CN115266980A - 一种他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法，采用衍生法制备供试品溶液和对照品溶液，再采用高效液相色谱法对其衍生产物进行检测。本发明先通过制备肼的衍生物，再采用高效液相色谱法测定该衍生物，从而实现他唑巴坦钠中水合肼的检查，该方法测定水合肼的成本较低且准确度较高。
Description
技术领域
本发明属于化学物质检测分析技术领域，涉及一种他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法。
背景技术
水合肼是由肼与溶剂中的水分结合而生成，水合肼在药物合成中广泛使用，但其在人体内经代谢能形成高活性甲基中间体，与DNA分子结合，导致基因突变，因此，是一种已知的基因毒性杂质，需对药品中残留的水合肼进行严格控制。
目前对水合肼的检测主要采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)、气相色谱法-串联质谱法(GC-MS)以及气相色谱法(GC)，但是上述方法中采用高效液相色谱-串联质谱法(HPCL-MS)、气相色谱法-串联质谱法(GC-MS)测定水合肼时成本过高，而采用气相色谱法(GC)测定水合肼时准确度过低。
发明内容
本发明的目的是提供一种他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法，先通过制备肼的衍生物，再采用高效液相色谱法测定该衍生物，从而实现他唑巴坦钠中水合肼的检查，该方法测定水合肼的成本较低且准确度较高。
为了完成上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法，采用衍生法制备供试品溶液和对照品溶液，再采用高效液相色谱法对其衍生产物进行检测。
优选地，所述高效液相色谱法的检测条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A：0.05％三氟乙酸溶液；流动相B：乙腈；检测波长406nm；流速1.0ml/min；进样体积20μl；柱温30℃；洗脱方式：线性梯度洗脱。
优选地，所述洗脱梯度的程序为：
0min，流动相A的体积分数为50％，流动相B的体积分数为50％；
5min，流动相A的体积分数为10％，流动相B的体积分数为90％；
20min，流动相A的体积分数为10％，流动相B的体积分数为90％；
21min，流动相A的体积分数为50％，流动相B的体积分数为50％。
优选地，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的型号为：COSMOSIL5C18-MS-II，规格为4.6mm×250mm。
优选地，包括以下检测步骤：
S1:称取2-羟基-1-萘甲醛100mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，接着再精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到2-羟基-1-萘甲醛储备液；
S2:精密量取2-羟基-1-萘甲醛储备液2.5ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到2-羟基-1-萘甲醛溶液；
S3：称取水合肼适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含0.1mg的水合肼溶液；
S4：精密量取水合肼溶液0.2ml和2-羟基-1-萘甲醛储备液1.0ml，置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，接着再精密量取2.0ml，置西林瓶中密封，水浴加热，放冷，即得对照品溶液；
S5：称取唑巴坦钠100mg，置顶空瓶中，精密加入2ml的2-羟基-1-萘甲醛溶液，密封后，超声使溶解，水浴加热后放冷，滤过，即得供试品溶液；
S6：精密量取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪中，测定，即得。
优选地，所述步骤S4和步骤S5中，水浴加热的温度为100℃，时间为60min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的一种他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法，通过制备供试品和对照品溶液，促使供试品和对照品中的水合肼完全衍生生成衍生物，再以所述色谱条件进行检查，通过洗脱程序，从而促使供试品中水合肼衍生物峰与其他杂质化合物峰完全分离，可以完美的解决其他杂质峰对衍生物峰检测的干扰，在本方法条件下供试品中衍生物的分离度，峰形，重复性，准确度都能满足要求，实用性较强，且该方法克服了水合肼无法直接通过高效液相色谱法进行测定，检验成本较低，准确度较高。
