CN114894918B - 一种复杂食品中酸性染料的快速提取净化方法及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复杂食品中酸性染料的快速提取净化方法及检测方法，特点是包括称取待测样品加入水‑甲醇‑氯仿混合提取液，震荡离心得到溶液及残渣，将残渣重复提取一次；合并提取溶液加入氯仿水溶液，离心得到上层水相和下层有机相；取上层水相，加入氯化钠，震荡离心得到上层甲醇层和下层水层；取上层甲醇层待分析的步骤；混合标准溶液组成和基质标准曲线制备的步骤；利用高效液相色谱‑四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪检测复杂食品基质中61中酸性染料的步骤；优点是在保证酸性染料高提取率的同时，最大程度的去除脂溶性化合物和强亲水性化合物的干扰，实现目标化合物的快速提取、净化工作，检测效率高，可操作性强。

Description

一种复杂食品中酸性染料的快速提取净化方法及检测方法

技术领域

本发明涉及酸性染料的检测方法，尤其是涉及一种复杂食品中酸性染料的快速提取净化方法及检测方法。

背景技术

酸性染料是指分子结构中含有1个或多个磺酸根基团(-SO₃)的工业染料，由于具有色泽鲜艳，着色稳定，易溶于水等特点，近年来关于酸性染料在食品中的非法添加事件频发，给人类健康造生了极大的危害。酸性染料分析过程主要涉及前处理技术和仪器分析两方面。前处理过程多采用固相萃取、基质分散固相萃取和直接溶剂萃取等。其中，固相萃取和基质分散固相萃取过程操作复杂，均需经过上样，淋洗，洗脱等常规步骤，操作繁琐，且成本昂贵；同样地，赵延胜等建立的食品中工业染料的分级提取净化体系，前处理需经凝胶渗透色谱进行净化处理，同样耗时较长，不能满足市场快速检测的需求。廖军海等利用酸化甲醇对染发剂中10种酸性染料直接进行萃取，前处理过程没有针对提取液基质属性进行净化处理，对仪器污染较大。

酸性染料常用的仪器分析方法，包括：液相-紫外可见光吸收光谱和液相-三重四极杆质谱等。通过与酸性染料标准物质在保留时间、同位素分布、主要二级碎片及二级质谱图相识度等进行综合比对，即可对目标型酸性染料进行定量分析，无法对食品中新型酸性染料(市售无、或纯度不符合未购买)进性筛查分析。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对不同理化性质的化合物兼容性强，提取效率高的复杂食品中酸性染料的快速提取净化方法及检测方法，该检测方法检测效率高，可操作性强且检测限低。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种复杂食品中酸性染料的快速提取净化方法，包括以下步骤：

(1)称取待测样品按质量体积比1g：2mL的比例加入水-甲醇-氯仿混合提取液，震荡5min，以4500r/min离心5min，得到溶液及残渣，将残渣重复提取一次；

(2)合并提取溶液加入到与混合提取液相同体积的氯仿水溶液，以4500r/min离心5min，得到上层水相和下层有机相；

(3)取上层水相，加入氯化钠，震荡5min，以4500r/min离心5min，得到上层甲醇层和下层水层；

(4)取上层甲醇层，氮吹至<2.0ml，用甲醇定容至2.0ml，过滤膜，待分析。

优选的，步骤(1)中所述的水-甲醇-氯仿混合提取液中水、甲醇和氯仿的体积比为1:2:1。

优选的，步骤(2)中所述的氯仿水溶液中氯仿和水的体积比为1:1。

优选的，步骤(3)中所述的氯化钠的添加量为待测样品质量的40％。

2、一种复杂食品中酸性染料的检测方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理

称取待测样品按质量体积比1g：2mL的比例加入水-甲醇-氯仿混合提取液，震荡5min，以4500r/min离心5min，得到溶液及残渣，将残渣重复提取一次；合并提取溶液加入到与混合提取液相同体积的氯仿水溶液，以4500r/min离心5min，得到上层水相和下层有机相；取上层水相，加入氯化钠，震荡5min，以4500r/min离心5min，得到上层甲醇层和下层水层；取上层甲醇层，氮吹至<2.0ml，用甲醇定容至2.0ml，过滤膜，待分析；

