CN112461973B

CN112461973B - 一种基于六氟丁醇作萃取剂的检测红葡萄酒中赭曲霉毒素a的新方法

Info

Publication number: CN112461973B
Application number: CN202011320259.6A
Authority: CN
Inventors: 郭亚芸; 史红梅; 梁红敏; 高欢欢; 刘利
Original assignee: Shandong Grape Research Institute
Current assignee: Shandong Grape Research Institute
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2040-11-23
Also published as: CN112461973A

Abstract

本发明提供一种基于六氟丁醇作萃取剂的检测红葡萄酒中赭曲霉毒素A的新方法，包括以下步骤：（1）样品前处理：红葡萄酒中加入六氟丁醇，振荡，离心提取待测样品；（2）标准溶液的配制；（3）将待测样品进行HPLC检测，进行定量和定性分析。本前处理方法具有操作简单，耗时短，不使用易挥发有毒有害溶剂且灵敏度高等优点。

Description

一种基于六氟丁醇作萃取剂的检测红葡萄酒中赭曲霉毒素A 的新方法

技术领域

本发明属于食品检测与食品安全领域，涉及一种基于六氟丁醇作萃取剂的检测红葡萄酒中赭曲霉毒素A的新方法。

背景技术

国内外葡萄酒中OTA的检测方法主要有以免疫学分析方法为基础的快速分析方法和以色谱法、色谱-质谱法为代表的仪器分析方法两大类（胡文尧等，2020）。CN105651915A公开一种葡萄酒中赭曲霉毒素A的检测方法。其主要步骤包括取葡萄酒样品加入甲醇溶液，均质器高速搅拌提取，离心后得上清液，以免疫亲和柱结合玻璃微纤维滤纸处理后，采用液相色谱-四级杆静电场轨道阱质谱法进行检测。CN106908599A公开了基于银纳米粒子与Ru(phen)32+荧光微球间消光作用的免疫层析试纸条，用于快速检测葡萄酒和葡萄汁中污染的赭曲霉毒素A。以Ru(phen)32+荧光微球作为荧光背景信号，其最大激发波长为450nm，将其与OTA检测抗原混匀喷涂在试纸条检测区域；采用SPR吸收峰450nm的球形银纳米粒子与OTA单克隆抗体的复合物作为消光探针。在阳性样品检测时，样品中游离的OTA与固定在检测线上的检测抗原竞争与银探针结合，样品中OTA的含量与结合在检测线上银探针的数量成反比，而与荧光信号强度成正比。免疫学分析方法虽然具有操作简单，耗时短和灵敏度高等优点，但是，由于抗体的性质导致检测的假阳率比较高，重现性较差（桑晓霞等，2019）。

葡萄酒机体成分复杂，干扰物多，高效、稳定而又快速的样品前处理是保障检测结果准确有效的前提。近年来，样品前处理技术得到迅猛发展，主要朝着“绿色”、高效和微型化方向发展，目前，色谱法检测葡萄酒中OTA的研究中常采用的前处理方法主要有固相萃取法（Sun X Y等，2017；Campone L等，2018；Rodriguez-Cabo T等，2016），固相微萃取法（Andrade M A等，2017），分散液液微萃取法（Campone L等，2011），在线免疫亲和固相萃取（蔡伟谊等，2018），QuEChERS法（刘青等，2018）和加速溶剂萃取法（李倩倩等，2009）等。中国专利申请CN106546678A公开了一种葡萄酒中赭曲霉毒素A含量的测定方法，具体步骤为：固相萃取、赭曲霉毒素A标准溶液的配制、高效液相色谱-荧光检测器检测。

固相萃取法具有试验步骤繁琐，有毒有害且有挥发性的有机溶剂用量大等缺点，而免疫亲和柱的价格相对较高，且不能重复使用，试验成本过高，加速溶剂萃取法由于不能除去葡萄酒中的大量杂质，因此，对 OTA 的洗脱不完全，此外，浓缩过程也有损失，造成试验回收率比较低，(王颖等，2014)。固相微萃取法虽然减少了有毒有害且具有挥发性的有机试剂的使用，但是萃取过程中存在吸附-脱附的步骤，比较耗时。QuEChERS萃取过程中需要大量乙腈提取分离，容易对试验操作者和环境造成危害。分散液液微萃取技术在用于基质复杂的样品时需要额外的前处理步骤，萃取过程复杂耗时。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种基于六氟丁醇作萃取剂的检测红葡萄酒中赭曲霉毒素A的新方法，本前处理方法具有操作简单，耗时短，不使用易挥发有毒有害溶剂且灵敏度高等优点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于六氟丁醇作萃取剂的检测红葡萄酒中赭曲霉毒素A的新方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理：红葡萄酒中加入六氟丁醇，振荡，离心提取待测样品；

