CN113804781A - 丹曲林钠中水合肼的检测分析方法 - Google Patents

Abstract

一种丹曲林钠中水合肼的检测分析方法，其包括如下步骤：(1)将衍生试剂用稀释剂溶解并稀释，得到衍生试剂溶液；(2)将水合肼用溶剂溶解并稀释，得到对照品储备溶液；然后将对照品储备溶液与衍生试剂溶液混合并经超声处理后，得到对照品溶液；(3)将丹曲林钠用溶剂溶解并稀释后得到丹曲林钠溶液，然后将丹曲林钠溶液与衍生试剂溶液混合，将混合后的混合液经超声处理，得到供试品溶液；(4)分别量取对照品溶液和供试品溶液并注入液相色谱‑质谱仪；液相色谱‑质谱仪的色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，以0.1％甲酸溶液‑甲醇为流动相；(5)按外标法以峰面积计算丹曲林钠中水合肼的浓度。本发明的方法灵敏度高、环境友好并且操作简单。

Description

丹曲林钠中水合肼的检测分析方法

技术领域

本发明属于分析检测领域。具体地，本发明涉及一种丹曲林钠中水合肼的检测分析方法。

背景技术

丹曲林钠，化学名1-[[[5-(4-硝基苯基)-2-呋喃基]亚甲基]氨基]-2,4-咪唑烷二酮钠盐三倍半水合物，分子量399.29，分子式C₁₄H₉N₄NaO₅·31/2H₂O，结构式如下：

丹曲林钠是一种肌肉松弛剂，对骨骼肌作用尤为显著，可干扰钙离子从肌浆网中释放，从而防止肌浆内钙离子的增多及肌肉细胞的代谢，进而缓解高热的相关症状。

水合肼是丹曲林钠某起始物料的合成工艺中使用的原料，可能会由该起始物料引入丹曲林钠的合成中，并残留在终产品中。

在ICH M7中，已明确指出肼在体外和体内都具有致突变、基因毒性及致癌性，这类物质过量摄入可能对人体造成危害，需要进行严格控制。丹曲林钠制剂为冻干粉针剂，其AI值为0.2μg/day，允许的杂质限度很低，因此需要建立高灵敏度的分析方法对本品中的水合肼进行监控。

现今常用的检测水合肼的方法有分光光度法(参见邢书才等人，分光光度法测定水合肼分析方法的优化性研究[J].应用化工,2019,48(10):2521-2524)、气相色谱分析法(胡平等人，糠醛衍生化-气相色谱(NPD)法测定水中水合肼[J].EARTH AND ENVIRONMENT，2017:242-246；以及张广仁等人，丙酮-冰醋酸在线衍生化-顶空气相色谱法测定氯唑沙宗中水合肼含量[J].食品与药品，2020，22(3):216-218)、流动注射化学发光分析、荧光分析等。

分光光度法测定水中水合肼，对于检测药物而言其专属性、灵敏度不高，检测限最小为1.1μg/ml。

气相色谱由于水合肼是强碱性化合物，对于柱子的选择有较高的要求。此外，气相色谱法需要采用标准曲线，非常麻烦。张广仁等人(丙酮-冰醋酸在线衍生化-顶空气相色谱法测定氯唑沙宗中水合肼含量[J].食品与药品，2020，22(3):216-218)用丙酮-冰醋酸作为衍生化试剂，丙酮极度易燃且易挥发，对人的身体危害较大。丙酮属易制毒管控试剂。该气相色谱法检测限为0.169μg/ml，灵敏度较低。胡平等人(糠醛衍生化-气相色谱(NPD)法测定水中水合肼[J].EARTH AND ENVIRONMENT，2017:242-246)用糠醛作为衍生化试剂，糠醛属于致突变和致癌物，应尽量避免在实验中大量使用。该实验样品配制复杂且还使用了多种试剂，比如乙酸乙酯、硫酸等，对环境不利。