附图说明
图1为本发明限度检测中空白溶剂的色谱图；
图2为本发明限度检测中对照品溶液的色谱图；
图3为本发明限度检测中供试品溶液的色谱图；
图4为本发明限度检测中系统适用性溶液的色谱图；
图5为本发明水合肼和2-羟基-1-萘甲醛的衍生反应；
图6为本发明干扰试验中空白溶剂的色谱图；
图7为本发明干扰试验中2-羟基-1-萘甲醛储备溶液的色谱图；
图8为本发明干扰试验中2-羟基-1-萘甲醛溶液的色谱图；
图9为本发明干扰试验中对照品溶液的色谱图；
图10为本发明干扰试验中供试品溶液的色谱图；
图11为本发明线性试验关系图；
图12为他唑巴坦钠(批号：C211003-1)的色谱图；
图13为他唑巴坦钠(批号：C211004-1)的色谱图；
图14为他唑巴坦钠(批号：C211005-1)的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：
本发明提供了一种他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法，采用衍生法制备供试品溶液和对照品溶液，采用高效液相色谱法进行检测；
1.仪器和设备：高效液相色谱仪(LC-2030)，色谱柱型号为COSMOSIL 5C18-MS-II，规格为4.6mm×250mm，万分之一电子天平(T-114)，十万分之一电子天平(AUW220D)，pH计(PB-10)。
2.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为0.05％三氟乙酸溶液；流动相B为乙腈；检测波长406nm；流速1.0ml/min；进样体积20μl；柱温30℃；洗脱方式为线性梯度洗脱，其中，该洗脱梯度的程序见下表1：
表1：线性梯度洗脱程序
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 50 | 0 |
| 5 | 10 | 90 |
| 20 | 10 | 90 |
| 21 | 50 | 50 |
3.包括以下检测步骤：
(1)2-羟基-1-萘甲醛储备液的制备:称取2-羟基-1-萘甲醛(批号：K2102118，纯度为99.00％)100mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，接着再精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置；
(2)2-羟基-1-萘甲醛溶液的制备:精密量取2-羟基-1-萘甲醛储备液2.5ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置；
(3)水合肼溶液的制备：称取水合肼(批号：F2118325，纯度为98.84％)适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含0.1mg的水合肼溶液；
(4)对照品溶液的制备：精密量取0.2ml水合肼溶液(0.1mg/ml)和1.0ml的2-羟基-1-萘甲醛储备液(1mg/ml)，置20ml量瓶中，加甲醇(或二甲基亚砜)稀释至刻度，摇匀，接着再精密量取2.0ml，置西林瓶中密封，密封后在100℃水浴放置60分钟，放冷，即得；
(5)供试品溶液的制备：称取唑巴坦钠约100mg，置顶空瓶中，精密加入2ml的2-羟基-1-萘甲醛溶液(0.05mg/ml)，密封后，超声使溶解，在100℃水浴放置60分钟，放冷，滤过，即得。
(6)测定：精密量取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图。
验证试验
1.溶液的配制
1.1、空白溶剂：甲醇(或二甲基亚砜)。
1.2、2-羟基-1-萘甲醛储备溶液：称取2-羟基-1-萘甲醛约100mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
1.3、2-羟基-1-萘甲醛溶液：精密量取2-羟基-1-萘甲醛储备溶液2.5ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取2.0ml，置西林瓶中，密封后，100℃水浴放置60分钟，放冷，即得。
1.4、对照品溶液：称取水合肼约10mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到水合肼溶液，精密量取0.2ml水合肼溶液和2-羟基-1-萘甲醛储备液1.0ml，置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取2.0ml，置西林瓶中，密封后，100℃水浴放置60分钟，放冷，即得。