(2)混合标准溶液组成和基质标准曲线制备

A.混合标准溶液组成

酸性染料类包括：酸性绿16，酸性蓝7，酸性金黄G，酸性蓝9，酸性黄17，酸性蓝3，酸性红52，酸性橙20，橙黄II，酸性红18，酸性蓝1，甲基橙，藏花橙G，酸性蓝113，酸性橙Ⅳ，酸性红1，酸性紫43，橙G，酸性蓝74，酸性红27，酸性蓝1，酸性红73，酸性红87，酸性红51，酸性红26，酸性蓝90，直接蓝86，直接蓝6，酸性橙3，铬蓝SE，直接黑38，活性艳蓝KN-R，考马斯亮蓝R250，酸性蓝41，柠檬黄，新红，靛蓝，胭脂红，诱惑红，日落黄，亮蓝，直接黄4，酸性绿5，食品绿3，酸性媒介黑T，酸性红B，酸性黄11，酸性黄2，酸性黄73，酸性黄79，酸性黄151，酸性蓝62，酸性黑1，酸性黑24，酸性橙56，酸性橙6，酸性红9，酸性红94，酸性紫43，酸性绿73，酸性棕282，将标准品分别称取适量，用水溶解后，采用甲醇稀释至10mg/L 的混合标准溶液；

B.基质标准曲线定量：

在空白样品中加入混合标准溶液，浓度范围：0ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，以浓度为横坐标，标准品峰面积为纵坐标，配制混合标准曲线，作为目标物定量的依据；

(3)色谱及质谱条件

A.液相条件：色谱柱Hypersil Gold C₁₈，流动相A：含5mM甲酸铵的甲醇-水溶液，其中甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为5:95，流动相B：含5mM甲酸铵的甲醇-水溶液其中甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为95:5，流速:0.3mL/min，进样量:5.0μL，梯度见下表1:

表1正、负离子模式HPLC洗脱程序

B.质谱条件：质谱在负离子模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z 100-1000，分辨率70,000，自动增益控制目标值5e5；负离子模式2800V，离子传输管温度为320℃，鞘气35L/h，辅助气15L/h，气化室温度380℃；MS采集时间为0.0-20.0min，源内裂解电压为40eV，最大注入时长为250ms，在样品运行前对仪器分别进行正、负离子校正，二级采用自动触发模式，分辨率35,000FWHM，自动增益控制目标值5.0e5，相对碰撞能量范围10-40％，保留时间窗口根据目标物RT±1.0min；

(4)浓度计算方法

样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：X＝2*C*V/m，式中：

X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L；

V—定容体积，单位为mL；

m－试样质量，单位为g。

优选的，所述的水-甲醇-氯仿混合提取液中水、甲醇和氯仿的体积比为1:2:1；所述的氯仿水溶液中氯仿和水的体积比为1:1；所述的氯化钠的添加量为待测样品质量的40％。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种复杂食品中酸性染料的快速提取净化方法及检测方法，采用双重液液萃取技术，选择具有高脂肪、高蛋白质性质的火锅底料、蛋黄酱等作为代表性复杂食品基质。首先，利用水-甲醇-氯仿在一定比例下发生分层的理化性质，最大程度的去除氯仿层(下层)中油脂类化合物的干扰，其次，通过加入硫酸铵盐使得甲醇-水溶液(上层)发生分层进一步排除水溶液中重金属、小分子激素类等亲水性化合物的干扰。因与传统固相萃取净化相比，该方法具有操作简单、检测迅速、重现性好等优点。此外，本文采用的高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱技术与常规三重四级杆质谱的优势在于，已知酸性染料化合物的特征离子碎片--- 磺酸根基团(SO₃ ^-，m/z79.9557)基础上，在全扫描模式下直接采集高精度质量数(分辨率>70000，m/z 200)对待测样品进行定向和非定向检测，通过调高源内裂解电压 (In-source CID)至40eV，直接提取特征碎片离子的高精度质量数，即可实现对已知或未知酸性染料的快速筛查。针对筛查得到的酸性染料化合物，通过Thermo公司的高分辨筛查软件ExactfinderTM进一步进行定性、定量分析。