梅芊等人发表的文章“柱前衍生化UHPLC-Q-Orbitrap HRMS法测定乙酰唑胺及其胶囊剂中肼的含量”公开了一种测定乙酰唑胺及其胶囊剂中肼的含量的方法。该方法采用苯甲醛作为衍生试剂。该方法的缺点在于稳定性差(小于10h)，并且检测时间较长。稳定性是非常重要的参数。稳定性时间长有利于在时间相隔较长时进行复检。稳定性属于耐用性的范围。耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明，并注明可以接受变动的范围。可以先采用均匀设计确定主要影响因素，再通过单因素分析等确定变动范围。典型的变动因素有被测溶液的稳定性、样品的提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有流动相的组成和pH值、不同品牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。气相色谱法变动因素有不同品牌或批号的色谱柱、不同类型的担体、载气流速、柱温、进样口和检测器温度等。经试验，测定条件小的变动应能满足系统适用性试验要求，以确保方法的可靠性。

目前急需一种高灵敏度、高稳定性、环境友好以及操作简单的能够分析检测丹曲林钠中水合肼的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高灵敏度、高稳定性、环境友好以及操作简单的能够分析检测丹曲林钠中水合肼的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的。

本发明提供一种丹曲林钠中水合肼的检测分析方法，其包括如下步骤：

(1)衍生试剂溶液的制备

将衍生试剂用稀释剂溶解并稀释，得到衍生试剂溶液；

(2)对照品溶液的制备

将水合肼用溶剂溶解并稀释，得到对照品储备溶液；然后将所述对照品储备溶液与所述衍生试剂溶液混合，并经超声处理后，得到对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备

将丹曲林钠用溶剂溶解并稀释后得到丹曲林钠溶液，然后将所述丹曲林钠溶液与所述衍生试剂溶液混合，将混合后的混合液经超声处理，得到供试品溶液；

(4)进样检测

分别精密量取所述对照品溶液和供试品溶液并注入液相色谱-质谱仪；其中，所述液相色谱-质谱仪的色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，以0.1％甲酸溶液-甲醇为流动相；

(5)计算

记录进样后的液相色谱-质谱仪的色谱图，然后按外标法以峰面积计算丹曲林钠中水合肼的浓度。

优选地，在本发明所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法中，所述衍生试剂为对二甲氨基苯甲醛。

优选地，在本发明所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法中，所述稀释剂为乙酸-甲醇。

在本发明的具体实施方案中，本发明的衍生试剂采用对二甲氨基苯甲醛。本申请的发明人对比了几种衍生试剂发现以下结果。

表A

优选地，在本发明所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法中，所述液相色谱-质谱仪的色谱柱的流速为0.45-0.55ml/min，优选0.50ml/min。

优选地，在本发明所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法，其中，所述流动相中的0.1％甲酸溶液-甲醇的体积比为27:73-33:67，优选30:70。

优选地，在本发明所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法中，所述步骤(2)中的对照品储备溶液与衍生试剂溶液的体积比为3:1；所述步骤(3)中的丹曲林钠溶液与衍生试剂溶液的体积比为3:1；并且所述衍生试剂溶液的浓度为0.02g/ml，所述对照品储备溶液的浓度为0.5ng/ml。

优选地，在本发明所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法中，所述步骤(2)和所述步骤(3)中的超声处理进行15-25min，优选20min。

优选地，在本发明所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法中，所述液相色谱-质谱仪的色谱柱的规格为ACQUITY UPLC HSS C18，2.1mm×30mm×1.8μm；ACE Super C18，2.1mm×50mm×2.0μm；或XSelect HSS C18，2.1mm×100mm×2.5μm。

优选地，在本发明所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法中，所述步骤(4)中的分别精密量取所述对照品溶液和供试品溶液并注入液相色谱-质谱仪时，量取的量为2μl。

本发明具有如下有益效果：

本发明的方法灵敏度高(高达0.015ng/ml)，优于现有的气相色谱法的灵敏度(约0.02μg/ml)。本发明的方法采用的衍生化试剂为对二甲氨基苯甲醛，而非对人及环境有害的糠醛、丙酮等。本发明的方法操作简单，而现有气相色谱法需历经涡旋、振荡、超声、放置过夜、离心、过滤等一系列步骤。此外，本发明的定量方式采用外标法，而现有的气相色谱法采用的是标准曲线法。

此外，丹曲林钠中水合肼可接受限度较低，需用高灵敏度的方法。采用本发明的液相-质谱联用方法有效地克服了分光光度法等的不足之处。肼在高温下易分解成N₂、NH₃、H₂，而液质离子源温度基本在200℃以上，因此，水合肼很容易被分解。本发明的方法采用衍生化试剂引入特定的基团，从而提高了检测灵敏度。在本发明的方法中，肼与对二甲氨基苯甲醛发生反应，可以生成对二甲氨基卞连氮。

