CN114487187A - 黄绿青霉素的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种黄绿青霉素的检测方法，包括提取、净化和测定。其中，提取包括将待测样品采用乙腈‑水溶液进行离心取上层清液，再加入正己烷离心取下层清液；净化包括将下层清液通过固相萃取柱进行净化，取净化液氮吹干后用乙腈定容得待测液；测定包括采用高效液相色谱‑四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定待测液的峰面积，再与通过外标法制得的黄绿青霉素浓度‑峰面积标准工作曲线进行计算，得待测样品中的黄绿青霉素浓度，固相萃取柱的吸附剂为由二乙烯苯和N‑乙烯基吡络烷酮聚合成的大孔聚合物。本发明的检测方法可获得更洁净的目标萃取物，基质效应得到显著改善，回收率高，测试重现性好，检测准确度高，能够满足痕量的分析要求。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及食品检测技术领域，更加涉及黄绿青霉素的检测方法。
背景技术
黄绿青霉素是常见的真菌毒素之一，具有心脏血管毒性、神经毒性和遗传毒性，对人体健康具有严重影响。霉变的粮食中一般含有黄绿青霉素，且霉变食物中所含的黄绿青霉素是导致克山病的病因。
目前，黄绿青霉素的检测主要集中在粮食中，且涉及到的提取技术主要有液-液萃取法和固相萃取法等；检测技术主要包括胶体金免疫层析法、酶联免疫ELISA试剂盒法、薄层色谱法、液相色谱法等。
采用液-液萃取法和固相萃取法等提取方法，对于复杂基质如调味品中的黄绿青霉素提取仍有不足，杂质干扰明显。检测技术中，薄层色谱法与ELASA法虽然灵敏较高但重复性较差，为半定量方法，且容易出现假阳性。而液相色谱法的灵敏度不高，且多需要衍生化，操作步骤繁琐。液相色谱-串联质谱技术具有更高的选择性和灵敏度，逐渐成为同步检测真菌毒素的主要手段。但普通质谱技术的选择性和分辨率不高，复杂基质中杂质的干扰作用明显，需采用特定的降低杂质干扰的提取纯化技术，且针对黄绿青霉素的检测准确性还有待提高。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于提供一种黄绿青霉素的检测方法，其重现性好，检测准确度高，最低检测限可达0.6μg/kg，能够满足调味品中黄绿青霉素痕量的分析要求。
为实现上述目的，本发明提供了一种黄绿青霉素的检测方法，包括步骤：
(1)提取
将待测样品采用乙腈-水溶液进行离心取上层清液，再加入正己烷离心取下层清液；
(2)净化
将下层清液通过固相萃取柱进行净化，取净化液氮吹干后用乙腈定容得待测液；
(3)测定
采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定待测液的峰面积，再与通过外标法制得的黄绿青霉素浓度-峰面积标准工作曲线进行计算，得待测样品中的黄绿青霉素浓度，
固相萃取柱的吸附剂为由二乙烯苯和N-乙烯基吡络烷酮聚合成的大孔聚合物。
本发明采用的技术方案中，选用由二乙烯苯和N-乙烯基吡络烷酮聚合成的大孔聚合物作为固相萃取柱的吸附剂，前者为亲酯性，后者为亲水性，采用这两者聚合形成的吸附剂，可将杂质吸附而使目标物流出，且不需要平衡和活化可直接上样，因此能够简化和加速萃取流程，此外，与其他萃取产品相比，能够去除95％的常见基质干扰物(例如磷脂、脂肪、盐和蛋白质)，故可获得更洁净的目标萃取物，基质效应得到显著改善，回收率高。采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术对净化后的黄绿青霉素待测样品进行测定，其获取的母离子和碎片离子质量数更精确，重现性好，检测准确度高，最低检测限可达0.6μg/kg，能够满足痕量的分析要求。
较佳的，所述乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比为3～5:1，优选为4:1。
较佳的，所述步骤(3)中对待测液利用高效液相色谱仪采用梯度洗脱程序进行分离，通过梯度洗脱可以使一个复杂待测样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
较佳的，所述高效液相色谱仪采用Thermo Accucore aQ C18色谱柱。
