苯肼约10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液100μL，置于10mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀即可，储备液中，苯肼的浓度为10μg/mL。
1.3.2对-磺酰胺基苯肼储备液：
取对-磺酰胺基苯肼(CAS号4392-54-5)约10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液100μL，置于10mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀即可，储备液中，对-磺酰胺基苯肼的浓度为10μg/mL。
1.3.3衍生化试液：
2-硝基苯甲醛，4-硝基苯甲醛，2,4-二硝基苯甲醛，水杨醛，4-二甲氨基苯甲醛，苯甲醛试液：分别取上述试剂约500mg，精密称定，各置于10mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀即可，浓度均为50mg/mL。
1.3.4苯肼衍生化反应溶液：
精密移取苯肼储备液适量，置于10mL量瓶中，加入衍生化试液适量，用乙腈-水(80:20,v/v)定容到刻度，摇匀即可。
1.3.5对-磺酰胺基苯肼衍生化反应溶液：
精密移取对-磺酰胺基苯肼储备液适量，置于10mL量瓶中，加入衍生化试液适量，用乙腈-水(60:40,v/v)定容到刻度，摇匀即可。
1.4.HPLC-DAD条件
色谱柱采用250mm×4.6mm,5μm的DiamonsilTM C18柱；进样量：20μL；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液(乙腈体积占40-80％)，等度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；DAD波长范围：190-800nm。
实施例1衍生化试剂的比较
精密移取1mL的10μg/mL苯肼储备液，置于10mL量瓶中，分别加入苯甲醛类衍生化试液1mL，用乙腈-水(80:20,v/v)定容到刻度，摇匀。室温下反应45min，取20μL注入HPLC-DAD分析。
HPLC-DAD条件：Shimadzu LC 20AT液相色谱仪(含在线真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站)；色谱柱采用250mm×4.6mm,5μm的DiamonsilTM C18柱；进样量：20μL；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液(70:30,v/v)，等度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：416nm。记录产物的光谱图和色谱图，以产物的最大吸收波长和吸收强度来评价衍生化试剂的优劣。
为了尽可能的消除药物及其有关物质的基质干扰，理想的情况是苯肼与衍生化试剂的反应产物最大吸收波长红移最为明显。图1为6种衍生化试剂与苯肼的衍生产物的吸收光谱，产物的特征最大吸收波长分别为341nm(苯甲醛)、344nm(水杨醛)、358nm(4-二甲氨基苯甲醛)、340nm(2-硝基苯甲醛)、416nm(4-硝基苯甲醛)和451nm(2,4-二硝基苯甲醛)。结果表明，苯肼与苯甲醛类衍生化试剂的反应产物最大吸收波长均发生红移现象，其中4-硝基苯甲醛和2,4-二硝基苯甲醛红移现象最为明显。综合吸收强度的结果来看，与4-硝基苯甲醛反应的产物吸收强度最大。因此，选4-硝基苯甲醛为衍生化试剂最为合适。
本方法中，衍生化试剂4-硝基苯甲醛的使用浓度较高，达到mg/mL的级别，远超过其与苯肼发生衍生化反应的化学计量比。因此，考察了4-硝基苯甲醛在不同波长下的色谱图(图2)。结果表明，在检测波长为380nm以下时(a-d)，4-硝基苯甲醛色谱峰明显，并伴有多个杂质峰存在。在检测波长为416nm时(e)，4-硝基苯甲醛色谱峰显著降低，基线平稳，无杂质峰。该结果证明，在416nm波长下，检测苯肼与4-硝基苯甲醛的反应产物，可以降低非目标化合物的干扰，大大提高方法的专属性。
实施例2衍生化条件优化
