CN104034835B - 发酵酒中多种生物毒素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种液质联用法测定发酵酒中多种生物毒素的方法，其只需将样品经过简单液液分配萃取，将萃取液转溶后便可得待测液，即样品处理简单，以ESI源为离子源，采用Inertsil C8色谱柱，以0.25mL/min的流速进行梯度洗脱分离，以5mmol/L乙酸铵水溶液A相和乙腈B相为流动相，满足正负两种离子采集模式同时工作，能够在较短的时间内同时对样品中的多种生物毒素含量进行测定。避免了现有技术中，采用免疫亲和柱或其他固相萃取柱富集净化目标物带来的高成本、低效率、低回收率等问题，或因直接进样造成部分目标待测物有明显基质增强或减弱效应、以及直接进样导致的色谱柱和质谱系统离子源污染问题，从而减少相应的维护成本。

Description

发酵酒中多种生物毒素的检测方法

技术领域

本发明涉及化学检测，具体涉及发酵酒中多种生物毒素的测定方法。

背景技术

发酵酒是以粮谷、水果、乳类等为原料，主要经酵母发酵等工艺酿制而成的，酒精含量小于24％的饮料酒。主要包括啤酒、葡萄酒、水果酒和黄酒等。

目前已知有300多种结构非常不同的真菌毒素，其中一些主要的真菌毒素有：黄曲霉毒素(Aflatoxin)、麦角生物碱、赭曲霉毒素A、3-硝基丙酸、展青霉素(Patulin)、镰孢菌毒素(a玉米赤霉烯酮；b单端孢霉烯族化合物如：如T2毒素)、橘青霉素、黄绿青霉素、杂色曲霉素，这些毒素对肝肾肺心脑等人体重要器官有不同程度损伤，具有致畸致癌等危害。发酵酒酿造生产过程中，存在不同程度的毒素残留。如赭曲霉毒素(OTA)可由生长在葡萄表面的碳黑曲霉(Aspergillus carbonarius)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、纯绿青霉(Penicillium berrucosum)OTA产生菌在合适条件下产生，并在浸渍阶段，部分OTA开始溶解在酿造液中，尽管大部分OTA会随着皮渣被除去，但仍有较低浓度的OTA残留于葡萄酒中；其他如米酒，果酒，奶酒等均存在类似原料污染等情况，同样存在残留风险。这种被真菌毒素污染的酒类的摄入对人体健康造成了极大损害，随着国人对酒类消费需求的转变，包括诸如葡萄酒等果酒在内的发酵酒中生物毒素多残留检测在保障国民身体健康，提高国民身体素质方面有重要作用。

液质联用法灵敏度高、选择性好、准确度高，在现代分析测试中发挥着重要作用。目前通常采用免疫亲和柱或其他固相萃取柱富集净化目标物，或直接进样，利用液相色谱或液质联用仪进行检测，但无法避免高成本、低效率、低回收率以及因直接进样造成部分目标待测物有明显基质增强或减弱效应，及色谱柱和质谱系统离子源污染问题。而本方法前处理操作简单、能有效减少基质效应、减少色谱柱及离子源的污染，节省检测成本，尤其是对发酵酒中的橘青霉毒素、柄曲霉毒素测定起到方法补充作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种液质联用测定发酵酒中多种生物毒素残留的方法。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种液质联用测定发酵酒中多种生物毒素的方法，该方法包括如下步骤：

(1)标准溶液的配制：分别称取不同种类的真菌毒素标样，采用乙腈为溶剂分别对各标样进行溶解并定容获得1mg/mL标准溶液的母液，再根据需要利用乙腈+水(3+2)溶液将母液稀释成一定浓度的标准溶液，于-18℃下保存备用；

(2)样品处理：取酒样加入三氯甲烷，在涡旋振荡器上高速涡旋振荡萃取，静置分层后，将下层有机相全部转移到离心管中，于40℃以下水浴氮吹至干，加入1ml乙腈+水(3+2)溶液将离心管中残留物全部溶解并混匀，经过0.45μm滤膜过滤即得待测液；