另外，本发明的方法单次分析的时间仅需3分钟，用时短，节省时间。本发明的检测方法稳定性高(高达18h)。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是本发明实施例1的液相色谱-质谱仪图谱；

图2是本发明对比例1的气相色谱图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1

衍生试剂溶液：

精密称取对二甲氨基苯甲醛约1g，置50ml量瓶，用稀释剂(乙酸-甲醇＝10:90，体积比)溶解并稀释至刻度，转移至棕色玻璃瓶中，加盖密封。

空白溶液：

精密量取衍生试剂溶液0.3ml和甲醇0.9ml，置2ml进样小瓶中，加盖密封，超声20分钟。

对照品溶液：

取水合肼对照品约10mg，置10ml量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀(浓度为1mg/ml)；精密量取1ml，置100ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀(浓度为10μg/ml)；精密量取1ml，置100ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀(浓度为100ng/ml)；精密量取1ml，置200ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀(浓度为0.5ng/ml)，转移至棕色玻璃瓶中，加盖密封，作为对照品储备溶液；精密量取衍生试剂溶液0.3ml和对照品储备溶液0.9ml，置2ml进样小瓶，加盖密封，超声20分钟，制成每1ml约含水合肼0.375ng的对照品溶液。

供试品溶液：

取待测的丹曲林钠约50mg，精密称定，置50ml量瓶，用甲醇稀释至刻度；精密量取0.9ml，置2ml进样小瓶，同时加入衍生试剂溶液0.3ml，加盖密封，超声20分钟，用0.45μm的有机滤膜过滤，作为供试品溶液。

液相色谱-质谱仪条件：

以十八烷基键合硅胶为填充剂(ACQUITY UPLC HSS C18，2.1mm×30mm，1.8μm)；以0.1％甲酸溶液-甲醇(30:70，体积比)为流动相；流速为每分钟0.5ml。以三重四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式。监测模式为多反应监测(MRM)，离子源温度为350℃，离子化电压为5000V，监测离子对(M/Z)为295.2/147.1和295.2/120.1，碰撞电压分别为30V和40V。精密量取对照品溶液和供试品溶液各2μl，分别注入液相色谱-质谱仪，记录色谱图至3分钟，按外标法以峰面积计算。

图1是本发明实施例1的液相色谱-质谱仪图谱。图1示出了本发明的检测方法灵敏度优异。

对比例1

现有的气相色谱法：

(1)标准曲线溶液：精密称取水合肼标准品(肼的分子量占比按64.003％计算)约79mg，置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。精密量取1ml置10ml量瓶中，用丙酮稀释至刻度，得到每1ml约含肼100μg的标准曲线储备液1。精密量取0.1ml置10ml量瓶中，用丙酮稀释至刻度，得到每1ml约含肼10μg的标准曲线储备液2。分别吸取125μl、250μl的10μg/ml标准曲线储备液2，125μl、250μl、500μl的100μg/ml标准曲线储备液1，分别置50ml离心管中，加20ml丙酮超声15min，转移到25ml量瓶中，用丙酮4ml润洗离心管2次，合并润洗液到容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，得到浓度(以肼计)为0.05、0.1、0.5、1.0、2.0μg/ml的肼衍生物标准曲线。

(2)供试品溶液：精密称取本品约100mg置50ml离心管，加丙酮约20ml，涡旋振荡30s，超声15分钟，静置过夜，待样品澄清后，将样品过滤，用丙酮4ml润洗离心管2次，合并滤液到25ml量瓶中，用丙酮稀释至刻度。过0.22μm滤膜。

(3)色谱条件：以(14％-氰丙基-苯基)甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱为色谱柱(DB-1701，30m×0.32mm×0.25μm，或效能相当的色谱柱)；起始温度为50℃，保持1分钟，以每分钟10℃的速率升温至75℃，再以每分钟5℃的速率升温至80℃，最后以每分钟35℃的速率升温至180℃；进样口温度为200℃；载气为氦气，流速为每分钟1.5ml，不分流；采用SCAN&SIM模式进行定量检测，SCAN扫描范围为30-200，SIM定量离子(m/z)为97、42、56、70和112；离子源温度280℃，接口温度280℃，溶剂延迟时间1.8min。精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μl，分别注入气相色谱-质谱仪，记录色谱图，按外标曲线法以峰面积计算。

