CN112198242A - 一种超高效液相色谱质谱法测定当归中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超高效液相色谱质谱法测定当归中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法，其特征在于，具体包含以下步骤：步骤1、样品制备；步骤2：样品提取；步骤3：免疫亲和萃取富集当归中待测物；步骤4：样品洗脱；步骤5：利用超高效色谱串联三重四级杆质谱上机测定。本发明吸收了免疫亲和萃取良好的富集能力与超高效液相良好的分离能力及较快的分离时间，以及特殊提取溶剂使得检测当归中各类痕量黄曲霉毒素想过显著。本发明通过对提取溶剂、稀释溶剂、液相分离流动相、质谱条件等重要方面均进行了探索和试验。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄曲霉毒素检测方法，尤其涉及一种超高效液相色谱质谱法测定当归中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法，该方法能够时间对不同产地的当归中痕量黄曲霉毒素的高效，准确的检测方法，特别提供一种以正己烷饱和的乙腈提取方式，经免疫亲和固相萃取方式对样品预处理，基于超高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)同时检测当归中黄曲霉毒素类4种生物毒素。
技术背景
黄曲霉毒素(AF)及其产生菌在自然界中分布广泛，有些菌株产生不止一种类型的黄曲霉毒素，自1962年分离出黄曲霉毒素以来，人们对其毒性进行了较深入的研究，发现其毒性属于极毒，其剧烈的毒性比人们熟知的剧毒药氰化钾要强10倍，北京医科大学曾用含20μg/kg黄曲霉毒素的饲料喂大鼠一年后即发肝癌。国外有报道说，AF为1μg/kg时即可诱发癌变，人摄入大剂量的黄曲霉毒素后可出现肝实质细胞坏死、胆管上皮细胞增生、肝脂肪浸润及肝出血等急性病变，前期症状为发烧、呕吐、厌食、黄疸，继而出现腹水，下肢浮肿并很快死亡，而慢性毒性表现为生长障碍，肝脏出现亚急性或慢性损伤，体重减轻，诱发肝癌等。目前已经从各类中药材中检出黄曲霉毒素。随着黄曲霉毒素污染中药材越来越多。因此，有必要建立一种能实现对中药材中痕量黄曲霉毒素的高效，准确检测方法，为中药材质量提供技术支持。
目前，国内和国际有关当归中黄曲霉毒素的检测标准十分有限，在我国现行的2015 版中国药典中，对各类中药材采取的前处理方法统一使用70％甲醇作为提取溶剂，且使用的第一法高效液相-柱后衍生荧光法容易造成假阳性的结果，第二法高效液相串联质谱法最低检测浓度仅为0.04ng/ml，第三法酶联免疫发操作复杂繁琐，灵敏度较低，在一定程度上不能实现快速准确检测。
用于黄曲霉毒素在自然界中分布广泛，各类中药材基质复杂，浓度通常为纳克的水平。这就要求黄曲霉毒素的检测方法不仅要有良好的抗干扰性，同时对于低浓度的检测还需要有较强的灵敏性与可量化性。随着科技的发展，近几年高效液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS)等新技术的开发与应用，更使精确定性定量中药材中黄曲霉毒素变为可能，但是这些方法并不能通用于每一种中药材，不适用于复杂基质的分析检测。
近年来，国内外许多研究人员针对各类中药材中黄曲霉毒素检测技术方法开展了多方面的探索试验。
发明内容
本发明针对现有技术存在的欠缺，目的在于提供一种以免疫亲和固相萃取方式对样品预处理，基于超高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测当归中黄曲霉毒素B1、B2、 G1、G2的方法。
本发明的目的使通过如下技术方案来实现的
一种超高效液相色谱质谱法测定当归中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法，具体包含以下步骤
步骤1、样品制备：对当归进行预处理，对当归进行预处理，称取适量当归在真空干燥箱95-110℃烘烤以除去药材中的水分，冷却后使用中药材粉碎机粉碎，过标准筛 (200-800μm)备用。
步骤2、样品提取：药材过筛之后加入8-10ml的正己烷饱和的乙腈和2-4ml乙腈饱和的正己烷，以防止当归吸附各类黄曲霉毒素；在超声仪(2k-10kHz)中超声提取10-50min，以使提取液充分接触药材增大提取率；离心机中离心3-10min；静置保存。
步骤3、免疫亲和富集当归中待测物：准确量取3-7ml静置过后的下层样品溶液，在氮吹仪下氮吹至干，加入0.5-1.5ml甲醇溶解，再加入10-30ml纯化水，充分混匀。
连接检查免疫亲和萃取系统，调节压力以4-8ml/mi流速加载样液通过免疫亲和柱，待样液全部通过免疫亲和柱后，用纯化水清洗柱子，以除去残留在柱子里的当归提取物，在使1.5-5ml空气通过柱子，以除去柱子中残留的超纯水。
步骤4、样品洗脱：用0.5-1.5ml甲醇以1-2ml/min的流速洗脱待测物；洗脱液体用0.22微米有机相滤膜过滤于2ml棕色进样小瓶中保存待检。
步骤5、利用超高效色谱串联三重四级杆质谱上机测定当归中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。
色谱条件
(1)色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶
(2)流动相：A：0.5-2％醋酸5-7mmol/L乙酸铵溶液
B：甲醇
梯度洗脱：见表1.
