CN114184708A - 一种食品中蛇形菌素的检测方法和应用 - Google Patents

一种食品中蛇形菌素的检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品检测技术领域，公开了一种食品中蛇形菌素的检测方法和应用。所述检测方法采用乙腈‑水溶液和正己烷对食品中的蛇形菌素进行提取；使用Waters Oasis PRiME HLB固相萃取柱对提取后的样品进行净化，再采用C18色谱柱和甲醇‑乙酸铵溶液通过梯度洗脱程序洗脱，经高效液相色谱‑四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱的电喷雾离子源正离子扫描模式检测，dd‑MS2模式下利用二级碎片离子信息、一级母离子精确质量数和保留时间对蛇形菌素进行确证，并通过外标法定量。本发明的方法适用于食品中蛇形菌素的测定，具有基质效应低、检测准确可靠、回收率高的优点。

Description

一种食品中蛇形菌素的检测方法和应用
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种食品中蛇形菌素的检测方法和应用。
背景技术
真菌毒素是由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒次生代谢产物，目前已知的真菌毒素有400多种。蛇形菌素是真菌毒素的一种，又称二乙酰镳草镰刀菌烯醇，属于单端孢多霉烯毒素，主要由镳草镰刀菌和木贼镰刀菌产生。蛇形菌素主要污染谷物和饲料，其对动物的毒性要高于呕吐毒素，能够损害动物骨髓等造血器官，持续减少白细胞，还可使脑与中枢神经细胞变性，淋巴结、睾丸与胸腺受损害。欧盟食品安全局食品链中污染物专家组也评估了在食品和饲料中蛇形菌素对人类和动物存在的健康风险。最高的急性膳食暴露量和慢性膳食暴露量估计分别为每天0.8μg/kg体重和0.49μg/kg体重。因此，食品中蛇形菌素的检测和监控尤为必要。
目前，食品中蛇形菌素等真菌毒素的提取技术主要有凝胶渗透色谱法、SPE法、液-液萃取法、固相萃取法等，但是这些方法对于复杂基质中的蛇形菌素提取仍有不足，杂质干扰明显。食品中蛇形菌素等真菌毒素的检测技术主要包括胶体金免疫层析法、酶联免疫ELISA试剂盒法、免疫亲和柱-高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法等。其中薄层色谱法与ELASA法虽然灵敏较高但重复性较差，为半定量方法，且容易出现假阳性。而气相色谱法和液相色谱法的灵敏度不高，且多需要衍生化，操作步骤繁琐。液相色谱-串联质谱技术具有更高的选择性和灵敏度，逐渐成为同步检测真菌毒素的主要手段。但普通质谱技术的选择性和分辨率不高，复杂基质中杂质的干扰作用明显，需采用特定的降低杂质干扰的提取纯化技术，且针对蛇形菌素的检测准确性还有待提高。
专利CN111896738A公开了一种检测蛇形菌素的试纸条及其应用。该发明的蛇形菌素快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及竞争抑制免疫层析分析技术，将蛇形菌素单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的蛇形菌素在流动过程中，与结合物释放垫上的蛇形菌素单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的蛇形菌素半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合蛇形菌素单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有蛇形菌素残留。专利CN110007043A公开了谷物中9种真菌毒素的检测方法，包括以下步骤：取谷物样品，粉碎后过筛，得到谷物样品粉末；将乙腈与水混匀后作为提取液加入到谷物样品粉末中，涡旋提取后离心，收集上清液；取上清液注入EP管中，涡旋振荡后离心，将上层清液吸出后用氮气吹干，吹干后的残渣溶解后过滤，收集滤液，作为待测样品提纯液；将待测样品提纯液注入液相色谱仪，采用液相色谱-质谱联用进行检测。专利CN109001350A公开了同时检测粮谷中21种真菌毒素的液相色谱-串联质谱方法，其样品前处理包括将粮食样品经高速粉碎机粉碎后，加入含有1％乙酸的乙腈溶液提取，离心后取上清液用多壁碳纳米管吸附杂质进行净化。专利CN106770836A公开了一种同时检测谷物中多种真菌毒素的方法，包括用含酸的乙腈-水溶液对待测谷物样品进行提取，盐析净化，离心，膜滤，得样品分析液；利用超高效液相色谱串联质谱方法进行同时检测多种真菌毒素。