综上所述，本发明建立了一种辣椒酱、火锅底料等复杂食品基质中酸性染料的快速筛查方法，前处理采用双重液液萃取技术，在保证酸性染料高提取率的同时，最大程度的去除脂溶性化合物和强亲水性化合物的干扰，实现目标化合物的快速提取、净化工作，利用高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪，通过提取全扫描模式下酸性染料特征离子碎片的高精度质量数(m/z 79.9557)，建立了酸性工业染料快速提取净化方法。结果表明，本方法对辣椒酱、火锅底料等复杂食品基质具有较强的适用性，检测的 61种酸性工业染料线性范围在0.01～0.2μg/mL，定量限为0.05mg/kg，加标回收率在 75.2％～95.3％范围，标准偏差小于10％。该方法检测效率高，可操作性强，检测限能满足所有受试目标物并且大大降低了检测成本。

附图说明

图1为酸性染料标准物质特征离子碎片(SO₃ ^-，m/z 79.9557)的提取离子色谱图；

图2为水-甲醇-氯仿所占比例(1:2:1，1:3:1和1:4:1)对6种代表性酸性染料回收率的影响，火锅底料(a)和蛋黄酱(b)；

图3为提取体积(10mL，10mL*2和10mL*3)对6种代表性酸性染料回收率的影响，火锅底料(a)和蛋黄酱(b)。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施例

Q-Exactive四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(赛默飞世尔科技ThermoFisherScientific公司)，配置有H-ESI II源。液相色谱系统为UltiMate3000高压液相色谱带自动进样器。色谱柱为Thermo Hypersil Gold C18柱(2.1mm x 100mm,1.9um)。Milli-Q高纯水发生器(美国Millipore公司)。冷冻离心机(德国SIGMA公司)。漩涡振动器(德国Heldolph公司)。滤膜(DIKMA，Nylon 0.22μm)。

酸性染料标准品购自Sigma和Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥95％。基质样品来自国家残留监控抽样和进出口送检企业。乙酸铵，乙二胺四乙酸二钠，草酸，(均为分析纯) 购自南京化学试剂一厂；色谱纯甲酸(美国Sigma-Aldrich公司)。其他试剂(色谱纯，德国Merck公司)。实验用水为Milli-Q超纯水(18.2ΩM)。

1、双重液液萃取净化流程

根据酸性染料的pKa值及极性范围，以及火锅底料、辣椒酱、蛋黄酱等食品基质所具有的高蛋白、高脂肪属性，选取水-甲醇-氯仿作为样品的提取溶剂。步骤如下：

(1)称取5.0g样品，加入混合提取液水-甲醇-氯仿(1:2:1，v:v:v)10mL，震荡5min，以4500r/min离心5min，得到溶液及残渣，重复提取一次；