(3)分别取制备获得的标准梯度溶液及待测液，液质联用检测，记录数据，

(4)计算结果：利用液质联用仪器自带软件，外标法峰面积定量，计算分别得到待测液中赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、橘青霉毒素、柄曲霉毒素、展青霉毒素的含量。

本发明的进一步技术方案，所述步骤(3)中，检测的色谱-质谱条件为：

色谱条件：流动相：5mmol/L乙酸铵水溶液(A)和乙腈(B)，流速：0.25ml/min，进样量：20μL，色谱柱：Inertsil C8(5μm，2.1ID×150mm)，柱温：30℃，色谱柱平衡时间：2min，

梯度洗脱条件如下：0～1min，乙腈相溶剂百分比以10％维持1min，1～3min，线性增加到60％；3～5min，乙腈相溶剂百分比再从60％增加到95％；5～10min，乙腈相溶剂百分比95％维持5min；10～15min，乙腈相溶剂百分比10％维持5min；

质谱条件：离子源：ESI源，离子化方式：正离子和负离子切换，扫描模式：多反应监测。

本发明的进一步技术方案，所述步骤(1)中，酒样取用量为5ml，萃取试剂为10ml三氯甲烷，振荡萃取时间为2min，回溶用乙腈水溶液为乙腈+水(3+2)混合溶液，加入量为1ml。

本发明的进一步技术方案，所述步骤(1)中，母液利用乙腈+水(3+2)溶液稀释成浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00μg/L的标准溶液。

本发明的进一步技术方案，所述样品处理中的酒为黄酒、果酒或葡萄酒。

本发明的进一步技术方案，所述真菌毒素标样选自赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、橘青霉毒素、柄曲霉毒素、展青霉毒素毒素、麦角生物碱、镰孢菌毒素、黄绿青霉素、杂色曲霉素。

本发明的进一步技术方案，所述真菌毒素标样选自赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、橘青霉毒素、柄曲霉毒素、展青霉毒素毒素。

相对于现有技术方案，本发明的优点是：

本发明一种液质联用法测定发酵酒中多种生物毒素的方法的有益效果在于：能够同时测定样品中的5类生物毒素残留，而且样品处理简单，以ESI源为离子源，采用InertsilC8色谱柱，以0.25mL/min的流速进行梯度洗脱分离，以5mmol/L乙酸铵水溶液(A)和乙腈(B)为流动相，满足正负两种离子采集模式同时工作，能够在较短的时间内同时对样品中的多种生物毒素含量进行测定，避免了现有技术中，或采用免疫亲和柱或其他固相萃取柱富集净化目标物带来的高成本、低效率、低回收率等问题，或因直接进样造成部分目标待测物有明显基质增强或减弱效应、以及直接进样导致的色谱柱和质谱系统离子源污染问题，从而减少相应的维护成本，另外，还具有高通量、高灵敏度、高准确度等特点，进而极大的节省了检测成本。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1A是本发明中标准溶液5种毒素提取离子流的质谱图。

图1B是负离子采集模式下展青霉素提取离子流的质谱图。

图2A是本发明中实施例一待测液总离子流的质谱图。

图2B是本发明中实施例一待测液提取离子流质谱图。

图3A是本发明中实施例二待测液总离子流的质谱图。

图3B是本发明中实施例二待测液提取离子流的质谱图。

图4A是本发明中实施例三待测液总离子流的质谱图。

图4B是本发明中实施例三待测液提取离子流的质谱图。

图5是本发明中各目标分析物的线性回归曲线，其中5A是展青霉素线性回归曲线，5B为赭曲霉素A线性回归曲线，5C为黄曲霉素B1线性回归曲线，5D为黄曲霉素M1线性回归曲线，5E为桔青霉素线性回归曲线，5F为杂色曲霉素线性回归曲线。

具体实施方式

结合如下实施例对本发明液质联用法测定发酵酒中多种生物毒素残留(赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、橘青霉毒素、柄曲霉毒素、展青霉毒素)的方法进行进一步说明。