图2是对比例1的气相色谱图谱。从图2和图1可以看出，现有技术中的气相色谱法没有本发明的液相色谱-质谱仪的灵敏度高。

本发明的实施例1和对比例1的对比性实验数据见表1。

表1

方法	保留时间(min)	峰面积	信噪比	灵敏度
					实施例1	0.728	623	8.4	0.015ng/ml
对比例1	3.793	788	7.03	0.02μg/ml

从表1可以看出，本发明的检测分析方法的灵敏度更优，可高达0.015ng/ml，远超过现有技术的灵敏度0.02μg/ml。

实施例2

表2中的对照品溶液按照本申请的实施例1中的方法配制。表2中的加标供试品溶液配制方法如下：

加标供试品溶液配制：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶，加入本申请对照品储备溶液溶解并稀释至刻度；精密量取0.9ml，置2ml进样小瓶，同时加入衍生试剂溶液0.3ml，加盖密封，超声20分钟，用0.45μm的有机滤膜过滤，作为供试品溶液。色谱条件均与实施例1的相同。

表2测试结果

从表2中可以看出，对照品溶液1是一份对照品溶液平行进样6次。在该色谱条件下仪器的系统稳定性RSD值为1.3％，并且在10.0％范围内，能够证明系统稳定。

对照品溶液2是按照相同的方法配制的另一份对照品溶液，并且平行进样2次。本发明在该色谱条件下对照品回收率在85％～115％范围内，能够证明对照品溶液配制准确。

加标供试品溶液1、2，是每份加标供试品溶液平行进样2次。本发明在该色谱条件下加标供试品回收率在70％～135％范围内，证明对目标物水合肼检测准确。

实施例3

所有实验条件均与实施例1相同，除了改变流动相的组成。具体地，测试流动相(0.1％甲酸溶液-甲醇)在正常体积比(0.1％甲酸溶液:甲醇＝30:70)的上下浮动3％时的结果。测试结果见表3。

表3.测试结果

对照品溶液1是一份对照品溶液平行进样6次。在该色谱条件下仪器的系统稳定性RSD值在10.0％范围内，能够证明系统稳定。

对照品溶液2是按照相同的方法配制的另一份对照品溶液，平行进样2次。本发明在该色谱条件下对照品回收率在85％～115％范围内，证明对照品配制准确。

加标供试品溶液1、2，是每份加标供试品溶液平行进样2次，本发明在该色谱条件下加标供试品回收率在70％～135％范围内，证明对目标物水合肼检测准确。

由此可见，本发明的检测分析方法耐用性良好。流动相0.1％甲酸溶液-甲醇比例在27:73-33:67范围内均可适用。

实施例4

所有实验条件均与实施例1相同，除了改变流速。具体地，测试流速在正常流速(0.5ml/min)的上下浮动0.05ml/min时的结果。测试结果见表4。

表4.测试结果

对照品溶液1是一份对照品溶液平行进样6次。在该色谱条件下仪器的系统稳定性RSD值在10.0％范围内，能够证明系统稳定。

对照品溶液2是按照相同的方法配制的另一份对照品溶液，平行进样2次。本发明在该色谱条件下对照品回收率在85％～115％范围内，能够证明对照品配制准确。

加标供试品溶液1、2，是每份加标供试品溶液平行进样2次。本发明在该色谱条件下加标供试品回收率在70％～135％范围内，能够证明对目标物水合肼检测准确。

由此可见，本发明的检测分析方法耐用性良好。流速在0.45ml/min-0.55ml/min范围内均可适用。

实施例5

所有实验条件均与实施例1相同，除了改变流动相。测试结果见表5。

表5.测试结果

流动相	峰情况
		水：甲醇(30:70)	峰响应低，峰型差
0.1％甲酸-水:甲醇(30:70)	峰响应提高，峰型良好

从表5中可以看出，使用本发明的流动相，即0.1％甲酸-水:甲醇，峰响应提高，峰型良好。

实施例6

所有实验条件均与实施例1相同，除了改变对照品储备溶液与衍生试剂溶液的比例。筛选0.5ng/ml的对照品储备溶液与0.02g/ml的衍生试剂溶液(v:v)的比例，即水合肼与对二甲氨基苯甲醛的质量比例。