(2)合并提取溶液，加入5ml氯仿，5ml水，以4500r/min离心5min，得到水相(上层)和有机相(下层)；

(3)取上层，加入氯化钠2.0g，震荡5min，以4500r/min离心5min，得到甲醇层(上层)和水层(下层)；

(4)取上层，氮吹至<2.0ml，用甲醇定容至2.0ml，过滤膜，待分析。

2、混合标准溶液组成和基质标准曲线制备

A.混合标准溶液组成

酸性染料类包括：酸性绿16，酸性蓝7，酸性金黄G，酸性蓝9，酸性黄17，酸性蓝3，酸性红52，酸性橙20，橙黄II，酸性红18，酸性蓝1，甲基橙，藏花橙G，酸性蓝113，酸性橙Ⅳ，酸性红1，酸性紫43，橙G，酸性蓝74，酸性红27，酸性蓝1，酸性红73，酸性红87，酸性红51，酸性红26，酸性蓝90，直接蓝86，直接蓝6，酸性橙3，铬蓝SE，直接黑38，活性艳蓝KN-R，考马斯亮蓝R250，酸性蓝41，柠檬黄，新红，靛蓝，胭脂红，诱惑红，日落黄，亮蓝，直接黄4，酸性绿5，食品绿3，酸性媒介黑T，酸性红B，酸性黄11，酸性黄2，酸性黄73，酸性黄79，酸性黄151，酸性蓝62，酸性黑1，酸性黑24，酸性橙56，酸性橙6，酸性红9，酸性红94，酸性紫43，酸性绿73，酸性棕282，将上述标准品分别称取适量，用水溶解后，采用甲醇稀释至10mg /L的混合标准溶液。

B.基质标准曲线定量：

在空白样品中加入上述混合标准溶液，浓度范围：0ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，以浓度为横坐标，标准品峰面积为纵坐标，配制混合标准曲线，作为目标物定量的依据；其他检出的酸性工业染料(市售无、或纯度不符合未购买)，则根据化合物结构选择相似标准品，进行相对定量分析。

3、色谱及质谱条件

液相条件：色谱柱Hypersil Gold C18(100mm x 2.1mm,1.9μm)，流动相A：含 5mM甲酸铵的甲醇-水溶液(5:95，v:v)，流动相B：含5mM甲酸铵的甲醇-水溶液(95:5， v:v)，流速:0.3mL/min，进样量:5.0μL，梯度见下表1:

表1正、负离子模式HPLC洗脱程序

质谱条件：质谱在负离子模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z 100-1000(周期时长256ms)，分辨率70,000(m/z 200)，自动增益控制(AGC)目标值5e5；负离子模式2800V，离子传输管温度为320℃，鞘气(N₂)35L/h，辅助气(N₂)15L/h，气化室温度380℃；MS采集时间为0.0-20.0min，源内裂解电压(In-source CID)为40eV，最大注入时长为250ms，在样品运行前对仪器分别进行正、负离子校正。二级采用自动触发模式(dd-MS2)，分辨率35,000FWHM(m/z 200)，自动增益控制(AGC)目标值5.0 e5，相对碰撞能量范围10-40％，保留时间窗口根据目标物RT±1.0min。

4、浓度计算方法

样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：X＝2*C*V/m，式中：

X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L；

V—定容体积，单位为mL；

m－试样质量，单位为g。

5、验证试验(定性、定量分析)

将调高源内裂解电压(In-source CID)至40eV，通过提取全扫描模式下酸性染料特征碎片离子的高精度质量数(m/z 79.9557)，可得知样品中全部酸性染料的分布情况，部分标准物质的提取离子色谱图见图1。通过Thermo公司的高分辨筛查软件 ExactfinderTM对各个化合物进行定性确认，除了质量误差在5ppm以内精确质量数外， ExactfinderTM还提供保留时间、同位素分布、主要二级碎片确认和二级质谱图相识度比对等多种方法，综合判断，以得到准确度定性结果，避免假阳性检测结果的出现。

二、实验结果分析

1、提取溶剂的优化

采用的提取溶剂为水-甲醇-氯仿混合体系。三种溶液在一定比例下，溶液混合均匀，不会发生分层现象，通过进一步调节溶液配比，使其发生主动分层，可有效去除提取液中的干扰成分。酸性染料含有磺酸基团，易溶于水，考虑到食品加工过程中酸性染料与脂肪、蛋白质等深度结合，从而导致使用纯水提取的效果较差，加入部分氯仿溶液则主要是溶解脂肪、蛋白质，将与之结合的酸性染料释放出来，而甲醇的溶解性好、渗透强已经成为食品基质中提取常用溶剂，并可以很好地沉淀样品中的蛋白组分。