较佳的，所述高效液相色谱仪的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，所述流动相B为含有甲酸的乙酸铵溶液。
较佳的，所述步骤(3)的质谱条件为：采用HESI离子源正离子模式，喷雾电压为3.5kV，毛细管和喷雾温度分别为320℃和250℃，鞘气和辅助气压力分别设为45arb、8arb，S-lens RF电压为50V，喷雾气和碰撞气均为氮气，扫描方式采用FullmS/dd-MS2模式，FullmS一级全扫描范围为100～650m/z，分辨率为70000，自动增益控制AGC、自动注入时间IT分别设为1.0e6和100ms，dd-MS2数据依赖的二级扫描AGC设为1.0e5，分辨率设为17500，最大IT设为60ms，分离窗口设为2.0m/z。
较佳的，所述步骤(3)的质谱条件为：母离子质量数为403.21017m/z，碎片离子质量数为139.03871m/z、83.04883m/z，归一化碰撞能为40％。
较佳的，所述外标法制得的黄绿青霉素浓度-峰面积标准工作曲线为取黄绿青霉素标准物质，用乙腈配制成1.00mg/L的标准储备溶液，置于4℃冰箱冷藏保存，再分别移取适量标准储备溶液用乙腈配制成浓度分别为100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0.2μg/L的标准工作溶液，再用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定各所述标准工作溶液的峰面积，再绘制黄绿青霉素浓度-峰面积标准工作曲线。
较佳的，所述待测样品为调味品，所述调味品为生抽、老抽、蚝油或辣椒酱。
附图说明
图1为实施例1的色谱图。
图2为实施例1的质谱图。
具体实施方式
本发明的检测方法适用于生抽、老抽、蚝油或辣椒酱等调味品中黄绿青霉素的检测，其包括提取、净化、测定三个步骤。
其中，步骤(1)提取包括将待测样品采用乙腈-水溶液进行离心取上层清液，再加入正己烷离心取下层清液。具体可为：称取2.0g调味品样品于50mL离心管中，加入20mL乙腈-水(80:20，v:v)溶液，涡旋混匀后，振荡提取10min，4500r/min离心5min，吸取10mL上层清液至50mL离心管中，在上清液中加入10mL正己烷，涡旋1min，4500r/min离心3min，收集下层清液。
步骤(2)净化包括将下层清液通过固相萃取柱进行净化，取净化液氮吹干后用乙腈定容得待测液。具体可为：对步骤(1)中获得的提取液，移取7mL直接通过Waters OasisPRiME HLB(由二乙烯苯和N-乙烯基吡络烷酮聚合成的大孔聚合物)固相萃取柱，收集净化液，准确移取5mL净化液在40℃下氮吹干，再使用1.0mL乙腈定容，待上机。
步骤(3)测定包括采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定待测液的峰面积，再与通过外标法制得的黄绿青霉素浓度-峰面积标准工作曲线进行计算，得待测样品中的黄绿青霉素浓度。
其中，步骤(3)中高效液相色谱仪采用Thermo Accucore aQ C18色谱柱(2.1mm*150mm，2.6μm)，对待测液利用高效液相色谱仪采用梯度洗脱程序进行分离。高效液相色谱仪的流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为甲醇，流动相B为含有0.1wt.％甲酸的乙酸铵溶液。其中色谱柱柱温为35℃，进样量为5μL，流动相流速为0.3mL/min，梯度洗脱程序如表1所示。
表1梯度洗脱程序
质谱条件为：采用HESI离子源正离子模式，喷雾电压为3.5kV，毛细管和喷雾温度分别为320℃和250℃，鞘气和辅助气压力分别设为45arb、8arb，S-lens RF电压为50V，喷雾气和碰撞气均为氮气，扫描方式采用FullmS/dd-MS2模式，FullmS一级全扫描范围为100～650m/z，分辨率为70000，自动增益控制AGC、自动注入时间IT分别设为1.0e6和100ms，dd-MS2数据依赖的二级扫描AGC设为1.0e5，分辨率设为17500，最大IT设为60ms，分离窗口设为2.0m/z。黄绿青霉素的质谱确证参数为：母离子质量数为403.21017m/z，碎片离子质量数为139.03871m/z、83.04883m/z，归一化碰撞能为40％。
