CN109387579A - 测定乳品中左旋咪唑的方法 - Google Patents

测定乳品中左旋咪唑的方法 Download PDF

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CN109387579A CN201710693398.5A CN201710693398A CN109387579A CN 109387579 A CN109387579 A CN 109387579A CN 201710693398 A CN201710693398 A CN 201710693398A CN 109387579 A CN109387579 A CN 109387579A
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宋晓东
郭波
刘娜
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赵媛
解鑫
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Abstract

本发明提出了检测乳品中左旋咪唑的方法。所述方法包括：将乳品、三氯乙酸溶液与乙腈进行混合处理，以便得到混合液；所述混合液进行固相萃取处理，以便得到洗脱液；以及将所述洗脱液进行色谱检测，并基于检测结果确定所述乳品中左旋咪唑含量。利用本发明的方法能够准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且回收率高、精密度高、灵敏度高、操作简便。

Description

测定乳品中左旋咪唑的方法
技术领域
本发明涉及食品领域。具体地，本发明涉及检测乳品中左旋咪唑的方法。
背景技术
左旋咪唑(levamisole)，化学名称为盐酸左旋咪唑，中文别名为(S)-6-苯基-2,3,5,6-四氢-咪唑[2,1-B]噻唑单盐酸盐、L-2,3,5,6-四氢-6-苯基咪唑[2,1-6]噻唑盐酸盐，分子式为C11H12N2S，相对分子量为204.29，CAS16595-80-5。主要用于治疗畜禽胃肠道线虫和胃线虫等，不合理地使用左旋咪唑会造成动物生产中残留，残留的左旋咪唑对人体的主要潜在危害是致畸和致突变。
然而，目前检测左旋咪唑的方法仍待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了检测乳品中左旋咪唑的方法。利用本发明的方法能够准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且回收率高、精密度高、灵敏度高、操作简便。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
目前，适用于提取乳品中左旋咪唑的溶剂较多，针对不同溶剂，所起到的效果不尽相同。有些溶剂在提取左旋咪唑的同时，会使样品乳化，无法充分提取包埋在蛋白质和脂肪中的左旋咪唑，使得检测结果偏低，例如乙酸乙酯。另外，有些溶剂在提取左旋咪唑的同时，夹带少量蛋白质、脂肪等杂质，对后续结果产生干扰且不利于色谱柱的长期使用，例如丙酮。
有鉴于此，发明人经过大量实验发现，采用乙腈作为提取剂，不仅能够提取出乳品中的左旋咪唑，还可以使得乳品中蛋白质的构象发生改变，使之沉淀聚集，避免了乳品中的蛋白质对结果的干扰。进一步地，发明人发现，由于乳品中蛋白质含量较高，若仅采用乙腈作为提取剂，无法完全沉淀蛋白，仍有少量蛋白存留在提取的上清液中，对后续检测造成干扰，使得检测结果准确性较低。发明人经过深入研究发现，将乙腈与三氯乙酸结合使用，三氯乙酸能够进一步沉淀蛋白，且为后续萃取提供酸性条件，无需额外添加酸性物质，使得操作简便，效率高。由此，利用根据本发明实施例的检测乳品中左旋咪唑的方法能够准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且回收率高、精密度高、灵敏度高、操作简便。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种测定乳品中左旋咪唑的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述乳品、三氯乙酸溶液与乙腈进行混合处理，以便得到混合液；将所述混合液进行固相萃取处理，以便得到洗脱液；以及将所述洗脱液进行色谱检测。