实验中尝试了不同比例下水-甲醇-氯仿的分层情况。结果表明：当水溶液占比为1时，提取溶剂中甲醇占比是氯仿的两倍及以上时，溶液呈现均匀态，在高速离心过程中也很难发生分层。本研究通过向空白火锅底料基质和蛋黄酱基质中添加6种代表性酸性染料(酸性红1，酸性绿16，酸性蓝41，酸性蓝90，酸性红26，直接蓝6)，保留时间基本涵盖了上述酸性染料的极性范围。进一步考察了相同提取条件下，水-甲醇-氯仿所占比例为1:2:1(v:v:v)，1:3:1(v:v:v)和1:4:1(v:v:v)时，上述代表性酸性染料的提取效果(以峰面积计)。由图2可知，食品基质中的脂肪和蛋白质经氯仿溶解后，酸性染料释放出来并被甲醇提取，水-甲醇-氯仿所占比例为1:2:1(v:v:v)时，上述代表性酸性染料峰面积值均达到较高水平，但当水-甲醇-氯仿所占比例为，1:3:1(v:v:v)和1:4:1 (v:v:v)时，部分酸性染料峰面积值逐渐降低，可能是由于蛋白质等复杂基质在甲醇中大量沉淀，干扰了酸性染料的提取导致。因此，最终将提取溶剂确定为水-甲醇-氯仿混合体系，水-甲醇-氯仿占比确定为1:2:1(v:v:v)。

2、提取体积的优化

合并上层提取溶液，并添加一定体积的氯仿和纯水溶液，使得水-甲醇-氯仿所占比例调整为2：2：2，经高速离心，混合溶液主动分层为水相(上层)-有机相(下层)，考虑到甲醇与水的互溶性更高，混匀后，酸性染料会随甲醇逐级在两相中进行分配，更多的进入到水相层中，通过弃掉有机相(下层)，可使提取液中含有的脂肪、蛋白质等非极性化合物被清除干净。其中，氯仿和纯水溶液的添加量与提取溶液体积(次数)呈正相关。

试验进一步考察提取体积为10mL，10mL*2和10mL*3时，对待测化合物回收率的影响。同样的，以代表性的6种代表性酸性染料(酸性红1，酸性绿16，酸性蓝41，酸性蓝90，酸性红26，直接蓝6)为例，选择火锅底料和蛋黄酱作为空白基质，通过测定上层水相中目标化合物的含量值来计算回收率。结果表明(图3)，当提取体积为10 mL*2和10mL*3时，回收率趋于稳定，6种代表性化合物在火锅底料(图3a)和蛋黄酱(图3b)中的回收率均平稳地保持在75％以上。从节约氮吹浓缩的时间和成本的角度出发，确定水-甲醇-氯仿(1:2:1，v:v:v)作为洗脱液的洗脱体积为10mL*2。基于此，合并上层提取溶液后，通过依次添加5mL的氯仿和纯水溶液，即可使得水-甲醇-氯仿所占比例接近于2：2：2，高速离心条件下，提取溶液可快速分层为水相(上层)-有机相(下层)，通过弃掉有机相层使得提取液中的脂肪、蛋白质等非极性化合物被萃取除去。

3、盐的添加量对回收率的影响

水相(上层)溶液中包括甲醇溶液和水，考虑到水溶液的存在会导致最后的氮吹浓缩过程大大延长，且为了更好的除掉水溶液中含有的污染物，包括：重金属、小分子激素和水溶性蛋白质等，试验通过加入一定量的硫酸铵盐使得甲醇和水溶液达到分层，通过二次液液萃取达到目标化合物的快速提取、净化、浓缩的目的。目标化合物通过盐析进入到甲醇层中，甲醇挥发性强极易进行浓缩，可大大降低了目标化合物的检出限和定量限，更好的避免假阳性结果的发生。

试验进一步考察硫酸铵盐添加量为0.2g，0.5g，1.0g，1.5g和2.0g时，水相(上层)溶液分层情况。结果表明：添加量为0.2g和0.5g时，溶液未发生分层或分层不明显；添加量为1.0g，水溶液达到饱和态，上层溶液分层明显且清澈透明；当添加量为 1.5g和2.0g时，下层水溶液达到过饱和态并有盐析出，盐析出会使得部分水溶性杂质随目标化合物进入到甲醇层中。从降低仪器污染角度，最终确定硫酸铵盐添加量为1.0g。