1.5、供试品溶液：称取他唑巴坦钠约100mg，置顶空瓶中，精密加入2ml的2-羟基-1-萘甲醛溶液，密封后，超声使溶解，100℃水浴放置60分钟，放冷，滤过，即得。
1.6、系统适用性溶液：称取他唑巴坦钠约100mg，置顶空瓶中，精密加入2ml的2-羟基-1-萘甲醛溶液，溶解后加入2ml水合肼溶液，密封后，超声使溶解，100℃水浴放置60分钟，放冷，滤过，即得。
2.限度检测
精密量取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液以及系统适用性溶液各20μl，分别注入色谱仪中，按照上述色谱条件进行分析，并记录色谱图，结果见图1-图4。
3.衍生时间的考察
分别按照“1.4”配制对照品溶液5份，依次于100℃水浴下放置30分钟、60分钟、90分钟、120分钟后进样测定，记录色谱图。衍生反应见图5，试验结果见下表2：
表2：衍生时间的考察试验结果
| 衍生时间(min) | 峰面积 |
| 30 | 53993 |
| 60 | 143262 |
| 90 | 145518 |
| 120 | 148138 |
结论：由试验结果可知，对照品溶液在100℃水浴60分钟，肼与2-羟基-1-萘甲醛完全衍生化。
4.干扰试验
主要考察空白溶剂、主成分(他唑巴坦)及其它杂质对水合肼测定的干扰情况。
按照“1”配制的溶液对应精密量取上述空白溶剂、2-羟基-1-萘甲醛储备溶液、2-羟基-1-萘甲醛溶液、对照品溶液、供试品溶液各20μl，分别进样测定，记录色谱图，考察空白溶剂、主成分(他唑巴坦)及其它杂质对水合肼测定的干扰情况。干扰试验的色谱图结果见图6-图10：
试验结果：空白溶剂、主成分(他唑巴坦)及其它杂质对水合肼测定无干扰。
结论：符合验证要求。
5.线性与范围
配制对照品的系列浓度溶液，分别精密量取20μl注入液相色谱仪检测，记录色谱图。以测得的峰面积对被测物的浓度作图，用最小二乘法进行线性回归。评估被测物峰面积与浓度直接呈比例关系的程度。可接受标准：相关系数r≥0.990，y轴截距与100％响应值的比值≤25％。线性试验关系见图11。
线性试验结果见下表3：
表3：线性试验结果
需要说明的是：水合肼拟定的限度为≤19ppm，“100％响应值”指相当于供试品溶液中他唑巴坦浓度(50mg/ml)的百分比为0.0019％时对应的y值。
结论：线性方程的相关系数r为0.9999，＞0.990，y轴截距与100％响应值的比值为0.2％，≤25％，符合验证要求。
6.检测限、定量限
采用信噪比法来确定检测限(LOD)和定量限(LOQ)。
将已知浓度的混合对照品溶液逐步稀释后进样，将测出的峰信号与基线噪声进行比较，以信噪比约为3:1(或2:1)时相应浓度确定为检测限，以信噪比约为10:1时相应浓度确定为定量限。
试验结果见下表4：
表4：检测限和定量限结果
7.仪器进样精密度
取对照品溶液稳项下对照品溶液重复进样5次的结果进行评价，可接受标准：RSD≤2.0％，试验结果见下表5：
表5：进样精密度试验结果
结论：对照品溶液重复进样5次峰面积的RSD为0.7％，小于2.0％，符合验证要求。
8.重复性试验
重复测定6份供试品，计算杂质含量的相对标准偏差(RSD)，以验证方法的精密度，可接受标准：
报告限度≤X＜0.1％：RSD≤30％；
0.1％≤X＜0.5％：RSD≤20％；
0.5％≤X＜1％：RSD≤10％；
1％≤X＜5％：RSD≤5％；
X≥5％：RSD≤2.5％。(X：杂质含量)
试验结果见下表6：
表6：重复性试验结果
结论：重复测定6份供试品溶液，水合肼含量均未检出，符合验证要求。
9.溶液稳定性试验
溶液稳定性试验用于验证对照品溶液随时间变化的规律，为以后检测时溶液的放置提供依据。
将对照品溶液于15℃条件下放置，每间隔一定时间后进样检测，记录色谱图，计算溶液含量的变化值。可接受标准：储存期间变化值≤5％。
试验结果见下表7：
表7：溶液稳定性结果
| 放置时间 | 峰面积 | 相对含量 | 变化值 |
| 0h | 119778 | 100.0％ | 0.0％ |
| 1h | 119631 | 99.9％ | 0.1％ |
| 2h | 119395 | 99.7％ | 0.3％ |
| 3h | 119333 | 99.6％ | 0.4％ |
| 4h | 119563 | 99.8％ | 0.2％ |
| 5h | 119444 | 99.8％ | 0.2％ |
| 6h | 119564 | 100.1％ | 0.1％ |
| 7h | 119642 | 100.3％ | 0.3％ |
| 8h | 119487 | 99.9％ | 0.1％ |
结论：对照品溶液在15℃放置8小时，变化值均小于5％，符合验证要求。
10.准确度
通过向供试品中加入已知量的对照品，测定杂质回收率来验证方法的准确度。用同一浓度6份供试品的测定结果进行评价。