发明人发现，采用乙腈作为提取剂，不仅能够提取出乳品中的左旋咪唑，还可以使得乳品中蛋白质的构象发生改变，使之沉淀聚集，避免了乳品中的蛋白质对结果的干扰。进一步地，发明人发现，由于乳品中蛋白质含量较高，若仅采用乙腈作为提取剂，无法完全沉淀蛋白，仍有少量蛋白存留在提取的上清液中，对后续检测造成干扰，使得检测结果准确性较低。发明人经过深入研究发现，将乙腈与三氯乙酸结合使用，三氯乙酸能够进一步沉淀蛋白，且为后续萃取提供酸性条件，无需额外添加酸性物质，使得操作简便，效率高。由此，利用根据本发明实施例的检测乳品中左旋咪唑的方法能够准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且回收率高、精密度高、灵敏度高、操作简便。
根据本发明的实施例，上述检测乳品中左旋咪唑的方法还可以进一步具有下列附加的技术特征：
根据本发明的实施例，基于1克所述乳品，所述三氯乙酸溶液的体积为8～10毫升乙腈为1～3毫升。由此，利用根据本发明实施例的检测乳品中左旋咪唑的方法能够进一步准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且回收率高、精密度高、灵敏度高、操作简便。
根据本发明的实施例，所述三氯乙酸溶液的浓度为0.1体积％。由此，利用根据本发明实施例的检测乳品中左旋咪唑的方法能够进一步准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且回收率高、精密度高、灵敏度高、操作简便。
根据本发明的实施例，所述混合处理包括：将所述乳品与三氯乙酸溶液进行第一混合处理，以便得到第一混合液；将所述第一混合液与乙腈进行第二混合处理，以便得到第二混合液；将所述第二混合液依次进行超声及震荡处理，以便得到所述混合液。由此，利用根据本发明实施例的检测乳品中左旋咪唑的方法能够进一步准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且回收率高、精密度高、灵敏度高、操作简便。
根据本发明的实施例，所述离心处理是在10000rpm的转速下进行10分钟。由此，利用根据本发明实施例的检测乳品中左旋咪唑的方法能够进一步准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且回收率高、精密度高、灵敏度高、操作简便。
根据本发明的实施例，在进行所述固相萃取处理之前，进一步包括：将所述混合液进行离心处理，收集上清液；以及将所述上清液进行第一过滤处理，以便得到第一过滤液。由此，利用根据本发明实施例的检测乳品中左旋咪唑的方法能够进一步准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且回收率高、精密度高、灵敏度高、操作简便。
根据本发明的实施例，在进行所述色谱检测之前，预先包括：将所述洗脱液进行干燥处理，并用乙腈-水溶液将所得到的产物进行溶解处理，得到溶解液；以及将所述溶解液进行第二过滤处理，以便得到第二过滤液，优选地，所述第二过滤处理是采用0.22微米的过滤膜进行的。由此，利用根据本发明实施例的检测乳品中左旋咪唑的方法能够进一步准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且回收率高、精密度高、灵敏度高、操作简便。
根据本发明的实施例，采用液相色谱-串联质谱对所述洗脱液进行检测，所述液相色谱-串联质谱的检测条件如下：
离子源控制条件：
电离方式：电喷雾电离，正离子；
毛细管电压：3.0kV；
锥孔电压：39V；
离子源温度：120℃；
锥孔反吹气流量：50L/h；
脱溶剂气温度：350℃；
脱溶剂气流量：500L/h；
电子倍增电压：650V；
扫描方式：多离子反应监测；
离子选择参数：母离子205.1，子离子99.70和177.80，碰撞能量是36和21，驻留时间是0.05min，
液相色谱条件：
流动相流动速度：0.2mL/min；
色谱柱柱温：35℃；
试液温度：4℃；
进样体积：10μL；
流动相：A相，0.1％甲酸溶液；B相，乙腈溶液；
梯度洗脱：