4、仪器条件的优化

酸性染料分子结构中具有1个或多个磺酸根基团。ESI^-模式下进行检测时，该类化合物极易丢失钠离子发生电离，并迅速从溶剂中获得H原子结合在磺酸基上，形成一系列[(M-xNa+yH)/(x-y)]^-离子，其中，含有多个磺酸基的以二价准分子离子为基峰。

流动相中加入氨水虽能增加负离子模式下化合物的电离效率，考虑到该类化合物极易发生电离，离子化态的化合物在色谱柱上的保留性变差，因此，试验通过加入甲酸铵缓冲液作为助离子化试剂，该缓冲液既能提供OH^-促进化合物电离，又能提供H⁺，通过取代钠离子迅速结合在磺酸根基团上，促进[(M-xNa+yH)/(x-y)]^-系列离子的形成。

试验进一步考察了甲酸铵缓冲液浓度，包括：1mmol/L，2mmol/L，5mmol/L，10mmol/L和20mmol/L对待测化合物响应值的影响。结果表明，以甲醇-水作为流动相，甲酸铵添加量≥5mmol/L时获得了最优的色谱峰形、分离效果和质谱信号响应。全过程选择梯度洗脱方式，通过优化流动相梯度洗脱条件实现了61种酸性染料的有效洗脱。另外，试验针对5款不同规格、填料的色谱柱进行了比较：包括：1)硅胶键合短链C8官能团色谱柱Hypersil GoldC8柱(2.1mm x 150mm,3.0μm)和ZORBAX Eclipse XDB C8柱(2.1mm x 150mm,3.5μm)；2)硅胶键合中链C18官能团色谱柱ZORBAX Eclipse XDB C18柱(3.0mm x 150mm,1.8μm)，Hypersile Gold C18(100mm x 2.1mm，1.9μm)和Syncronis C18(2.1mm x 150mm,1.7μm)。结果表明，通过优化流动相属性及梯度，硅胶键合中链C18官能团色谱柱均可获得最优的色谱峰形和分离效果 (图1)。

5、加标回收结果分析

将酸性染料标准品添加在不同的样品基质中，采用自动触发模式采集一级色谱图和二级质谱图。利用高通量筛查软件Exactfinder^TM，与目标化合物的理论质量值进行比较，要求精确质量误差低于5*10^-6，同时比对保留时间、同位素分布、主要二级碎片和二级质谱图相识度，综合判断，以得到准确定性结果，避免假阳性结果出现。结果表明，各酸性染料线性范围在0.01～0.2μg/mL，定量限为0.05mg/kg，1倍、2倍和10倍定量限的加标回收率范围78.6％～98.9％，标准偏差在10％以内。本方法对火锅底料、蛋黄酱、辣椒酱等高脂肪、高蛋白食品基质具有较强的适用性，通过双重液液萃取技术可实现酸性染料的快速提取、净化工作。

表2 61种酸性染料在火锅底料，蛋黄酱和辣椒酱中的添加浓度及其回收率的实验数据

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综上所述，本发明基于双重液液萃取技术，通过调控混合溶液发生分层，去除脂溶性化合物和强亲水性化合物的干扰，进而实现目标化合物的快速提取、净化工作，并利用高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(Q-Exactive)，通过调高源内裂解电压(In-source CID)至40eV，采集全扫描模式下酸性染料特征离子碎片的高精度质量数(m/z79.9557)，建立了一种复杂食品中酸性染料的快速提取净化方法。该方法的定量限限满足国内外酸性染料的限量要求，可作为一种快速筛选和确证检测技术广泛使用。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种复杂食品中酸性染料的快速提取净化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)称取待测样品按质量体积比1g：2mL的比例加入水-甲醇-氯仿混合提取液，震荡5min，以4500r/min离心5min，得到溶液及残渣，将残渣重复提取一次，其中所述的水-甲醇-氯仿混合提取液中水、甲醇和氯仿的体积比为1:2:1，所述的待测样品为火锅底料、辣椒酱或蛋黄酱；