测试结果见表6。

表6.测试结果

从表6中可以看出，0.5ng/ml的对照品储备溶液与0.02g/ml的衍生试剂的体积比为3:1时，响应最高。为保持一致，供试品溶液配制中的丹曲林钠溶液与0.02g/ml的衍生试剂的体积比也为3:1。

实施例7

所有实验条件均与实施例1相同，除了改变供试品溶液制备过程中的超声时间。测试结果见表7。

表7.测试结果

时间(min)	峰面积
		5	5280
10	9580
		15	11790
20	12500
		25	11980

从表7可以看出，超声时间为15min、20min、25min时响应差异不大。但是最佳的超声时间为20min。

实施例8

稳定性验证

在不进行特别说明的情况下，本实施例的实验参数与实施例1相同。

稳定性溶液配制：取待测的丹曲林钠约10mg，精密称定后置于10ml量瓶，加入本申请对照品储备溶液溶解并稀释至刻度；精密量取0.9ml，置2ml进样小瓶，同时加入衍生试剂溶液0.3ml，加盖密封，超声20分钟，用0.45μm的有机滤膜过滤，作为稳定性溶液。

操作：分别于配制完0h，1h，2h，4h，7h，12h，18h进行进样检测并计算回收率。测试结果见表8。

表8.测试结果

稳定性时间点	回收率％
		0h	101.2
1h	96.6
		2h	102.6
4h	99.3
		7h	100.9
12h	105.5
		18h	97.2

表8示出，溶液在18h以内，回收率在96.6％～105.5％之间，其在70％～135％之间要求的范围内，故证明在18h以内溶液稳定性良好。

Claims (8)

1.一种丹曲林钠中水合肼的检测分析方法，其包括如下步骤：

(1)衍生试剂溶液的制备

将衍生试剂用稀释剂溶解并稀释，得到衍生试剂溶液；

(2)对照品溶液的制备

将水合肼用溶剂溶解并稀释，得到对照品储备溶液；然后将所述对照品储备溶液与所述衍生试剂溶液混合，并经超声处理后，得到对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备

将丹曲林钠用溶剂溶解并稀释后得到丹曲林钠溶液，然后将所述丹曲林钠溶液与所述衍生试剂溶液混合，将混合后的混合液经超声处理，得到供试品溶液；

(4)进样检测

分别精密量取所述对照品溶液和供试品溶液并注入液相色谱-质谱仪；其中，所述液相色谱-质谱仪的色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，以0.1％甲酸溶液-甲醇为流动相；

(5)计算

记录进样后的液相色谱-质谱仪的色谱图，然后按外标法以峰面积计算丹曲林钠中水合肼的浓度；

其中，所述衍生试剂为对二甲氨基苯甲醛。

2.根据权利要求1所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法，其中，所述稀释剂为乙酸-甲醇。

3.根据权利要求1所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法，其中，所述液相色谱-质谱仪的色谱柱的流速为0.45-0.55ml/min，优选0.50ml/min。

4.根据权利要求1所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法，其中，所述流动相中的0.1％甲酸溶液-甲醇的体积比为27:73-33:67，优选30:70。

5.根据权利要求1所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法，其中，所述步骤(2)中的对照品储备溶液与衍生试剂溶液的体积比为3:1；所述步骤(3)中的丹曲林钠溶液与衍生试剂溶液的体积比为3:1；并且所述衍生试剂溶液的浓度为0.02g/ml，所述对照品储备溶液的浓度为0.5ng/ml。

6.根据权利要求1所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法，其中，所述步骤(2)和所述步骤(3)中的超声处理进行15-25min，优选20min。

7.根据权利要求1所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法，其中，所述液相色谱-质谱仪的色谱柱的规格为ACQUITY UPLC HSS C18，2.1mm×30mm×1.8μm；ACE Super C18，2.1mm×50mm×2.0μm；或XSelect HSS C18，2.1mm×100mm×2.5μm。

8.根据权利要求1所述的丹曲林钠中水合肼的检测分析方法，其中，所述步骤(4)中的分别精密量取所述对照品溶液和供试品溶液并注入液相色谱-质谱仪时，量取的量为2μl。

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