外标法制得的黄绿青霉素浓度-峰面积标准工作曲线为取黄绿青霉素标准物质，用乙腈配制成1.00mg/L的标准储备溶液，置于4℃冰箱冷藏保存，再分别移取适量标准储备溶液用乙腈配制成浓度分别为100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0.2μg/L的标准工作溶液，再用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定各所述标准工作溶液的峰面积，再绘制黄绿青霉素浓度-峰面积标准工作曲线。
为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。
实施例1
一种生抽中黄绿青霉素的检测方法，包括步骤：
(1)提取
称取2.0g生抽样品于50mL离心管中，加入20mL乙腈-水(80:20，v:v)溶液，涡旋混匀后，振荡提取10min，4500r/min离心5min，吸取10mL上层清液至50mL离心管中，在上清液中加入10mL正己烷，涡旋1min，4500r/min离心3min，收集下层清液。
(2)净化
移取7ml上层清液，通过正己烷除酯后通过Waters Oasis PRiME HLB固相萃取柱(萃取柱预先用3ml甲醇活化，5ml水平衡)进行净化，取5ml净化液于40℃下氮吹干后用乙腈定容得待测液，过0.22um滤膜过滤后上机。
(3)测定
采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定待测液的峰面积，再与通过外标法制得的黄绿青霉素浓度-峰面积标准工作曲线进行计算，得待测样品中的黄绿青霉素浓度。
高效液相色谱条件：采用Thermo Accucore aQ C18色谱柱(2.1mm*150mm，2.6μm)，柱温：35℃。流动相A为甲醇，流动相B为含有0.1wt.％甲酸的乙酸铵溶液，进样量为5μl，流速为0.3ml/min，采用表1中的梯度洗脱程序进行色谱分离，其色谱图如图1所示。
质谱条件为：采用HESI离子源正离子模式，喷雾电压为3.5kV，毛细管和喷雾温度分别为320℃和250℃，鞘气和辅助气压力分别设为45arb、8arb，S-lens RF电压为50V，喷雾气和碰撞气均为氮气，扫描方式采用FullmS/dd-MS2模式，FullmS一级全扫描范围为100～650m/z，分辨率为70000，自动增益控制AGC、自动注入时间IT分别设为1.0e6和100ms，dd-MS2数据依赖的二级扫描AGC设为1.0e5，分辨率设为17500，最大IT设为60ms，分离窗口设为2.0m/z。黄绿青霉素的质谱确证参数如图2所示，母离子质量数为403.21017m/z，碎片离子质量数为139.03871m/z、83.04883m/z。
预先采用外标法制得黄绿青霉素浓度-峰面积标准工作曲线。其具体步骤为：取黄绿青霉素标准物质，用乙腈配制成1.00mg/L的标准储备溶液，置于4℃冰箱冷藏保存，再分别移取适量标准储备溶液用乙腈配制成浓度分别为100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0.2μg/L的标准工作溶液，在相同的上述色谱质谱条件下，等体积准确进样，再用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定各所述标准工作溶液的峰面积，再绘制黄绿青霉素浓度-峰面积标准工作曲线为y＝2.65245×105x-5.99355×105，基质效应为0.88，R2为0.99915，说明黄绿青霉素在相应的浓度范围内线性关系良好，其检出限为0.6μg/kg((薄层色谱法检测限为25μg/kg，液相色谱法检测限最低为8μg/kg))，定量限为2.0μg/kg。
对本发明的黄绿青霉素的检测方法进行选择性和确定性测试，其测试过程为：取阴性调味品样品15个，按本发明的样品前处理方法和仪器条件进行检测，考察阴性调味品样品中其他组分对生抽中黄绿青霉素的测定是否存在干扰。从色谱图的结果可得知，其没有杂峰，表明阴性调味品样品中其他组分对黄绿青霉素的定性定量无干扰。
对本发明的黄绿青霉素的检测方法进行回收率和精密度(RSD)测试，其测试过程为：分别在阴性调味品样品中添加3个浓度水平的混合标准溶液，按本发明的条件进行样品处理和测定，平行5次试验，连续测定5天，计算回收率、日内和日间精密度，结果见表2所示。
表2回收率和精密度(RSD)测试