上述现有技术采用的是胶体金免疫层析法及液相色谱-普通质谱联用检测，仍存在上述提到的缺陷。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种食品中蛇形菌素的检测方法。本发明检测方法利用WatersOasisPRiMEHLB作为反相固相萃取吸附剂，能够简化和加速固相萃取流程，同时较其他样品前处理方法能获得更洁净的萃取物；进而采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术对提取净化后的样品进行测定，具有基质效应低、回收率高、重现性好等优势，能够满足痕量的分析要求。
本发明的另一目的在于提供一种采用上述检测方法在调味品或食用油等食品中蛇形菌素的快速筛查与定量检测中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种食品中蛇形菌素的检测方法，包括如下检测步骤：
(1)样品提取：称取待检样品于离心管中，加入乙腈-水溶液混合振荡提取，离心，吸取上层清液至离心管中，再加入正己烷涡旋除脂，离心，收集下层清液；
(2)样品净化：取步骤(1)中获得的提取液直接通过WatersOasisPRiMEHLB固相萃取柱，收集净化液，准确移取一定量净化液氮气吹干，乙腈定容，得到待测液；
(3)高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定：将步骤(2)处理后的待测液采用ThermoAccucoreaQC18色谱柱和甲醇-乙酸铵溶液的流动相通过梯度洗脱程序分离，然后进入四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定母离子峰面积；
(4)外标法定量：取蛇形菌素标准物质用乙腈配制成1.00mg/L的混合标准储备溶液，然后用乙腈配制成浓度分别为100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0.2μg/L的系列混合标准工作溶液，在与步骤(3)相同的条件下，等体积准确进样，采集不同浓度的标准品色谱图，以母离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，进而通过标准工作曲线计算样品中蛇形菌素的浓度。
进一步优选地，步骤(1)中待检样品取样量为2.0g，乙腈-水溶液的加入量为20mL。
进一步优选地，步骤(1)中所述乙腈-水溶液中乙腈:水的体积比为80:20。
进一步优选地，步骤(1)中所述振荡提取的时间为10min，振荡提取后在4500r/min离心5min。
进一步优选地，步骤(1)中所述吸取上层清液的量为10mL，正己烷的加入量为10mL，涡旋提取的时间为1min，涡旋提取后在4500r/min离心3min。
进一步优选地，步骤(2)中所述样品净化取7mL提取液直接通过WatersOasisPRiMEHLB固相萃取柱，准确移取5mL净化液在40℃下氮气吹干，再使用1.0mL乙腈定容。
进一步优选地，步骤(3)中所述ThermoAccucoreaQC18色谱柱规格为2.1mm×150mm，2.6μm；所述乙酸铵溶液为含0.1wt.％甲酸的0.5mmol/L乙酸铵溶液。
进一步优选地，步骤(3)中所述梯度洗脱程序分离条件为：
色谱柱柱温为35℃，进样量为5μL，流动相流速为0.3mL/min；梯度洗脱程序如下：
0-2.0min，90％A；2.0-3.0min，90％A-80％A；3.0-5.0min，80％A-74％A；5.0-7.0min，74％A；7.0-10.5min，74％A-40％A；10.5-13.5min，40％A；13.5-14.5min，40％A-5％A；14.5-17.0min，5％A；17.0-18.0min，95％A；18.0-20.0min，95％A；A相，0.5mmol/L乙酸铵溶液，含0.1wt.％甲酸；B相：甲醇。
进一步优选地，步骤(3)中所述四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定条件如下：
采用HESI离子源正离子模式，喷雾电压为3.5kV，毛细管和喷雾温度分别为320℃和250℃；鞘气和辅助气压力分别设为45、8arb，S-lensRF电压为50V；喷雾气和碰撞气均为氮气；扫描方式采用FullMS/dd-MS2模式。FullMS一级全扫描范围为m/z100-650，分辨率为70000，自动增益控制AGC、自动注入时间IT分别设为1.0e6和100ms；dd-MS2数据依赖的二级扫描AGC设为1.0e5，分辨率设为17500，最大IT设为60ms，分离窗口设为2.0m/z，各化合物的归一化碰撞能量(NCE)设为20％、40％、60％，动态排除设为8s。
一种采用上述检测方法在调味品(包括但不限于生抽、老抽、蚝油、辣椒酱等)或食用油等食品中蛇形菌素的快速筛查与定量检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明针对调味品等食品的复杂样品基质特性，首次使用WatersOasisPRiMEHLB作为反相固相萃取吸附剂，能够简化和加速固相萃取流程，同时较其他样品前处理方法能获得更洁净的萃取物，基质效应得到显著改善，回收率高。