由此，利用根据本发明实施例的检测乳品中左旋咪唑的方法能够进一步准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且回收率高、精密度高、灵敏度高、操作简便。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种测定奶粉中左旋咪唑的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：称取样品1.0克，加入8毫升三氯乙酸溶液(浓度为0.1体积％)，涡旋震荡1分钟，再加入2毫升乙腈，涡旋震荡1分钟，超声20分钟，涡旋震荡10分钟，在10000rpm下离心10分钟，收集上清液；采用预先经过三氯乙酸溶液润洗的定量滤纸对所述上清液进行过滤，再用三氯乙酸溶液洗涤所述定量滤纸，收集滤液；将所述滤液加入到预先经3毫升甲醇、3毫升水和3毫升0.2mol/mL盐酸活化的MCX固相萃取小柱，上样完毕后，依次用3毫升水、1毫升0.2mol/mL盐酸和3毫升甲醇淋洗，用氨化甲醇4.0毫升洗脱，收集洗脱液；用氮气吹干所述洗脱液，用乙腈-水溶液(乙腈与水的体积比为3：17)定容至1毫升，过0.22μm有机滤膜，得到待测液；利用液相色谱-串联质谱分别测定所述待测液和不同浓度左旋咪唑标准工作液，并基于测定结果确定所述奶粉中左旋咪唑含量，其中，
离子源控制条件：
电离方式：电喷雾电离，正离子；
毛细管电压：3.0kV；
锥孔电压：39V；
离子源温度：120℃；
锥孔反吹气流量：50L/h；
脱溶剂气温度：350℃；
脱溶剂气流量：500L/h；
电子倍增电压：650V；
扫描方式：多离子反应监测；
离子选择参数：母离子205.1，子离子99.70和177.80，碰撞能量是36和21，驻留时间是0.05min，
液相色谱条件：
流动相流动速度：0.2mL/min；
色谱柱柱温：35℃；
试液温度：4℃；
进样体积：10μL；
流动相：A相，0.1％甲酸溶液；B相，乙腈溶液；
梯度洗脱：
由此，利用根据本发明实施例的检测乳品中左旋咪唑的方法能够准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且精密度高、操作简便。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的检测乳品中左旋咪唑的方法的流程示意图；
图2显示了根据本发明另一个实施例的检测乳品中左旋咪唑的方法的流程示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的标准曲线；
图4显示了根据本发明一个实施例的检出限色谱图；以及
图5显示了根据本发明一个实施例的左旋咪唑的总离子流图、定性离子及定量离子色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提出了一种检测乳品中左旋咪唑的方法。利用本发明的方法能够准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且精密度高、操作简便。下面将对该方法进行详细描述。
根据本发明的实施例，参见图1，该方法包括：
S100混合处理
在该步骤中，将乳品、三氯乙酸溶液与乙腈进行混合处理，以便得到混合液。
发明人经过大量实验发现，采用乙腈作为提取剂，不仅能够提取出乳品中的左旋咪唑，还可以使得乳品中蛋白质的构象发生改变，使之沉淀聚集，并在离心后使蛋白沉淀，避免了乳品中的蛋白质对结果的干扰。进一步地，发明人发现，由于乳品具有基质成分复杂、富含蛋白质、脂肪等特性，若仅采用乙腈作为提取剂，无法完全沉淀蛋白，仍有少量存留在提取的上清液中，对后续检测造成干扰，使得检测结果准确性较低。发明人经过深入研究发现，将乙腈与三氯乙酸结合使用，三氯乙酸能够进一步沉淀蛋白，且为后续萃取提供酸性条件，无需额外添加酸性物质，使得操作简便，效率高。
然而，其他提取剂提取效果不佳。例如，有些溶剂在提取左旋咪唑的同时，会使样品乳化，无法充分提取包埋在蛋白质和脂肪中的左旋咪唑，使得检测结果偏低，例如乙酸乙酯。另外，有些溶剂在提取左旋咪唑的同时，夹带少量蛋白质、脂肪等杂质，对后续结果产生干扰且不利于色谱柱的长期使用，例如丙酮。
根据本发明的实施例，基于1克乳品，三氯乙酸的用量为8～10毫升，乙腈为1～3毫升，三氯乙酸溶液的浓度为0.1体积％。
