CN105136946B - 一种定量分析烟叶中12种类黄酮物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量分析烟叶中12种类黄酮物质的检测方法，包括样品前处理、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和测定步骤。本发明基于发明人2014年从烟草的叶和花中鉴定出17种类黄酮物质，其中9种为烟草中首次被鉴定出来，使得建立了其中12种类黄酮物质的定量分析方法，本发明方法的建立对于开展烟草花瓣中类黄酮物质的相关研究具有重要意义。

Description

一种定量分析烟叶中12种类黄酮物质的检测方法

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种定量分析烟叶中12种类黄酮物质的检测方法。

背景技术

类黄酮物质(flavonoids)是指两个苯环通过中央三碳原子相互连接的一系列化合物, 它们广泛分布于植物界，是植物重要的次生代谢产物。类黄酮物质已在很多植物体中被证明与植物的抗虫和抗病相关。同时，黄酮类化合物是一类生物活性很强的化合物，是一种天然的抗氧化剂，在医药、食品等领域具有广泛的应用。烟草中类黄酮化合物（包括类黄酮糖苷及其苷元）还是烟草香味物质的重要前体，其分解产物与烟草的香气质和香气量有关。在烟叶的调制、醇化和燃烧过程中，黄酮类化合物可氧化分解，赋予优雅清香气味，增加香气量，因此，它们对改善烟草制品的品质有着重要的作用。

目前，关于烟草中类黄酮物质的分析检测方法报道较少。1965年，Watanabe 和Wender采用溶剂提取和纸色谱分离的方法从烟草花的雄蕊中分离出芸香苷、山奈酚苷、异槲皮苷、黄芪苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、烟花甙等黄酮类化合物。1992年，Snook等采用液相色谱法系统研究了66种烟草花中的黄酮类物质，发现不同烟草花中黄酮类物质差异很大。2007年，Tao Pang等采用液相色谱串联质谱从烟叶中分离鉴定出芸香苷、山柰酚苷、槲皮苷等化合物。目前，烟草中类黄酮物质的定量分析方法只涉及含量最高的芸香苷（槲皮素-3-O-芸香糖苷）和山奈酚-3-O-芸香糖苷。这主要是由于传统的高效液相色谱法灵敏度较低无法检测到低含量类黄酮物质，部分类黄酮物质之前未被鉴定也是原因之一。随着人们对烟草中类黄酮物质关注的增加，建立一种类黄酮物质全面定量分析方法变得十分必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量分析烟叶中12种类黄酮物质的检测方法。

本发明的目的是这样实现的，包括样品前处理、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和测定步骤，具体包括：

A、样品前处理：将待检样品烟叶研磨、冷冻干燥后置于1~4℃保存备用；

B、供试品溶液的制备：准确称取10.0mg的前处理后的样品，加入1ml的甲醇-氯仿-水提取溶液和200μl的内标溶液，内标溶液为黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水溶液，浓度为1.0μg/mL，经超声处理、离心后取上清液作为供试品溶液；

C、对照品溶液的制备：分别精密称定各标准化合物，即12个标准样品和3个内标物黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，得到1mg/ml的类黄酮单标溶液，分别移取100μl 1mg/ml的低浓度类黄酮单标溶液以及10mg/ml的高浓度类黄酮单标溶液于100ml容量瓶中，以样品提取溶液，即甲醇-氯仿-水提取溶液定容制备得到标准混合溶液，以样品提取溶液逐级稀释标准混合溶液，制成低浓度类黄酮物质浓度为1000、600、400、100、60、40、10、6、4、1ng/mL，体积为1mL的标准溶液梯度；此梯度对应的高浓度标准溶液梯度为100、60、40、10、6、4、1、0.6、0.4、0.1μg/mL；在上述所有浓度梯度的溶液中加入200μl的内标溶液得到对照品溶液，内标溶液为黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水溶液，浓度为1.0μg/mL；

D、测定：经色谱质谱分析，以待测12个类黄酮化合物的含量为横坐标，以其对应的色谱峰面积与内标化合物的色谱峰面积的比值为纵坐标，建立工作曲线，对校正数据进行线性回归，求得类黄酮物质的回归方程，试样中类黄酮物质的含量按下式进行计算：

式中：c为烟草花瓣样品中类黄酮物质的含量，单位μg/g；

x为仪器测得的萃取液的浓度，单位为μg/mL。

本发明基于发明人2014年从烟草的叶和花中鉴定出17种类黄酮物质，其中9种为烟草中首次被鉴定出来，使得建立了其中12种类黄酮物质的定量分析方法，本发明方法的建立对于开展烟草花瓣中类黄酮物质的相关研究具有重要意义。