为了确保衍生化反应效率，考察了体系中衍生化试剂的浓度、反应时间、反应温度和有机相比例。以苯肼与4-硝基苯甲醛的衍生产物的峰面积为指标，单因素试验研究了反应体系的含水量(1、5、8、10、20、30、50、70％,v/v)、4-硝基苯甲醛的浓度(0.2、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0mg/ml)、反应时间(15、30、45、60、90、120、180min)和反应温度(25、40、60、80℃)对衍生化反应效率的影响，结果如图3所示；实验中，体系中苯肼的浓度均为1μg/mL。
由图3中A可知，反应体系中加入一定体积的水有利于衍生化反应的进行，衍生化产物的峰面积随着含水量的增加而增大。当含水量大于20％(体积分数)时，衍生产物的峰面积不再增加。由图3中B可知，衍生化产物的峰面积随着衍生化试剂浓度的增加而增大，直到4-硝基苯甲醛浓度为2.5mg/mL时，衍生产物的峰面积不再增加。由图3中C可知，反应时间加长至45min，衍生化产物的峰面积略有增加，之后基本维持不变，最终选择反应45min进行后续实验。由图3中D可知，反应温度对衍生化产物的峰面积影响不大，说明室温下该衍生化反应就能快速进行。
最终选择最佳衍生化条件为：反应体系为乙腈-水(80:20,v/v)，衍生化试剂4-硝基苯甲醛的浓度为2.5mg/mL，25℃下反应45min。
实施例3方法学验证与应用
3.1.专属性
用安替比林和吲达帕胺两种原料药考察了该方法测定苯肼的特异性。
苯肼对照溶液：精密移取20μL苯肼储备液和500μL 4-硝基苯甲醛衍生化试液，置于10mL量瓶中，用乙腈-水(80:20,v/v)定容至刻度(即10ml)，摇匀；25℃下反应45min，摇匀即得，取20μL按实施例1中的HPLC-DAD方法直接进样。
空白溶液：500μL 4-硝基苯甲醛衍生化试液，置于10mL量瓶中，用乙腈-水(80:20,v/v)定容至刻度，摇匀；25℃下反应45min，摇匀即得，取20μL按实施例1中的HPLC-DAD方法直接进样。
安替比林溶液：精密称定50mg安替比林，精密移取500μL4-硝基苯甲醛衍生化试液，置于10mL量瓶中，用乙腈-水(80:20,v/v)定容至刻度，摇匀；25℃下反应45min，摇匀即得，取20μL按实施例1中的HPLC-DAD方法直接进样。
安替比林加标溶液：精密称定50mg安替比林，精密移取20μL苯肼储备液和500μL4-硝基苯甲醛衍生化试液，置于10mL量瓶中，用乙腈-水(80:20,v/v)定容至刻度，摇匀；25℃下反应45min，摇匀即得，取20μL按实施例1中的HPLC-DAD方法直接进样。
吲达帕胺溶液：精密称定50mg吲达帕胺，精密移取500μL4-硝基苯甲醛衍生化试液，置于10mL量瓶中，用乙腈-水(80:20,v/v)定容至刻度，摇匀；25℃下反应45min，摇匀即得，取20μL按实施例1中的HPLC-DAD方法直接进样。
吲达帕胺加标溶液：精密称定50mg吲达帕胺，精密移取20μL苯肼储备液和500μL4-硝基苯甲醛衍生化试液，置于10mL量瓶中，用乙腈-水(80:20,v/v)定容至刻度，摇匀；25℃下反应45min，摇匀即得，取20μL按实施例1中的HPLC-DAD方法直接进样。
结果如图4所示，两种原料药、衍生化试剂与苯肼衍生化产物的分离度良好，且无其他杂质峰干扰，说明该方法的专属性良好。
3.2.线性与范围
对照品溶液制备：精密移取一定体积的苯肼储备液，置于10mL量瓶中，加入500μL4-硝基苯甲醛衍生化试液，用乙腈-水(80:20,v/v)定容至刻度，摇匀；25℃下反应45min，摇匀即得对照品溶液。
色谱条件与实施例1中的HPLC-DAD方法相同
标准曲线绘制：按照对照品溶液制备方法，精密移取不同体积的苯肼储备液置于10mL量瓶中，加入500μL衍生化试剂，加乙腈-水(80:20,v/v)定容至刻度，摇匀，制成含对-磺酰胺基苯肼浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.10、0.20、0.40μg/mL的系列对照品溶液；将反应后的对照品溶液分别取20μL注入液相色谱仪，测定衍生产物的峰面积。以苯肼的浓度C(μg/mL)为横坐标，衍生产物峰面积(A)为纵坐标，采用最小二乘法进行线性回归分析，计算线性回归方程及相关系数。结果见表1，苯肼在0.02～0.40μg/mL浓度范围内呈线性，且线性关系良好(r>0.999)。
定量方法：外标法。
3.3.检测限与定量限
以信噪比3:1为方法的检测限，以信噪比10:1为方法的定量限。结果显示，苯肼的检测限为0.008μg/mL，定量限为0.02μg/mL。具体见表1。
3.4.精密度试验
按3.2项下方法配制浓度为0.10μg/mL的苯肼对照品溶液，取20μL注入HPLC-DAD重复进样6次，计算衍生产物峰面积的RSD。由表1可知，该方法精密度良好，RSD＝1.3％。