(2)本发明首次采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术对食品中的蛇形毒素进行检测，并首次确定了四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定条件，重现性好，检测准确度高，最低检测限可达0.3μg/kg，能够满足痕量的分析要求。
附图说明
图1为实施例中不同提取溶剂对蛇形菌素提取回收率的影响对比图；
图2为实施例中不同净化柱对蛇形菌素回收率的影响对比图；
图3为实施例中PRiMEHLB柱净化过程对基质效应的影响结果图；
图4为实施例中蛇形菌素的提取离子色谱图。
图5为实施例中蛇形菌素的二级质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例为调味品中蛇形菌素的测定：
(1)提取和净化
称取2.0g调味品样品(包括但不限于生抽、老抽、蚝油、辣椒酱等，本实施例选用生抽)于50mL离心管中，加入20mL乙腈-水(80:20，v:v)溶液，涡旋混匀后，振荡提取10min，4500r/min离心5min，吸取10mL上层清液至50mL离心管中，在上清液中加入10mL正己烷，涡旋1min，4500r/min离心3min，收集下层清液。移取7mL正己烷除脂后的溶液直接通过PRiMEHLB固相萃取柱(固相萃取柱应预先用3mL甲醇活化，5mL水平衡)，收集净化液，准确移取5mL净化液在40℃下氮吹干，再使用1.0mL乙腈定容，过0.22μm滤膜过滤后上机。
在提取净化过程中，对比了不同提取溶剂(甲醇、乙腈、80％甲醇-水、80％乙腈-水、80％甲醇-水-0.1％甲酸、80％乙腈-水-0.1％甲酸)对蛇形菌素的提取效果，不同净化柱(HLB柱和PRiMEHLB柱)对提取液的净化效果，以及采用PRiMEHLB柱净化对基质效应的影响，结果见附图1～3。可以看出，采用80％乙腈-水-0.1％甲酸提取，PRiMEHLB柱净化，蛇形菌素的提取回收率显著优于其他组，且基质效应显著改善。
(2)色谱分离与质谱检测条件
色谱条件：色谱柱为ThermoAccucoreaQC18(2.1mm×150mm，2.6μm)。柱温：35℃；流动相：A相，0.5mmol/L乙酸铵溶液(含0.1％甲酸)；B相：甲醇；梯度洗脱程序：0-2.0min，90％A；2.0-3.0min，90％A-80％A；3.0-5.0min，80％A-74％A；5.0-7.0min，74％A；7.0-10.5min，74％A-40％A；10.5-13.5min，40％A；13.5-14.5min，40％A-5％A；14.5-17.0min，5％A；17.0-18.0min，95％A；18.0-20.0min，95％A；进样量：5μL；流速：0.3mL/min。
质谱条件：QExactiveFocus质谱系统配有HESI离子源，采用正离子模式，喷雾电压为3.5kV，毛细管和喷雾温度分别为320℃和250℃。鞘气和辅助气压力分别设为45、8arb，S-lens RF电压为50V。喷雾气和碰撞气均为氮气。使用校正溶液，每7天校正1次质量轴。扫描方式采用FullMS/dd-MS2模式。FullMS一级全扫描范围为m/z100-650，分辨率为70000，自动增益控制AGC、自动注入时间IT分别设为1.0e6和100ms；dd-MS2数据依赖的二级扫描AGC设为1.0e5，分辨率设为17500，最大IT设为60ms，分离窗口设为2.0m/z，各化合物的归一化碰撞能量(NCE)设为20％、40％、60％，动态排除设为8s。
经上述方法测定蛇形菌素的提取离子色谱图如图4所示，蛇形菌素的二级质谱图如图5所示。蛇形菌素的质谱确证参数见表1。
表1蛇形菌素的质谱确证参数
Figure BDA0003422303080000061
(3)外标法定量
精密量取蛇形菌素标准物质适量，用乙腈配制成1.00mg/L的混合标准储备溶液，置于4℃冰箱冷藏保存。再分别移取适量标准储备液用乙腈配置成浓度分别为100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0.2μg/L的系列混合标准工作溶液。在相同的上述色谱质谱条件下，等体积准确进样，采集不同浓度的标准品色谱图，以母离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。采集调味品样品色谱图，获得样品的母离子峰面积，通过标准曲线计算样品中蛇形菌素的浓度。
(4)选择性和确定性
取阴性调味品样品20个，按本发明的样品前处理方法和仪器条件进行检测，考察样品中其他组分对待测物的测定是否存在干扰。结果表明，试样溶液中的共存物质对蛇形菌素的定性定量无干扰。
(5)线性关系、检出限和基质效应
蛇形菌素的线性回归方程、相关系数、检出限、定量限和基质效应见表2。可见，蛇形菌素在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.99907。检出限为0.3μg/kg，定量限为1.0μg/kg，基质效应为0.92。