由表2的结果可知，生抽中的黄绿青霉素的回收率为94.8～99.3％，精密度在2.9～7.9％之间。其表明与其他萃取产品相比，本发明选用Waters Oasis PRiME HLB固相萃取柱可获得更洁净的目标萃取物，故回收率高，采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术对净化后的生抽样品进行测定，其获取的母离子和碎片离子质量数更精确，其精密度高。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，但是也并不仅限于实施例中所列，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种黄绿青霉素的检测方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提取
将待测样品采用乙腈-水溶液进行离心取上层清液，再加入正己烷离心取下层清液；
(2)净化
将所述下层清液通过固相萃取柱进行净化，取净化液氮吹干后用乙腈定容得待测液；
(3)测定
采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定所述待测液的峰面积，再与通过外标法制得的黄绿青霉素浓度-峰面积标准工作曲线进行计算，得所述待测样品中的黄绿青霉素浓度，
所述固相萃取柱的吸附剂为由二乙烯苯和N-乙烯基吡络烷酮聚合成的大孔聚合物。
2.根据权利要求1所述的黄绿青霉素的检测方法，其特征在于，所述乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比为3～5:1。
3.根据权利要求1所述的黄绿青霉素的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中对所述待测液利用高效液相色谱仪采用梯度洗脱程序进行分离。
4.根据权利要求3所述的黄绿青霉素的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪采用Thermo Accucore aQ C18色谱柱。
5.根据权利要求3所述的黄绿青霉素的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，所述流动相B为含有甲酸的乙酸铵溶液。
6.根据权利要求1所述的黄绿青霉素的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的质谱条件为：采用HESI离子源正离子模式，喷雾电压为3.5kV，毛细管和喷雾温度分别为320℃和250℃，鞘气和辅助气压力分别设为45arb、8arb，S-lens RF电压为50V，喷雾气和碰撞气均为氮气，扫描方式采用FullmS/dd-MS2模式，FullmS一级全扫描范围为100～650m/z，分辨率为70000，自动增益控制AGC、自动注入时间IT分别设为1.0e6和100ms，dd-MS2数据依赖的二级扫描AGC设为1.0e5，分辨率设为17500，最大IT设为60ms，分离窗口设为2.0m/z。
7.根据权利要求6所述的黄绿青霉素的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的质谱条件为：母离子质量数为403.21017m/z，碎片离子质量数为139.03871m/z、83.04883m/z，归一化碰撞能为40％。
8.根据权利要求1所述的黄绿青霉素的检测方法，其特征在于，所述外标法制得的黄绿青霉素浓度-峰面积标准工作曲线为取黄绿青霉素标准物质，用乙腈配制成1.00mg/L的标准储备溶液，置于4℃冰箱冷藏保存，再分别移取适量标准储备溶液用乙腈配制成浓度分别为100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0.2μg/L的标准工作溶液，再用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定各所述标准工作溶液的峰面积，再绘制黄绿青霉素浓度-峰面积标准工作曲线。
9.根据权利要求1所述的黄绿青霉素的检测方法，其特征在于，所述待测样品为调味品，所述调味品为生抽、老抽、蚝油或辣椒酱。
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