发明人经过大量的实验发现，三氯乙酸添加量会影响蛋白沉淀效果及后续的固相萃取过程。例如，若三氯乙酸的添加量过少或者浓度过低，一方面无法完全沉淀蛋白，导致仍有少量蛋白残留在上清液中，影响后续检测，导致检测结果准确性低；另一方面，固相萃取过程中需要阳离子交换，少量的三氯乙酸无法提供足够的阳离子，不能很好地萃取出左旋咪唑，从而导致最终检测结果偏低。三氯乙酸的用量为8～10毫升时，沉淀蛋白及固相萃取效果皆佳。
发明人经过大量实验发现，乙腈添加量会影响左旋咪唑的提取。例如，若乙腈含量过少，不能完全提取出乳品中的左旋咪唑，导致最终色谱检测结果偏低。若乙腈含量过多，会使乳品中的蛋白迅速聚集沉淀，蛋白会裹挟少量的左旋咪唑，离心后上清液左旋咪唑含量比实际值低，从而导致最终色谱检测结果偏低。当乙腈用量为1～3毫升时，能较好地提取出左旋咪唑，且不会发生迅速絮凝沉淀的现象，也不会发生乳化现象。
根据本发明的优选实施例，基于1克乳品，三氯乙酸的用量为8毫升，乙腈的用量为2毫升。由此，能够进一步提高检测结果的准确性和精密度。
根据本发明的实施例，参见图2，该混合处理包括：
S110第一混合处理
在该步骤中，将乳品与三氯乙酸溶液进行第一混合处理，以便得到第一混合液。由此，以便沉淀蛋白。
S120第二混合处理
在该步骤中，将第一混合液与乙腈进行第二混合处理，以便得到第二混合液。由此，提取左旋咪唑的同时沉淀蛋白。
S130超声及震荡处理
在该步骤中，将第二混合液依次进行超声及震荡处理，以便得到混合液。由此，便于充分提取左旋咪唑，沉淀蛋白质。
根据本发明的实施例，超声处理的时间为10～20分钟，震荡处理的时间为5～15分钟。发明人经过大量的实验发现超声的时间会影响左旋咪唑的提取和蛋白的沉淀效果。若超声时间过长，会发生乳品的乳化现象，使得蛋白质裹挟部分左旋咪唑，使得测量结果偏低。若超声时间过短则不能完全溶解左旋咪唑。当超声时间为10～20分钟时，能够很好地溶解左旋咪唑并沉淀蛋白，且不会发生乳化现象。
根据本发明优选实施例，超声时间为20分钟，震荡处理时间为10分钟。由此，能够进一步提高检测结果的准确性和精密度。
需要说明的是，本发明对于乳品的种类不作严格限定，既可以是液态乳品，例如生牛乳、复原乳、调制乳、酸奶等；也可以是固态乳品，例如乳粉、奶片、奶酪等；还可以是半固态乳品，例如炼乳。针对液态乳品，可以直接将其与三氯乙酸、乙腈进行混合，以便得到混合液。针对固态乳品或者半固体，可以预先将其进行溶解，再与三氯乙酸、乙腈进行混合，对于溶解方式不作严格限定，可以根据实际生产需要进行选择，例如，用水溶解、加热溶解等方式。
S200固相萃取处理
在该步骤中，将混合液进行固相萃取处理，以便得到洗脱液。由于，以便进一步净化待测物。
根据本发明的实施例，在进行所述固相萃取处理之前，进一步包括：
(1)将混合液进行离心处理，收集上清液。由此，使得溶解有左旋咪唑的三氯乙酸和乙腈(上层液)与其他杂质(下层液)分离，便于提取，用作后续固相萃取。
根据本发明的实施例，离心处理是在10000rpm的转速下进行10分钟。发明人经过大量实验得到上述较佳的离心处理条件，在此条件下能够准确地使溶解有左旋咪唑的三氯乙酸和乙腈(上层液)与其他杂质(下层液)分离。若转速过低或者时间过短，分层效果不明显，容易有少量左旋咪唑溶解于下层液中，导致检测结果偏低；若转速过高或者时间过长，容易对仪器造成损耗，缩短使用寿命。
(2)将上清液进行第一过滤处理，以便得到第一过滤液。由此，防止过大颗粒造成检测仪器堵塞，影响使用。具体地，上清液过经三氯乙酸溶液润洗的定量滤纸，过滤完毕后，再用三氯乙酸溶液洗涤定量滤纸，获得第一过滤液。
根据本发明的实施例，第一过滤液加入到经3mL甲醇，3mL水和3mL0.2mol/mL盐酸活化的MCX固相萃取小柱，上样完毕后，在依次用3mL水，1mL0.2mol/mL盐酸和3mL甲醇淋洗，用氨化甲醇4.0mL洗脱，获得洗脱液，用氮气吹干洗脱液，用乙腈-水溶液(乙腈、水体积比为3：17)溶解，获得溶解液并定容至1mL。
S300色谱检测
在该步骤中，将溶解液进行色谱检测，并基于检测结果对乳品中左旋咪唑进行定性或者定量分析。
根据本发明的实施例，在进行色谱检测S300之前，进一步包括：
(i)将洗脱液进行干燥处理，并用乙腈-水溶液将所得到的产物进行溶解处理，得到溶解液。由此，通过干燥处理以便除去乙腈、三氯乙酸等溶剂。
(ii)将溶解液进行第二过滤处理，以便得到第二过滤液。根据本发明的优选实施例，第二过滤处理是采用0.22微米的过滤膜进行的。由此，以便除去大颗粒，防止其对后续色谱检测造成干扰。