(2)合并提取溶液加入到与混合提取液相同体积的氯仿水溶液，以4500r/min离心5min，得到上层水相和下层有机相，其中所述的氯仿水溶液中氯仿和水的体积比为1:1；

(3)取上层水相，加入氯化钠，震荡5min，以4500r/min离心5min，得到上层甲醇层和下层水层，其中所述的氯化钠的添加量为待测样品质量的40％；

(4)取上层甲醇层，氮吹至<2.0ml，用甲醇定容至2.0ml，过滤膜，待分析。

2.一种复杂食品中酸性染料的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品前处理

称取待测样品按质量体积比1g：2mL的比例加入水-甲醇-氯仿混合提取液，震荡5min，以4500r/min离心5min，得到溶液及残渣，将残渣重复提取一次；合并提取溶液加入到与混合提取液相同体积的氯仿水溶液，以4500r/min离心5min，得到上层水相和下层有机相；取上层水相，加入氯化钠，震荡5min，以4500r/min离心5min，得到上层甲醇层和下层水层；取上层甲醇层，氮吹至<2.0ml，用甲醇定容至2.0ml，过滤膜，待分析，其中所述的水-甲醇-氯仿混合提取液中水、甲醇和氯仿的体积比为1:2:1；所述的氯仿水溶液中氯仿和水的体积比为1:1；所述的氯化钠的添加量为待测样品质量的40％，所述的待测样品为火锅底料、辣椒酱或蛋黄酱；

(2)混合标准溶液组成和基质标准曲线制备

A.混合标准溶液组成

酸性染料类包括：酸性绿16，酸性蓝7，酸性金黄G，酸性蓝9，酸性黄17，酸性蓝3，酸性红52，酸性橙20，橙黄II，酸性红18，酸性蓝1，甲基橙，藏花橙G，酸性蓝113，酸性橙Ⅳ，酸性红1，酸性紫43，橙G，酸性蓝74，酸性红27，酸性蓝1，酸性红73，酸性红87，酸性红51，酸性红26，酸性蓝90，直接蓝86，直接蓝6，酸性橙3，铬蓝SE，直接黑38，活性艳蓝KN-R，考马斯亮蓝R250，酸性蓝41，柠檬黄，新红，靛蓝，胭脂红，诱惑红，日落黄，亮蓝，直接黄4，酸性绿5，食品绿3，酸性媒介黑T，酸性红B，酸性黄11，酸性黄2，酸性黄73，酸性黄79，酸性黄151，酸性蓝62，酸性黑1，酸性黑24，酸性橙56，酸性橙6，酸性红9，酸性红94，酸性紫43，酸性绿73，酸性棕282，将标准品分别称取适量，用水溶解后，采用甲醇稀释至10mg/L的混合标准溶液；

B.基质标准曲线定量：

在空白样品中加入混合标准溶液，浓度范围：0ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，以浓度为横坐标，标准品峰面积为纵坐标，配制混合标准曲线，作为目标物定量的依据；

(3)色谱及质谱条件

A.液相条件：色谱柱HypersilGold C18，流动相A：含5mM甲酸铵的甲醇-水溶液，其中甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为5:95，流动相B：含5mM甲酸铵的甲醇-水溶液其中甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为95:5，流速:0.3mL/min，进样量:5.0μL，梯度见下表1:

表1正、负离子模式HPLC洗脱程序

B.质谱条件：质谱在负离子模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z 100-1000，分辨率70,000，自动增益控制目标值5e5；负离子模式2800V，离子传输管温度为320℃，鞘气35L/h，辅助气15L/h，气化室温度380℃；MS采集时间为0.0-20.0min，源内裂解电压为40eV，最大注入时长为250ms，在样品运行前对仪器分别进行正、负离子校正，二级采用自动触发模式，分辨率35,000FWHM，自动增益控制目标值5.0e5，相对碰撞能量范围10-40％，保留时间窗口根据目标物RT±1.0min；

(4)浓度计算方法

样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：X＝2*C*V/m，式中：

X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L；

V—定容体积，单位为mL；

m－试样质量，单位为g。

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