3.5.衍生产物稳定性
按实施例3中3.1专属性项下配制的苯肼对照品溶液，安替比林加标溶液和吲达帕胺加标溶液反应后，放置0，0.5，1，2，3，4h，分别取20μL注入HPLC-DAD进样分析，以待测物峰面积的变化考察衍生物的稳定性。由表1可知，所有样品中苯肼衍生产物在0～4h内峰面积的RSD＜2.0％，稳定性良好。
3.6.准确度试验
为评价该方法的准确度，分别考察了苯肼在安替比林(5mg/mL)和吲达帕胺(2mg/mL)中不同加标浓度水平的回收率。
回收率对照品溶液：按3.2项下方法配制低、中、高三个浓度(含苯肼浓度分别为0.02、0.10、0.40μg/mL)的对照品溶液，不加药物本底。每个浓度平行制备3份。
回收率样品溶液：①取安替比林约50mg，精密称定，置于10mL量瓶中，再精密移取苯肼储备液适量，加入500μL4-硝基苯甲醛衍生化试液，用乙腈-水(80:20,v/v)定容至刻度，摇匀，配成含苯肼浓度分别为0.02、0.10、0.40μg/mL的加标样品溶液；25℃下反应45min，摇匀，过滤后取20μL进样。每个浓度平行制备3份。②取吲达帕胺约20mg，精密称定，置于10mL量瓶中，再精密移取苯肼储备液适量，加入500μL4-硝基苯甲醛衍生化试液，用乙腈-水(80:20,v/v)定容至刻度，摇匀，配成含苯肼浓度分别为0.02、0.10、0.40μg/mL的加标样品溶液；25℃下反应45min，摇匀，过滤后取20μL进样。每个浓度平行制备3份。
加标回收率＝(样品峰面积-本底峰面积)/对照品峰面积×100％。
计算加标回收率的平均值和RSD。由表1可知，苯肼的加标回收率在94.6～109.7％之间，且RSD均小于2.7％。
表1方法学试验结果
注：回归方程中x-待测物的浓度(μg/mL)，y-峰面积，r–回归方程的相关系数。
实施例4
将所建立的方法应用于安替比林和吲达帕胺原料药中的苯肼检查。分别精密称定两种药物适量(安替比林50mg,吲达帕胺20mg)，置于10mL量瓶中，加入500μL4-硝基苯甲醛衍生化试液，用乙腈-水(80:20,v/v)定容至刻度，摇匀。25℃反应45min后，取20μL按实施例1中的HPLC-DAD方法直接进样。记录衍生产物的峰面积，以外标法计算苯肼在药物中的含量。结果表明安替比林和吲达帕胺原料药中均未检测出苯肼，但此方法仍然在医药工业中对痕量苯肼的检查有重要的应用价值。
实施例5
根据USP最新讨论稿的要求，对于塞来昔布中的对-磺酰胺基苯肼的检查，使用本发明提出的衍生化方法，用4-硝基苯甲醛作为衍生化试剂与对-磺酰胺基苯肼反应。并对衍生化方法进行了优化。最终选择最佳衍生化条件为：反应体系为乙腈-水(60:40,v/v)，衍生化试剂4-硝基苯甲醛的浓度为2.5mg/mL，60℃下反应90min。方法验证结果表明，该方法专属性良好，方法检出限为0.009μg/mL，定量限为0.03μg/mL，对-磺酰胺基苯肼在0.03～0.40μg/mL的浓度范围内线性关系良好(r＝0.9997)，对照品溶液在4h范围内稳定(RSD＝1.7％)，进样精密度良好(RSD＝2.4％)，准确度高(低、中、高三个加标浓度水平的回收率:94.3～101.9％，RSD:0.5～6.2％)。
实施例6
根据USP最新讨论稿的要求，塞来昔布中的对-磺酰胺基苯肼的限度要求为3.75ppm。本发明建立的方法可以满足限度要求。
塞来昔布供试品溶液制备：取塞来昔布约200mg，精密称定，置于10mL量瓶中，加入500μL4-硝基苯甲醛衍生化试液，用乙腈-水(60:40,v/v)定容至刻度，摇匀；60℃下反应90min，摇匀即得供试品溶液，取20μL进样。记录衍生产物的峰面积，以外标法计算对-磺酰胺基苯肼在药物塞来昔布中的含量。结果表明，塞来昔布原料药中对-磺酰胺基苯肼未检出。
HPLC-DAD条件：Shimadzu LC 20AT液相色谱仪(含在线真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站)；色谱柱采用250mm×4.6mm,5μm的DiamonsilTM C18柱；进样量：20μL；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液(42:58,v/v)，等度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：402nm。
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Claims (10)