（2）标准溶液的配制：取赭曲霉毒素A标准品1.0 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为100 mg·L^-1的赭曲霉毒素A标准溶液，逐级稀释10 mg·L^-1，5mg·L^-1，1 mg·L^-1，0.1 mg·L^-1，0.04 mg·L^-1，将相应浓度的混合标准溶液分别添加到红葡萄酒样中，检测后绘制工作曲线；

（3）将待测样品进行HPLC检测，进行定量和定性分析。

优选地，所述样品前处理的过程为：准确量取5 mL 红葡萄酒于10 mL具塞尖底玻璃离心管中，加入200 -400μL六氟丁醇，手动剧烈振荡5s，于3500 r/min下离心10-120 s，六氟丁醇相置于离心管底部，用配有加长针头的注射器取出，得到待测样品。更优选地，所述六氟丁醇的加入量为200μL，离心的时间为30 s。

优选地，所述HPLC检测的条件为：Poroshell120 EC-C₁₈色谱柱 (3.0 mm× 150mm，2.7 μm) ，流动相为V（甲醇）：V（0.1%甲酸）=75：25，采用等度洗脱，流速0.30 mL·min^-1，柱温30℃，进样量10 μL，检测器FLD，激发波长Ex：334 nm，发射波长Em：460 nm。

有益效果

本申请建立了一种快速、准确、方便、使用的检测方法，用于检测和监控葡萄酒中赭曲霉毒素A的含量。

本申请的方法是在葡萄酒前处理的过程中使用六氟丁醇作为萃取剂，振荡后离心，将赭曲霉毒素A萃取出来，前处理过程操作简单，耗时短，不使用易挥发有毒有害溶剂，符合绿色环保的要求。

该方法的精密度高，稳定性好，检出限为0.16 μg/L，定量限为0.54 μg/L。

附图说明

图1为样品测定色谱图；色谱图从下到上依次为：未加标葡萄酒萃取后色谱图；加标葡萄酒萃取后色谱图 (2 μg/L)；加标葡萄酒萃取后色谱图 (20 μg/L)；加标葡萄酒萃取后色谱图 (100 μg/L)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1.1 主要材料与设备

Agilent1260 InfinityⅡ液相色谱仪及工作站，配备真空脱气装置，二元泵，自动进样装置，柱温箱及荧光检测器（美国安捷伦公司），80-2离心机（上海浦东物理光学仪器厂），万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，六氟丁醇（≥95%(GC)），甲醇（色谱级），(以上药品均购于阿拉丁试剂有限公司)，超纯水，葡萄酒(1#、2# 、3# ) (购于济南某大型超市)，分析标准品：赭曲霉毒素A (购于青岛普瑞邦生物工程有限公司)

1.2 标准溶液的配制

标准溶液：取赭曲霉毒素A标准品1.0 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为100 mg·L^-1的赭曲霉毒素A标准溶液，逐级稀释10 mg·L^-1，5 mg·L^-1，1mg·L^-1，0.1 mg·L^-1，0.04 mg·L^-1。

1.3 HPLC检测条件

Poroshell120 EC-C₁₈色谱柱 (3.0 mm× 150 mm，2.7 μm) ，流动相为V（甲醇）：V（0.1%甲酸）=75：25，采用等度洗脱，流速0.30 mL·min^-1，柱温30 ℃，进样量10 μL，检测器FLD，激发波长Ex：334 nm，发射波长Em：460 nm。

1.4 微萃取试验过程

准确量取5 mL 红葡萄酒于10 mL具塞尖底玻璃离心管中，加入200 μL六氟丁醇，手动剧烈振荡5s，于3500 r/min下离心30 s，六氟丁醇相置于离心管底部，用配有加长针头的注射器取出，待测。

2 结果与讨论

2.1 萃取剂体积的选择

试验分别取50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、300 μL和400μL萃取剂（六氟丁醇），考察赭曲霉毒素A的萃取效率，当六氟丁醇为50 μL、100 μL和150 μL时，萃取，离心后置于离心管底部的六氟丁醇量较少，很难取出并达到液相色谱的进样量。当萃取剂用量200 μL及以上时，萃取效率随而萃取剂用量的增加逐渐降低，因此，选择萃取剂用量为200 μL。

2.2萃取时间的选择

在微萃取过程中，萃取时间可以影响萃取效率。本研究首先考察了振荡时间，发现振荡5s之后，样品和六氟丁醇可以充分混合，其次，考察了静置时间在0-20 min时，萃取时间对萃取效率的影响，实验表明：随着静置时间的增加，萃取效率没有明显变化，因此，选择振荡5s后不静置，直接离心分离。