可接受标准：X＜0.5％：
回收率80％-120％，RSD≤10％；
0.5％≤X≤5％：回收率90％-110％，RSD≤5％；
X＞5％：回收率95％-105％，RSD≤2.5％(X为杂质含量)。
试验结果见下表8：
表8：回收率试验结果
结论：在相当于供试品溶液浓度的百分比为0.0019％，水合肼的回收率为108％，RSD为3.3％，符合验证要求。
11.样品检查
取3批他唑巴坦钠(批号：C211003-1,C211004-1,C211005-1)配制供试品溶液进行检测，样品检查的色谱图见图12-14，检测结果见下表10：
表10：水合肼检查结果
结论：重复测定3份供试品溶液，水合肼含量均未检出，符合验证要求。
综上，本发明提供的一种他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法，首先制备待测样品和对照品溶液，促使待测样品和对照品中的水合肼完全衍生生成衍生物。再以所述色谱条件进行检查。通过洗脱程序，从而促使待测样品中水合肼衍生物峰与其他杂质化合物峰完全分离，可以完美的解决其他杂质峰对衍生物峰检测的干扰。在本方法条件下供试品中衍生物的分离度，峰形，重复性，准确度都能满足要求，实用性强，且本发明检验成本较低，准确度较高。
虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属于本发明所保护的范围。
Claims (6)
1.一种他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法，其特征在于，采用衍生法制备供试品溶液和对照品溶液，再采用高效液相色谱法对其衍生产物进行检测。
2.根据权利要求1所述的他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的检测条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相A：0.05%三氟乙酸溶液；
流动相B：乙腈；
检测波长406nm；
流速1.0ml/min；
进样体积20μl；
柱温30℃；
洗脱方式：线性梯度洗脱。
3.根据权利要求2所述的他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法，其特征在于，所述洗脱梯度的程序为：
0min，流动相A的体积分数为50%，流动相B的体积分数为50%；
5min，流动相A的体积分数为10%，流动相B的体积分数为90%；
20min，流动相A的体积分数为10%，流动相B的体积分数为90%；
21min，流动相A的体积分数为50%，流动相B的体积分数为50%。
4.根据权利要求2所述的他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的型号为：COSMOSIL 5C18-MS-II，规格为4.6mm×250mm。
5.根据权利要求2所述的他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法，其特征在于，包括以下检测步骤：
S1:称取2-羟基-1-萘甲醛100mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，接着再精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到2-羟基-1-萘甲醛储备液；
S2:精密量取2-羟基-1-萘甲醛储备液2.5ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到2-羟基-1-萘甲醛溶液；
S3：称取水合肼适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含0.1mg的水合肼溶液；
S4：精密量取水合肼溶液0.2ml和2-羟基-1-萘甲醛储备液1.0ml，置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，接着再精密量取2.0ml，置西林瓶中密封，水浴加热，放冷，即得对照品溶液；
S5：称取唑巴坦钠100mg，置顶空瓶中，精密加入2ml的2-羟基-1-萘甲醛溶液，密封后，超声使溶解，水浴加热后放冷，滤过，即得供试品溶液；
S6：精密量取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪中，测定，即得。
6.根据权利要求5所述的他唑巴坦钠中水合肼杂质的检测方法，其特征在于，所述步骤S4和步骤S5中，水浴加热的温度为100℃，时间为60min。
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