附图说明

图1为本发明烟叶样品的类黄酮物质分离色谱图；

图中：①~编号的色谱图对应的化合物依次为槲皮素-3-O-芸香苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、二氢槲皮素、柚皮素-7-O-葡萄糖、二氢山奈酚、木樨草素、槲皮素、异鼠李素；

图2为本发明烟叶样品的类黄酮物质分离总离子流色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的定量分析烟叶中12种类黄酮物质的检测方法，包括样品前处理、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和测定步骤，具体包括：

A、样品前处理：将待检样品烟叶研磨、冷冻干燥后置于1~4℃保存备用；

B、供试品溶液的制备：准确称取10.0mg的前处理后的样品，加入1ml的甲醇-氯仿-水提取溶液和200μl的内标溶液，内标溶液为黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水溶液，浓度为1.0μg/mL，经超声处理、离心后取上清液作为供试品溶液；

C、对照品溶液的制备：分别精密称定各标准化合物，即12个标准样品和3个内标物黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，得到1mg/ml的类黄酮单标溶液，分别移取100μl 1mg/ml的低浓度类黄酮单标溶液以及10mg/ml的高浓度类黄酮单标溶液于100ml容量瓶中，以样品提取溶液，即甲醇-氯仿-水提取溶液定容制备得到标准混合溶液，以样品提取溶液逐级稀释标准混合溶液，制成低浓度类黄酮物质浓度为1000、600、400、100、60、40、10、6、4、1ng/mL，体积为1mL的标准溶液梯度；此梯度对应的高浓度标准溶液梯度为100、60、40、10、6、4、1、0.6、0.4、0.1μg/mL；在上述所有浓度梯度的溶液中加入200μl的内标溶液得到对照品溶液，内标溶液为黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水溶液，浓度为1.0μg/mL；

D、测定：经色谱质谱分析，以待测12个类黄酮化合物的含量为横坐标，以其对应的色谱峰面积与内标化合物的色谱峰面积的比值为纵坐标，建立工作曲线，对校正数据进行线性回归，求得类黄酮物质的回归方程，试样中类黄酮物质的含量按下式进行计算：

式中：c为烟草花瓣样品中类黄酮物质的含量，单位μg/g；

x为仪器测得的萃取液的浓度，单位为μg/mL。

A步骤中所述的研磨是将待检样品烟叶放入研钵，加液氮冷冻，研磨粉碎。

A步骤中所述的甲醇-氯仿-水提取溶液的体积配比为5:2:2。

D步骤中所述的色谱分析条件为：色谱柱，Waters BEH C18（15cm×2.1mm，1.7μm粒径）；A相，水；B相，乙腈，两相均添加0.1%的甲酸和0.2mmol/L的醋酸铵；流动性梯度，0-1min，10%B；1-9min, 10%B-90%B；9-11min，90%B-100%B；11-11.1min，100%B-10%B；11.1-13min，保持10%B；柱温30℃，进样量2μL，流速0.25mL/min。

D步骤中所述的质谱分析条件为：离子源，电喷雾电离离子源；喷雾电压，-4000V；帘气压力，40psi；离子源温度，700℃；辅助气1，60psi；辅助气2，50psi；去簇电压，-100V；化合物定量离子及能量见表1，

表1 类黄酮物质分析质谱定量离子及碰撞能量

下面以实施例对本发明作进一步说明：

实验试剂及装置：

乙腈（色谱级）、甲醇（色谱级）、乙醇（色谱级）购买于德国Merck公司。超纯水由Millipore纯化系统制备。二氢山奈酚、二氢槲皮素、槲皮素、芸香苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷等标准物质以及黄豆苷元、染料木苷（葡萄糖基）、橙皮苷（芸香糖基）等内标物质购买于Sigma-Aldrich，Alfa Aesar 和百灵威公司。Waters UPLC液相色谱仪（美国），AB SCIEX 5500三重四极杆质谱仪（美国)。SB-50D超声波提取仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Waters BEH C18（15cm×2.1 mm, 1.7μm粒径）反相色谱柱（Waters, USA），MILLI-Q纯水机（MILLIPORE公司），LD5-2A离心机（北京京立离心机有限公司），涡旋混匀器（荷兰Breda公司）； CP2245分析天平（感量0.0001g，德国Sartorious公司）。

实施例1

——烟草栽培品种K326中烟叶类黄酮物质的定量分析

实验材料：新鲜冻干的K326成熟期中部烟叶。

实验方法：

准确称取10.0 mg的冻干烟叶样本，加入1mL 提取剂（甲醇-氯仿-水，5:2:2，体积比）和200 μL内标溶液（1.0μg/mL），超声30min，离心，取上清液转入液相色谱进样小瓶分析。