根据本发明的实施例，采用液相色谱-串联质谱对溶解液进行检测，液相色谱-串联质谱的检测条件如下：
离子源控制条件：
电离方式：电喷雾电离，正离子；
毛细管电压：3.0kV；
锥孔电压：39V；
离子源温度：120℃；
锥孔反吹气流量：50L/h；
脱溶剂气温度：350℃；
脱溶剂气流量：500L/h；
电子倍增电压：650V；
扫描方式：多离子反应监测；
离子选择参数：母离子205.1，子离子99.70和177.80，碰撞能量是36和21，驻留时间是0.05min，
液相色谱条件：
流动相流动速度：0.2mL/min；
色谱柱柱温：35℃；
试液温度：4℃；
进样体积：10μL；
流动相：A相，0.1％甲酸溶液；B相，乙腈溶液；
梯度洗脱：
另外，本发明提出了另一种测定奶粉中左旋咪唑的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：称取样品1.0克，加入8毫升三氯乙酸溶液(浓度为0.1体积％)，涡旋震荡1分钟，再加入2毫升乙腈，涡旋震荡1分钟，超声20分钟，涡旋震荡10分钟，在10000rpm下离心10分钟，收集上清液；采用预先经过三氯乙酸溶液润洗的定量滤纸对所述上清液进行过滤，再用三氯乙酸溶液洗涤所述定量滤纸，收集滤液；将所述滤液加入到预先经3毫升甲醇、3毫升水和3毫升0.2mol/mL盐酸活化的MCX固相萃取小柱，上样完毕后，依次用3毫升水、1毫升0.2mol/mL盐酸和3毫升甲醇淋洗，用氨化甲醇4.0毫升洗脱，收集洗脱液；用氮气吹干所述洗脱液，用乙腈-水溶液(乙腈与水的体积比为3：17)定容至1毫升，过0.22μm有机滤膜，得到待测液；利用液相色谱-串联质谱分别测定所述待测液和不同浓度左旋咪唑标准工作液，并基于测定结果确定所述奶粉中左旋咪唑含量，其中，
离子源控制条件：
电离方式：电喷雾电离，正离子；
毛细管电压：3.0kV；
锥孔电压：39V；
离子源温度：120℃；
锥孔反吹气流量：50L/h；
脱溶剂气温度：350℃；
脱溶剂气流量：500L/h；
电子倍增电压：650V；
扫描方式：多离子反应监测；
离子选择参数：母离子205.1，子离子99.70和177.80，碰撞能量是36和21，驻留时间是0.05min，
液相色谱条件：
流动相流动速度：0.2mL/min；
色谱柱柱温：35℃；
试液温度：4℃；
进样体积：10μL；
流动相：A相，0.1％甲酸溶液；B相，乙腈溶液；
梯度洗脱：
由此，利用本发明的方法能够准确地对乳品中左旋咪唑进行检测，且精密度高、操作简便。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法测定婴幼儿奶粉中左旋咪唑检出限：
1、试剂及材料
左旋咪唑标准品：纯度均大于等于98％。
三氯乙酸、乙腈、甲醇、氨水、水为一级。
左旋咪唑标准储备液(100μg/mL)：分别称取标准品左旋咪唑各0.01mg，用甲醇溶解定容到100mL，此标准溶液浓度为100μg/mL；
左旋咪唑标准中间液(1.0μg/mL)：取左旋咪唑标准储备液1.0mL于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，此标准中间液的浓度为1.0μg/mL。
左旋咪唑标准工作液：依据检测样品的实际浓度范围制备左旋咪唑标准中间液，具体地，用乙腈-水溶液(乙腈与水的体积比为3：17)稀释至所需浓度。
2、仪器与设备
液相色谱-质谱/质谱联用仪。
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HLIC(50mm×2.1mm,1.8μm)或性能相当者。
固相萃取装置。
高速离心机。
涡流混合器。
氮吹仪。
滤器：0.2μm有机滤器。
离子交换固相萃取柱或性能相当者。
3、样品处理
称取样品1.0g左右(准确至0.01g)，加入8mL三氯乙酸溶液(浓度为0.1体积％)，涡旋震荡1min，再加入2mL乙腈，涡旋震荡1min，然后超声20min，涡旋震荡10min，在10000rpm下离心10min，上清液过经三氯乙酸溶液润洗的定量滤纸，过滤完毕后，再用三氯乙酸溶液洗涤定量滤纸。提取液加入到经3mL甲醇、3mL水和3mL 0.2mol/mL盐酸活化的MCX固相萃取小柱，上样完毕后，在依次用3mL水、1mL 0.2mol/mL盐酸和3mL甲醇淋洗，用氨化甲醇4.0mL洗脱。用氮气吹干洗脱液，用乙腈-水溶液(乙腈与水的体积比为3：17)定容至1mL，过0.22μm有机滤膜，得到待测液。