表2检测方法的线性关系、检出限和基质效应
Figure BDA0003422303080000071
(6)方法回收率、准确度和精密度
方法回收率、准确度和精密度通过阴性样品的添加回收试验进行考察。即分别在阴性调味品样品中添加3个浓度水平的混合标准溶液，按本发明的条件进行样品处理和测定，平行5次试验，取中间添加浓度连续测定5天，计算回收率、日内和日间精密度，结果见表3。可见，在3个加标浓度下，蛇形菌素的加标回收率为95.7％-106.2％，精密度在3.8％-7.1％之间，表明本发明的方法具有较满意的回收率，良好的准确度和精密度。
表3回收率和精密度结果
Figure BDA0003422303080000072
实施例2
本实施例为食用油中蛇形菌素的测定：
(1)提取和净化
称取2.0g食用油样品于50mL离心管中，加入20mL乙腈-水(80:20，v:v)溶液，涡旋混匀后，振荡提取10min，4500r/min离心5min，吸取10mL上层清液至50mL离心管中，在上清液中加入10mL正己烷，涡旋1min，4500r/min离心3min，收集下层清液。移取7mL正己烷除脂后的溶液直接通过PRiMEHLB固相萃取柱(固相萃取柱应预先用3mL甲醇活化，5mL水平衡)，收集净化液，准确移取5mL净化液在40℃下氮吹干，再使用1.0mL乙腈定容，过0.22μm滤膜过滤后上机。
(2)色谱分离与质谱检测条件
色谱条件：色谱柱为ThermoAccucoreaQC18(2.1mm×150mm，2.6μm)。柱温：35℃；流动相：A相，0.5mmol/L乙酸铵溶液(含0.1％甲酸)；B相：甲醇；梯度洗脱程序：0-2.0min，90％A；2.0-3.0min，90％A-80％A；3.0-5.0min，80％A-74％A；5.0-7.0min，74％A；7.0-10.5min，74％A-40％A；10.5-13.5min，40％A；13.5-14.5min，40％A-5％A；14.5-17.0min，5％A；17.0-18.0min，95％A；18.0-20.0min，95％A；进样量：5μL；流速：0.3mL/min。
质谱条件：QExactiveFocus质谱系统配有HESI离子源，采用正离子模式，喷雾电压为3.5kV，毛细管和喷雾温度分别为320℃和250℃。鞘气和辅助气压力分别设为45、8arb，S-lensRF电压为50V。喷雾气和碰撞气均为氮气。使用校正溶液，每7天校正1次质量轴。扫描方式采用FullMS/dd-MS2模式。FullMS一级全扫描范围为m/z100-650，分辨率为70000，自动增益控制AGC、自动注入时间IT分别设为1.0e6和100ms；dd-MS2数据依赖的二级扫描AGC设为1.0e5，分辨率设为17500，最大IT设为60ms，分离窗口设为2.0m/z，各化合物的归一化碰撞能量(NCE)设为20％、40％、60％，动态排除设为8s。蛇形菌素的质谱确证参数见表1。
(3)外标法定量
精密量取蛇形菌素标准物质适量，用乙腈配制成1.00mg/L的混合标准储备溶液，置于4℃冰箱冷藏保存。再分别移取适量标准储备液用乙腈配置成浓度分别为100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0.2μg/L的系列混合标准工作溶液。在相同的上述色谱质谱条件下，等体积准确进样，采集不同浓度的标准品色谱图，以母离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。采集食用油样品色谱图，获得样品的母离子峰面积，通过标准曲线计算样品中蛇形菌素的浓度。
(4)选择性和确定性
取阴性食用油样品20个，按本发明的样品前处理方法和仪器条件进行检测，考察样品中其他组分对待测物的测定是否存在干扰。结果表明，试样溶液中的共存物质对蛇形菌素的定性定量无干扰。
(5)线性关系、检出限和基质效应
蛇形菌素的检出限、定量限和基质效应见表4。可见，蛇形菌素在食用油基质样品中的检出限为0.3μg/kg，定量限为1.0μg/kg，基质效应为1.08。
表4检测方法的检出限和基质效应
Figure BDA0003422303080000091
(6)方法回收率、准确度和精密度
方法回收率、准确度和精密度通过阴性样品的添加回收试验进行考察。即分别在阴性调味品样品中添加3个浓度水平的混合标准溶液，按本发明的条件进行样品处理和测定，平行5次试验，取中间添加浓度连续测定5天，计算回收率、日内和日间精密度，结果见表5。可见，在3个加标浓度下，蛇形菌素的加标回收率为93.9％-100.4％，精密度在3.9％-5.1％之间，表明本发明的方法具有较满意的回收率，良好的准确度和精密度。
表5回收率和精密度结果
Figure BDA0003422303080000092
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种食品中蛇形菌素的检测方法，其特征在于，包括如下检测步骤：