实施例1黄酒中的多种生物毒素残留检测

(1)标准溶液的配制：分别称取赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、橘青霉毒素、柄曲霉毒素、展青霉毒素标样10mg，采用乙腈为溶剂分别对各标样进行溶解并定容以获得标准溶液的母液，且该母液的浓度为1mg/mL，然后根据需要利用乙腈水(3+2)溶液将母液稀释成一定浓度的标准溶液，于-18℃下保存备用；

(2)样品处理：取5ml酒样于50ml离心管中，加入10ml三氯甲烷，在涡旋振荡器上高速涡旋振荡萃取2min，静置分层后，将下层有机相全部转移到10ml离心管中，于40℃以下水浴氮吹至干，加入1ml乙腈水(3+2)溶液将10ml离心管中残留物全部溶解并混匀，经过0.45μm滤膜过滤即得待测液；

(3)液质联用检测：

色谱条件

流动相：5mmol/L乙酸铵水溶液(A)和乙腈(B)；

流速：0.25ml/min；

进样量：20μL；

色谱柱：Inertsil C8(5μm，2.1ID×150mm)；

柱温：30℃；

色谱柱平衡时间：2min；

梯度洗脱条件如下：0～1min，乙腈相溶剂百分比以10％维持1min，1～3min，线性增加到60％；3～5min，乙腈相溶剂百分比再从60％增加到95％；5～10min，乙腈相溶剂百分比95％维持5min；10～15min，乙腈相溶剂百分比10％维持5min。

表1色谱梯度洗脱表

质谱条件

离子源：ESI源；

离子化方式：正离子和负离子切换；

扫描模式：多反应监测；

优化的去簇电压和碰撞能量等参数详见下表：

表2质谱采集参数

(4)测定：分别取制备获得的标准梯度溶液及待测液，并采用上述色谱质谱条件进行进样检测，记录数据，并得到6种标样的线性回归方程，具体地，6种标样的线性回归方程如下表所示，标准溶液的谱图如图1所示，待测液的谱图如图2所示；且经过工作站软件定量计算得到待测液中赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、橘青霉毒素、柄曲霉毒素、展青霉毒素残留量。(见表b)

表a多种毒素残留检测的线性相关性

如图1A、1B所示，以5mmol/L乙酸铵水溶液(A)和乙腈(B)为流动相进行数据采集，除橘青霉素峰形出现分叉，其余组分峰形良好，且部分正离子模式下采集的组分在此流动相条件下相比于含有甲酸的流动相体系灵敏度略有下降，但是对各物质准确定量均无明显影响，并且保证了负离子模式下采集的展青霉素正常出峰，满足了正负离子模式同时工作的需求。

由表a可知，赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、橘青霉毒素、柄曲霉毒素、展青霉毒素相关系数R均大于0.999，说明各种毒素组分的峰面积和毒素组分浓度的线性相关相很好，通过上述色谱质谱条件可以很好的测定多种毒素残留量，即准确度高；且当信噪比(RSN)为3时，测得的6种毒素的检测限，6种毒素的检测限见表a。

表b黄酒样品中多种毒素残留量(ng/mL)

目标物	残留量(ng/mL)
		橘青霉毒素	N.D.
柄曲霉毒素	0.411
		赭曲霉毒素A	N.D.
黄曲霉毒素B1	0.0761
		黄曲霉毒素M1	N.D.
展青霉毒素	N.D.

为了不重复累赘，对以下实施例仅针对不同点进行阐述说明(注：N.D.表示未检出或低于检出限，下同)。

实施例2葡萄酒中的多种毒素残留检测

样品处理：取葡萄酒样品按实施例1相同处理方法处理；

测定：取本实施例制备获得的待测液进样进行分析测定，且色谱质谱条件与实施例1的完全一致，得到待测液的谱图如图3A/3B所示，且经过工作站软件定量计算得到待测液中赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、橘青霉毒素、柄曲霉毒素、展青霉毒素残留量(见表c)。

表c实例2样品中多种毒素残留量(ng/mL)

目标物	残留量(ng/mL)
		橘青霉毒素	N.D.
柄曲霉毒素	N.D.
		赭曲霉毒素A	0.518
黄曲霉毒素B1	N.D.
		黄曲霉毒素M1	N.D.
展青霉毒素	N.D.