1.一种衍生化HPLC-DAD法测定苯肼及其衍生物的方法，其特征在于，包括：
(1)使用苯甲醛类衍生化试剂与苯肼及其衍生物反应，生成在紫外-可见光区330～460nm内有较强吸收的产物；
(2)以步骤(1)反应后的反应液为样品，利用HPLC-DAD法，基于反相分配色谱法原理，在紫外-可见光区330～460nm进行测定，从而实现对苯肼及其衍生物的定性或定量检测。
2.根据权利要求1所述的衍生化HPLC-DAD法测定苯肼及其衍生物的方法，其特征在于，所述苯甲醛类衍生化试剂的结构如下式所示：
式中，R1、R2、R3各自独立的选自氢、硝基、羟基、未被取代或被至少一个甲基取代的氨基；优选，所述的苯甲醛类衍生化试剂选自2-硝基苯甲醛，4-硝基苯甲醛，2,4-二硝基苯甲醛，水杨醛，4-二甲氨基苯甲醛，苯甲醛中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的衍生化HPLC-DAD法测定苯肼及其衍生物的方法，其特征在于，所述苯肼及其衍生物选自苯肼、对-磺酰胺基苯肼、4-肼基苯磺酸、3-肼基苯磺酰胺和3-肼基苯磺酸中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的衍生化HPLC-DAD法测定苯肼及其衍生物的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应以乙腈-水为反应体系，反应体系中乙腈的体积浓度为10％～90％；反应温度为20～90℃；反应时间为0.5～3h；苯甲醛类衍生化试剂在反应体系中的浓度≥0.1mg/mL。
5.根据权利要求1所述的衍生化HPLC-DAD法测定苯肼及其衍生物的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的HPLC-DAD法采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；以非极性键合相为固定相，采用极性流动相，检测波长位于330～460nm之间。
6.权利要求1～5中任一项所述的方法在测定药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的应用。
7.一种衍生化HPLC-DAD法测定药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的方法，其特征在于，包括：
(1)温度20～90℃下，使用苯甲醛类衍生化试剂与药物或合成中间体反应0.5～3h；
(2)以步骤(1)中反应后的反应液为样品，利用HPLC-DAD法，基于反相分配色谱法原理，在紫外-可见光区330～460nm测定其中苯肼及其衍生物的反应产物，从而实现对药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的定性或定量检测。
8.根据权利要求7所述的衍生化HPLC-DAD法测定药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的方法，其特征在于，所述苯甲醛类衍生化试剂的结构如下式所示：
式中，R1、R2、R3各自独立的选自氢、硝基、羟基、未被取代或被至少一个甲基取代的氨基；优选，所述的苯甲醛类衍生化试剂选自2-硝基苯甲醛，4-硝基苯甲醛，2,4-二硝基苯甲醛，水杨醛，4-二甲氨基苯甲醛，苯甲醛中的任意一种。
9.根据权利要求8所述的衍生化HPLC-DAD法测定药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的方法，其特征在于，所述苯肼及其衍生物选自苯肼、对-磺酰胺基苯肼、4-肼基苯磺酸、3-肼基苯磺酰胺和3-肼基苯磺酸中的至少一种。
10.根据权利要求7所述的衍生化HPLC-DAD法测定药物或合成中间体中苯肼及其衍生物的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应以乙腈-水为反应体系，反应体系中乙腈的体积浓度为10％～90％；反应温度为20～90℃，反应时间为0.5～3h；苯甲醛类衍生化试剂在反应体系中的浓度≥0.1mg/mL；步骤(2)中，所述的HPLC-DAD法采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；以非极性键合相为固定相，采用极性流动相，检测波长位于330～460nm之间。
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