2.3 离心时间的选择

在本微萃取试验中，通过离心使分散在酒相中的萃取剂聚集，并漂置于离心管底部，从而有利于萃取剂与酒相的分离。设定离心速度为 3500 r/min，考察了离心时间( 10、30、60、90和120 s ) 的影响。结果表明，赭曲霉毒素A的萃取效率在30 s时达到最大值，随着离心时间的增加，萃取效率无明显变化。因此，试验选择离心时间为 30 s。

3. 方法学验证

3.1标准工作曲线的制定、方法检出限和定量分析

在本研究选定的最佳条件下，外标法定量。将相应浓度的混合标准溶液分别添加到红葡萄酒样中，按照1.4的方法试验。以添加赭曲霉毒素A标准溶液的红葡萄酒样中赭曲霉毒素A的浓度(x, μg/L)为横坐标，对应色谱峰峰面积(y)为纵坐标，绘制工作曲线，进行回归计算，其线性方程为 y = 30.159 x + 8.3424，线性范围为1-100 μg/L，线性相关系数r 为 0. 9999，说明赭曲霉毒素A在 1-100 μg/L的浓度范围内与其色谱峰面积呈现良好的线性关系，将红葡萄酒萃取检测后得到的赭曲霉毒素A的色谱峰面积代入回归方程，得到样品中赭曲霉毒素A的浓度。以3倍信噪比(S/N=3)计算得到赭曲霉毒素A的检出限为0.16 μg/L，以10倍信噪比(S/N=10)计算得到赭曲霉毒素A的定量限为0.54 μg/L，以萃取富集后赭曲霉毒素A的浓度与样品中赭曲霉毒素A的初始浓度之比，计算得到富集倍数为96.67。

3.2 方法准确度与精密度

以阴性红葡萄酒作为空白基质，在3个不同添加水平下，每个水平重复5次。结果表明：3种红葡萄酒中（1#、2#、3#）赭曲霉毒素A的添加回收率在85.8%～110.2%之间，相对标准偏差(RSD)(n=5)在7.2%～8.5% 之间。该方法有较高的准确度和良好的稳定性，可用于红葡萄酒中生物毒素赭曲霉毒素A的检测。

表1 红葡萄酒中赭曲霉毒素A的测定结果

3.3实际验证

采用上述经过验证的葡萄酒中赭曲霉毒素A含量的测定方法的前处理过程视操作者的熟练程度不同大约在3 min左右，操作简单，耗时短且成本低。

对比例1

将上述方法中的前处理改为固相萃取，采用CN106546678A中采用的方法，试验过程中大量使用易挥发有毒有害有机溶剂，耗时长，固相萃取小柱成本高。

对比例2

采用CN106908599A中采用的方法，试验过程复杂，耗时长，远远超过3 min，且试验成本高。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种基于六氟丁醇作萃取剂的检测红葡萄酒中赭曲霉毒素A的新方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品前处理：准确量取5 mL 红葡萄酒于10 mL具塞尖底玻璃离心管中，加入200 -400μL六氟丁醇，手动剧烈振荡5s，于3500 r/min下离心10-120 s，六氟丁醇相置于离心管底部，用配有加长针头的注射器取出，得到待测样品；

（2）标准溶液的配制：取赭曲霉毒素A标准品1.0 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为100 mg·L^-1 的赭曲霉毒素A标准溶液，逐级稀释10 mg·L^-1，5 mg·L^-1，1 mg·L^-1，0.1 mg·L^-1，0.04 mg·L^-1，将相应浓度的混合标准溶液分别添加到红葡萄酒样中，检测后绘制工作曲线；

（3）将待测样品进行HPLC检测，进行定量和定性分析。

2.根据权利要求1所述的一种基于六氟丁醇作萃取剂的检测红葡萄酒中赭曲霉毒素A的新方法，其特征在于，所述六氟丁醇的加入量为200μL，离心的时间为30 s。

3.根据权利要求1所述的一种基于六氟丁醇作萃取剂的检测红葡萄酒中赭曲霉毒素A的新方法，其特征在于，所述HPLC检测的条件为：Poroshell120 EC-C₁₈色谱柱，尺寸为3.0mm× 150 mm，2.7 μm；流动相甲醇与0.1%甲酸的体积比为75：25，采用等度洗脱，流速0.30mL·min^-1，柱温30℃，进样量10 μL，检测器FLD，激发波长Ex：334 nm，发射波长Em：460 nm。