(1)样品提取：称取待检样品于离心管中，加入乙腈-水溶液混合振荡提取，离心，吸取上层清液至离心管中，再加入正己烷涡旋除脂，离心，收集下层清液；
(2)样品净化：取步骤(1)中获得的提取液直接通过Waters Oasis PRiME HLB固相萃取柱，收集净化液，准确移取一定量净化液氮气吹干，乙腈定容，得到待测液；
(3)高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定：将步骤(2)处理后的待测液采用Thermo Accucore aQ C18色谱柱和甲醇-乙酸铵溶液的流动相通过梯度洗脱程序分离，然后进入四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定母离子峰面积；
(4)外标法定量：取蛇形菌素标准物质用乙腈配制成1.00mg/L的混合标准储备溶液，然后用乙腈配制成浓度分别为100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0.2μg/L的系列混合标准工作溶液，在与步骤(3)相同的条件下，等体积准确进样，采集不同浓度的标准品色谱图，以母离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，进而通过标准工作曲线计算样品中蛇形菌素的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种食品中蛇形菌素的检测方法，其特征在于，步骤(1)中待检样品取样量为2.0g，乙腈-水溶液的加入量为20mL。
3.根据权利要求1所述的一种食品中蛇形菌素的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述乙腈-水溶液中乙腈:水的体积比为80:20。
4.根据权利要求1所述的一种食品中蛇形菌素的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述振荡提取的时间为10min，振荡提取后在4500r/min离心5min。
5.根据权利要求1所述的一种食品中蛇形菌素的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述吸取上层清液的量为10mL，正己烷的加入量为10mL，涡旋提取的时间为1min，涡旋提取后在4500r/min离心3min。
6.根据权利要求1所述的一种食品中蛇形菌素的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述样品净化取7mL提取液直接通过Waters Oasis PRiME HLB固相萃取柱，准确移取5mL净化液在40℃下氮气吹干，再使用1.0mL乙腈定容。
7.根据权利要求1所述的一种食品中蛇形菌素的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述Thermo Accucore aQ C18色谱柱规格为2.1mm×150mm，2.6μm；所述乙酸铵溶液为含0.1wt.％甲酸的0.5mmol/L乙酸铵溶液。
8.根据权利要求1所述的一种食品中蛇形菌素的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述梯度洗脱程序分离条件为：
色谱柱柱温为35℃，进样量为5μL，流动相流速为0.3mL/min；梯度洗脱程序如下：
0-2.0min，90％A；2.0-3.0min，90％A-80％A；3.0-5.0min，80％A-74％A；5.0-7.0min，74％A；7.0-10.5min，74％A-40％A；10.5-13.5min，40％A；13.5-14.5min，40％A-5％A；14.5-17.0min，5％A；17.0-18.0min，95％A；18.0-20.0min，95％A；A相，0.5mmol/L乙酸铵溶液，含0.1wt.％甲酸；B相：甲醇。
9.根据权利要求1所述的一种食品中蛇形菌素的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定条件如下：
采用HESI离子源正离子模式，喷雾电压为3.5kV，毛细管和喷雾温度分别为320℃和250℃；鞘气和辅助气压力分别设为45、8arb，S-lens RF电压为50V；喷雾气和碰撞气均为氮气；扫描方式采用Full MS/dd-MS2模式。Full MS一级全扫描范围为m/z 100-650，分辨率为70000，自动增益控制AGC、自动注入时间IT分别设为1.0e6和100ms；dd-MS2数据依赖的二级扫描AGC设为1.0e5，分辨率设为17500，最大IT设为60ms，分离窗口设为2.0m/z，各化合物的归一化碰撞能量(NCE)设为20％、40％、60％，动态排除设为8s。
10.一种采用权利要求1～9任一项所述的检测方法在调味品或食用油中蛇形菌素的快速筛查与定量检测中的应用。
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