实施例3苹果酒中的多种毒素残留检测

样品处理：取苹果酒样品按实施例1相同处理方法处理；

测定：取本实施例制备获得的待测液进样进行分析测定，且色谱质谱条件与实施例1的完全一致，得到待测液的谱图如图4A/4B所示，且经过工作站软件定量计算得到待测液中赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、橘青霉毒素、柄曲霉毒素、展青霉毒素残留量(见表d)。

表d实例3样品中多种毒素残留量(ng/mL)

目标物	残留量(ng/mL)
		橘青霉毒素	N.D.
柄曲霉毒素	N.D.
		赭曲霉毒素A	N.D.
黄曲霉毒素B1	N.D.
		黄曲霉毒素M1	N.D.
展青霉毒素	19.4

本发明方法能够能够在较短的时间内同时对样品中的多种生物毒素含量进行测定，样品处理简单，避免了现有技术中，或采用免疫亲和柱或其他固相萃取柱富集净化目标物带来的高成本、低效率、低回收率等问题，或因直接进样造成部分目标待测物有明显基质增强或减弱效应、以及直接进样导致的色谱柱和质谱系统离子源污染问题，从而减少相应的维护成本，另外，还具有高通量、高灵敏度、高准确度等特点，进而极大的节省了检测成本。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种发酵酒中多种生物毒素的检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)标准溶液的配制：分别称取不同种类的真菌毒素标样，采用乙腈为溶剂分别对各标样进行溶解并定容获得1mg/mL标准溶液的母液，再根据需要利用乙腈+水/3+2/溶液将母液稀释成一定浓度的标准溶液，于-18℃下保存备用；

(2)样品处理：取酒样加入三氯甲烷，在涡旋振荡器上高速涡旋振荡萃取，静置分层后，将下层有机相全部转移到离心管中，于40℃以下水浴氮吹至干，加入1ml乙腈+水/3+2/溶液将离心管中残留物全部溶解并混匀，经过0.45μm滤膜过滤即得待测液；酒样取用量为5ml，萃取试剂为10ml三氯甲烷，振荡萃取时间为2min，回溶用乙腈水溶液为乙腈+水/3+2/混合溶液，加入量为1ml

(3)分别取制备获得的标准梯度溶液及待测液，液质联用检测，记录数据，

检测的色谱-质谱条件为：

色谱条件：流动相：5mmol/L乙酸铵水溶液(A)和乙腈(B)，流速：0.25ml/min，进样量：20μL，色谱柱：Inertsil C8,5μm，2.1ID×150mm，柱温：30℃，色谱柱平衡时间：2min，

梯度洗脱条件如下：0～1min，乙腈相溶剂百分比以10％维持1min，1～3min，线性增加到60％；3～5min，乙腈相溶剂百分比再从60％增加到95％；5～10min，乙腈相溶剂百分比95％维持5min；10～15min，乙腈相溶剂百分比10％维持5min；

质谱条件：离子源：ESI源，离子化方式：正离子和负离子切换，扫描模式：多反应监测；

(4)计算结果：利用液质联用仪器自带软件，外标法峰面积定量，分别计算得到待测液中不同种类生物毒素的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，母液利用乙腈+水/3+2/溶液稀释成浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00μg/L的标准溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品处理中的酒为黄酒或果酒。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真菌毒素标样选自赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、橘青霉毒素、柄曲霉毒素、展青霉毒素、麦角生物碱、镰孢菌毒素、黄绿青霉素、杂色曲霉素。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真菌毒素标样选自赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、橘青霉毒素、柄曲霉毒素、展青霉毒素。