利用液相色谱-串联质谱分别测定待测液和不同浓度左旋咪唑标准工作液。
4、质谱参考条件
离子源控制条件：
电离方式：电喷雾电离，正离子；
毛细管电压：3.0kV；
锥孔电压：39V；
离子源温度：120℃；
锥孔反吹气流量：50L/h；
脱溶剂气温度：350℃；
脱溶剂气流量：500L/h；
电子倍增电压：650V；
扫描方式：多离子反应监测；
离子选择参数：母离子205.1，子离子99.70和177.80，碰撞能量是36和21，驻留时间是0.05min。
5、液相色谱条件
流动相流动速度：0.2mL/min；
色谱柱柱温：35℃；
试液温度：4℃；
进样体积：10μL；
流动相：A相，0.1％甲酸溶液；B相，乙腈溶液；
梯度洗脱：
6、分析结果
(1)将左旋咪唑标准品工作液浓度和响应值绘制标准曲线，如图3所示。标准曲线相关系数达到0.995，符合GB/T 27404-2008中相关系数≥0.99的要求。
(2)将待测液获得的响应值代入标准曲线中，计算得到其浓度。
(3)试样中左旋咪唑含量按以下公式计算：
X＝C×M/V×1000/1000
式中:
(1)X——试样中左旋咪唑的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
(2)C——待测液中左旋咪唑的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
(3)M——试样质量，单位为克(g)；
(4)V——试样的最后定容体积，单位为毫升(mL)。
7、方法检出限测定
通过对方法检出限(0.4μg/kg)进行信噪比(S/N)测定，色谱图如图4所示，检出限浓度为0.4ng/mL时左旋咪唑信噪比为9.13，大于信噪比3，因此设定此检出限为0.4μg/kg。另外，图5显示了左旋咪唑的总离子流图、定性离子及定量离子色谱图。
实施例2回收率测定
在该实施例中，按照下列方法测定回收率：
(1)将具有已知左旋咪唑含量的牛奶(记作本底含量)与左旋咪唑标准品(标准品终浓度记作理论值)进行混合，得到加标样品；以及
(2)按照实施例1的方法测定加标样品中左旋咪唑含量(记作实际测定值)，并按照下列公式计算回收率。
回收率(％)＝(实际测定值-本底含量)×100％/理论值
通过对0.32μg/kg(1倍检出限左右)和1.60μg/kg(4倍检出限左右)进行回收率测定，测定结果如下表所示，回收率范围在88.26～101.91％之间，符合GB/T 27404-2008中的回收率60～120％的要求。由此，表明本发明的方法具有较强的准确性。
表1回收率测定结果
对比例1
采用国标GBT22994-2008方法对婴幼儿乳粉中左旋咪唑进行检测，结果如表2所示。
表2左旋咪唑回收率
根据以上数据可见，利用本发明的方法能够显著提高左旋咪唑的回收率，保证检测结果准确性。
对比例2
按照实施例2的方法测定回收率，区别在于，将三氯乙酸替换为亚铁氰化钾和乙酸铵溶液或者是EDTA-Mcllvaine缓冲液，同时加入左旋咪唑1.6μg/kg。
三种不同沉淀剂回收率结果如下。可以看出，利用亚铁氰化钾和乙酸铵溶液或者EDTA-Mcllvaine缓冲液的回收率均偏低，检测结果准确性较低。
表3不同沉淀剂作用下左旋咪唑回收率
对比例3
按照实施例2的方法测定回收率，区别在于，三氯乙酸的用量为2mL。
结果如表4所示。可以看出，本发明方法的准确性较高。
表4三氯乙酸用量对检测结果的影响
对比例4
按照实施例1的方法测定回收率，区别在于，将乙腈替换为丙酮。
结果如表5所示。采用丙酮提取左旋咪唑时，检测结果的准确性较低，且在提取过程中会夹带少量蛋白质、脂肪等杂质，对后续结果产生干扰且不利于色谱柱的长期使用。
表5不同提取剂对检测结果的影响
对比例5
按照实施例1的方法测定回收率，区别在于，乙腈的用量为8mL。
结果如表6所示。可以看出，本发明方法的准确性较高。
表6乙腈用量对检测结果的影响
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种测定奶粉中左旋咪唑的方法，其特征在于，包括：
称取样品1.0克，加入8毫升三氯乙酸溶液(浓度为0.1体积％)，涡旋震荡1分钟，再加入2毫升乙腈，涡旋震荡1分钟，超声20分钟，涡旋震荡10分钟，在10000rpm下离心10分钟，收集上清液；