色谱分析条件：色谱柱，Waters BEH C18（15 cm×2.1mm，1.7μm粒径）；A相，水；B相，乙腈，两相均添加0.1%的甲酸和0.2 mmol/L的醋酸铵；流动性梯度，0-1min，10%B；1-9min, 10%B-90%B；9-11min，90%B-100%B；11-11.1min，100%B-10%B；11.1-13min，保持10%B；柱温30℃，进样量2μL，流速0.25mL/min。

质谱分析条件：离子源，电喷雾电离离子源；喷雾电压，-4000V；帘气压力，40psi；离子源温度，700℃；辅助气1，60psi；辅助气2，50psi；去簇电压，-100V。化合物定量离子及能量见表1，

配制所有标准化合物（见表1，12个标样和3个内标）的1mg/mL的单标溶液（甲醇为溶剂）。分别移取100μL 1mg/mL的低浓度类黄酮单标溶液以及10mL 1mg/mL的高浓度类黄酮单标溶液于100mL 容量瓶，以样品提取溶液(甲醇-氯仿-水，5:2:2，体积比)定容，制成标准混合溶液。以样品提取溶液逐级稀释标准混合溶液，制成低浓度类黄酮物质浓度为1000、600、400、100、60、40、10、6、4、1ng/mL，体积为1mL的标准溶液梯度。此梯度对应的高浓度标准溶液梯度为100、60、40、10、6、4、1、0.6、0.4、0.1μg/mL。在所有浓度梯度的溶液中加入200μL内标混合溶液。内标混合液为黄豆苷元、染料木苷、橙皮苷的水溶液，浓度为1.0 μg/mL。黄豆苷元、染料木苷、橙皮苷分别用于校正无糖基类黄酮苷元、葡萄糖基取代类黄酮和芸香糖基取代类黄酮。在选定的色谱质谱条件下，以待测12个类黄酮化合物的含量为横坐标，以其对应的色谱峰面积与内标化合物的色谱峰面积的比值为纵坐标，建立工作曲线。对校正数据进行线性回归，求得类黄酮物质的回归方程。试样中类黄酮物质的含量，按下式进行计算：

式中：c为烟草花瓣样品中类黄酮物质的含量，单位μg/g；

x为仪器测得的萃取液的浓度，单位为μg/mL。

实验结果：

表2 烟草栽培品种K326中烟叶类黄酮物质的含量

实施例2

——黄花烟草N. rustica中烟叶类黄酮物质的定量分析

实验材料：新鲜冻干的N. rustica成熟期中部烟叶。

实验方法：

准确称取10.0mg的冻干烟叶样本，加入1mL 提取剂（甲醇-氯仿-水，5:2:2，体积比）和200μL内标溶液（1.0μg/mL），超声30min，离心，取上清液转入液相色谱进样小瓶分析。

色谱分析条件：色谱柱，Waters BEH C18（15cm×2.1 mm，1.7μm粒径）；A相，水；B相，乙腈，两相均添加0.1%的甲酸和0.2mmol/L的醋酸铵；流动性梯度，0-1min，10%B；1-9min, 10%B-90%B；9-11min，90%B-100%B；11-11.1min，100%B-10%B；11.1-13min，保持10%B；柱温30℃，进样量2μL，流速0.25mL/min。

质谱分析条件：离子源，电喷雾电离离子源；喷雾电压，-4000V；帘气压力，40psi；离子源温度，700℃；辅助气1，60psi；辅助气2，50psi；去簇电压，-100V。化合物定量离子及能量见表1；

配制所有标准化合物（见表1，12个标样和3个内标）的1mg/mL的单标溶液（甲醇为溶剂）。分别移取100μL 1mg/mL的低浓度类黄酮单标溶液以及10mL 1 mg/mL的高浓度类黄酮单标溶液于100mL 容量瓶，以样品提取溶液(甲醇-氯仿-水，5:2:2，体积比)定容，制成标准混合溶液。以样品提取溶液逐级稀释标准混合溶液，制成低浓度类黄酮物质浓度为1000、600、400、100、60、40、10、6、4、1ng/mL，体积为1 mL的标准溶液梯度。此梯度对应的高浓度标准溶液梯度为100、60、40、10、6、4、1、0.6、0.4、0.1μg/mL。在所有浓度梯度的溶液中加入200μL内标混合溶液。内标混合液为黄豆苷元、染料木苷、橙皮苷的水溶液，浓度为1.0μg/mL。黄豆苷元、染料木苷、橙皮苷分别用于校正无糖基类黄酮苷元、葡萄糖基取代类黄酮和芸香糖基取代类黄酮。在选定的色谱质谱条件下，以待测12个类黄酮化合物的含量为横坐标，以其对应的色谱峰面积与内标化合物的色谱峰面积的比值为纵坐标，建立工作曲线。对校正数据进行线性回归，求得类黄酮物质的回归方程。试样中类黄酮物质的含量，按下式进行计算：