采用预先经过三氯乙酸溶液润洗的定量滤纸对所述上清液进行过滤，再用三氯乙酸溶液洗涤所述定量滤纸，收集滤液；
将所述滤液加入到预先经3毫升甲醇、3毫升水和3毫升0.2mol/mL盐酸活化的MCX固相萃取小柱，上样完毕后，依次用3毫升水、1毫升0.2mol/mL盐酸和3毫升甲醇淋洗，用氨化甲醇4.0毫升洗脱，收集洗脱液；
用氮气吹干所述洗脱液，用乙腈-水溶液(乙腈与水的体积比为3：17)定容至1毫升，过0.22μm有机滤膜，得到待测液；
利用液相色谱-串联质谱分别测定所述待测液和不同浓度左旋咪唑标准工作液，并基于测定结果确定所述奶粉中左旋咪唑含量，
其中，
离子源控制条件：
电离方式：电喷雾电离，正离子；
毛细管电压：3.0kV；
锥孔电压：39V；
离子源温度：120℃；
锥孔反吹气流量：50L/h；
脱溶剂气温度：350℃；
脱溶剂气流量：500L/h；
电子倍增电压：650V；
扫描方式：多离子反应监测；
离子选择参数：母离子205.1，子离子99.70和177.80，碰撞能量是36和21，驻留时间是0.05min，
液相色谱条件：
流动相流动速度：0.2mL/min；
色谱柱柱温：35℃；
试液温度：4℃；
进样体积：10μL；
流动相：A相，0.1％甲酸溶液；B相，乙腈溶液；
梯度洗脱：
2.一种测定乳品中左旋咪唑的方法，其特征在于，包括，
将所述乳品、三氯乙酸溶液与乙腈进行混合处理，以便得到混合液；
将所述混合液进行固相萃取处理，以便得到洗脱液；以及
将所述洗脱液进行色谱检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，基于1克所述乳品，所述三氯乙酸溶液的体积为8～10毫升，乙腈为1～3毫升。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述三氯乙酸溶液的浓度为0.1体积％。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述混合处理包括：
将所述乳品与三氯乙酸溶液进行第一混合处理，以便得到第一混合液；
将所述第一混合液与乙腈进行第二混合处理，以便得到第二混合液；
将所述第二混合液依次进行超声及震荡处理，以便得到所述混合液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述超声处理的时间为10～20分钟，所述震荡处理的时间为5～15分钟。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行所述固相萃取处理之前，进一步包括：
将所述混合液进行离心处理，收集上清液；以及
将所述上清液进行第一过滤处理，以便得到第一过滤液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述离心处理是在10000rpm的转速下进行10分钟。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行所述色谱检测之前，进一步包括：
将所述洗脱液进行干燥处理，并用乙腈-水溶液将所得到的产物进行溶解处理，得到溶解液；以及
将所述溶解液进行第二过滤处理，以便得到第二过滤液，
优选地，所述第二过滤处理是采用0.22微米的过滤膜进行的。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用液相色谱-串联质谱对所述溶解液液进行检测，所述液相色谱-串联质谱的检测条件如下：
离子源控制条件：
电离方式：电喷雾电离，正离子；
毛细管电压：3.0kV；
锥孔电压：39V；
离子源温度：120℃；
锥孔反吹气流量：50L/h；
脱溶剂气温度：350℃；
脱溶剂气流量：500L/h；
电子倍增电压：650V；
扫描方式：多离子反应监测；
离子选择参数：母离子205.1，子离子99.70和177.80，碰撞能量是36和21，驻留时间是0.05min，
液相色谱条件：
流动相流动速度：0.2mL/min；
色谱柱柱温：35℃；
试液温度：4℃；
进样体积：10μL；
流动相：A相，0.1％甲酸溶液；B相，乙腈溶液；
梯度洗脱：
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