式中：c为烟草花瓣样品中类黄酮物质的含量，单位μg/g；

x为仪器测得的萃取液的浓度，单位为μg/mL。

实验结果：

表3 黄花烟草N. rustica中烟叶类黄酮物质的含量

试验例1

按照所述的方法进行标准曲线绘制，发现所有化合物的线性相关系数（r ² ）均在0.99以上，说明所建立的方法具有很好的线性响应，适合定量分析。对这些化合物进行定量限和检测限评估，发现不同化合物的检测限和定量限相差较大，其中异鼠李素-3-葡萄糖苷、二氢槲皮素、柚皮素-7-葡萄糖、二氢山奈酚、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷的定量限可达到1.2～5.6ng/mL，而槲皮素-3-O-芸香苷、山奈酚-3-O-芸香苷、木犀草素、槲皮素、异鼠李素等的定量限在0.065～0.4μg/mL之间（见表4）。对类黄酮物质进行重复性考察，发现所考察的类黄酮物质的日内重复性在3.5%～7.4%之间，日间重复性在5.2%～11.4%之间（见表5）。根据类黄酮物质在本实验所测定的11种烟草中的平均浓度，添加平均浓度约50%和100%的标准样品至实际样品中测定方法回收率，结果发现本方法的回收率在86.3%～108.6%之间（见表5）。

表4 类黄酮化合物的校准曲线、检测限和定量限

表5 类黄酮化合物的重复性和回收率

Claims (2)

1.一种定量分析烟叶中12种类黄酮物质的检测方法，其特征在于包括样品前处理、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和测定步骤，具体包括：

A、样品前处理：将待检样品烟叶研磨、冷冻干燥后置于1~4℃保存备用；

B、供试品溶液的制备：准确称取10.0mg的前处理后的样品，加入1mL体积配比为5:2:2的甲醇-氯仿-水提取溶液和200μL的内标溶液，内标溶液为黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水溶液，浓度为1.0μg/mL，经超声处理30min、离心后取上清液作为供试品溶液；

C、对照品溶液的制备：分别精密称定各标准化合物，即12个标准品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，得到1mg/mL的类黄酮单标溶液，分别移取100μL 1mg/mL的类黄酮单标溶液以及10mL 1mg/mL的类黄酮单标溶液于100mL容量瓶中，以样品提取溶液，即甲醇-氯仿-水提取溶液定容制备得到标准混合溶液，以样品提取溶液逐级稀释标准混合溶液，制成类黄酮物质浓度为1000、600、400、100、60、40、10、6、4、1ng/mL的低浓度标准溶液梯度；此梯度对应的高浓度标准溶液梯度为100、60、40、10、6、4、1、0.6、0.4、0.1μg/mL；在上述所有浓度梯度的溶液中加入200μL的内标溶液得到对照品溶液，内标溶液为黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水溶液，浓度为1.0μg/mL；

D、测定：经色谱质谱分析，以待测12个类黄酮化合物的含量为横坐标，以其对应的色谱峰面积与内标化合物的色谱峰面积的比值为纵坐标，建立工作曲线，对校正数据进行线性回归，求得类黄酮物质的回归方程，试样中类黄酮物质的含量按下式进行计算：

式中： 为烟叶样品中类黄酮物质的含量，单位μg/g；

x为供试品溶液的浓度，单位为μg/mL；

色谱分析条件为：色谱柱，Waters BEH C18 15cm×2.1mm，1.7μm粒径；A相，水；B相，乙腈，两相均添加0.1%的甲酸和0.2mmol/L的醋酸铵；流动性梯度，0-1min，10%B；1-9min, 10%B-90%B；9-11min，90%B-100%B；11-11.1min，100%B-10%B；11.1-13min，保持10%B；柱温30℃，进样量2μL，流速0.25mL/min；

质谱分析条件为：离子源，电喷雾电离离子源；喷雾电压，-4000V；帘气压力，40psi；离子源温度，700℃；辅助气1，60psi；辅助气2，50psi；去簇电压，-100V；化合物定量离子及碰撞能量见表1，

表1 类黄酮物质分析质谱定量离子及碰撞能量

。

2.根据权利要求1所述的定量分析烟叶中12种类黄酮物质的检测方法，其特征在于A步骤中所述的研磨是将待检样品烟叶放入研钵，加液氮冷冻，研磨粉碎。