(3)流速：0.25-0.32ml/min；进样体积：1-10ul；柱温：22-27℃
(4)碰撞气为氮气
表1 超高效液相色谱梯度洗脱
质谱条件
(1)电离方式：电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)；采用三重四级杆质谱检测；
(2)毛细管电压：2200-2700V；喷嘴电压：1800-2300V；雾化器压力：36-44psi
(3)质谱扫描方式；采用多反应离子检测；各化合物优化的保留时间。MRM离子对，碎裂电压，碰撞能量见表2
表2 4种黄曲霉毒素定性定量离子
与现有技术相比，本发明有益效果在于：
1.在检测技术上，本发明所采用的检测技术具有分离效率高、灵敏度高、选择性和特异性较好的优点，能够有效的去除当归的机制干扰，准确定量当归中黄曲霉毒素含量，达到多组分快速分析的目的。
2.在检测的种类上，随着近年来中药材被黄曲霉毒素污染情况越来越多，通用的前处理方法并不适用于所有中药材及复杂的基质分析。本发明根据当归本身特性，黄曲霉毒素中毒性最大、最容易污染的为研究对象，建立了能够适用于当归的同步检测4种黄曲霉毒素的方法。
3.在检测过程耗时上，本发明经过方法优化，实现一次色谱分离在23min内完成，可满足日常快速检测的需要。
4.在检测效果上，本发明吸收了免疫亲和固相萃取良好的特异性富集能力与超高效液相良好的分离能力以及三重四级杆良好的选择性，使得检测当归中痕量黄曲霉毒素B1、 B2、G1、G2效果显著。本发明通过对提取溶剂、固相萃取净化液、液相分离流动相、主仆条件等重要方面均进行了探索和试验，优化后所有回收率均达到80％以上，最低检测浓度达到0.01ppb。
附图说明
图1为不同提取溶剂中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的回收率。
图2为相同浓度下4种黄曲霉毒素混合标准品总离子流图，横坐标为保留时间，纵坐标为信号强度。
图3为相同浓度下当归中4种黄曲霉毒素混合加标样品选择离子流图。
具体实施例
为了更好的阐明本发明内容，下面结合实例作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
该实施例提供了一种超高效液相色谱质谱法测定当归中黄曲霉毒素B1、B2、G1、 G2的方法，具体包含以下步骤：
步骤1、样品制备：对当归进行预处理，称取适量当归在真空干燥箱烘干以除去药材中的水分，冷却后使用中药材粉碎机粉碎，过标准筛(500μm)备用。
该步骤中，药材当归在粉碎前经过真空干燥箱105℃持续烘烤2小时，充分除去残留在药材中有机农药及水分；粉碎后使其通过500μm的细筛使得药粉更加均匀，从而减小药材不均一带来的检测误差。
步骤2、样品提取：药材过筛之后加入7.5ml的正己烷饱和的乙腈和2.5ml乙腈饱和的正己烷，以防止当归吸附各类黄曲霉毒素；在超声仪中超声提取30min，以使提取液充分接触药材增大提取率；离心机中离心5min；静置保存
该步骤中，正己烷饱和的乙腈及乙腈饱和的正己烷的配置方法为正己烷饱和的乙腈/乙腈饱和的正己烷：取200mL乙腈与200mL正己烷，充分摇匀，超声、静置过夜(或等两相澄清)，上层即为乙腈饱和的正己烷，下层即为正己烷饱和的乙腈；
步骤3、免疫亲和富集当归中待测物：准确量取5ml静置过后的下层样品溶液，在氮吹仪下氮吹至干，加入1ml甲醇溶解，再加入20ml纯化水，充分混匀。
连接检查免疫亲和萃取系统，调节压力以6ml/mi流速加载样液通过免疫亲和柱，待样液全部通过免疫亲和柱后，用纯化水清洗柱子，以除去残留在柱子里的当归提取物，在使3ml 空气通过柱子，以除去柱子中残留的超纯水。
该步骤中，在免疫亲和柱必须放置至室温后，排去保护液至三分之一，富集期间不得放空免疫亲和柱，待样液全部通过亲和柱后，需用两倍体积的纯化水进行冲洗，以便除去残留的药材提取物；氮吹温度为35℃。
步骤4、样品洗脱：用1ml甲醇以1-2ml/min的流速洗脱待测物；洗脱液体用0.22 微米有机相滤膜过滤于2ml棕色进样小瓶中保存待检。
步骤5、利用超高效色谱串联三重四级杆质谱上机测定当归中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。
为了提高离子的信号强度，获得较好的峰型、线性、重现性和灵敏度，本发明尝试对各种仪器参数做了优化，检测条件如下所示：
色谱条件
(1)色谱柱：ZORBAX Eclipse C18 2.1*50mm，1.8μm
(2)流动相：A：1％醋酸5mmol/L乙酸铵溶液
B：甲醇
梯度洗脱：见表1.
(3)流速：0.3ml/min；进样体积：5ul；柱温：25℃
(4)碰撞气为氮气
表1 超高效液相色谱梯度洗脱
质谱条件
(1)电离方式：电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)；采用三重四级杆质谱检测；
(2)毛细管电压：2500V；喷嘴电压：2000V；雾化器压力：40psi
(3)质谱扫描方式；采用多反应离子检测；各化合物优化的保留时间。MRM离子对，碎裂电压，碰撞能量见表2
表2 4种黄曲霉毒素定性定量离子
以下通过一个实例对本发明的技术方案进行补充说明。采用本发明建立的方法对某产地的当归采集六份进行测试，由表3可见，该产地六份当归均未检出黄曲霉毒素B1、 B2、G1、G2，阳性对照含量为1.614-2.04ppb。说明所建立的方法能够满足实际需求。
表3当归中黄曲霉毒素浓度
| 目标物 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 阳性对照 |
| 黄曲霉毒素B<sub>1</sub> | ND | ND | ND | ND | ND | ND | 2.04 |
| 黄曲霉毒素B<sub>2</sub> | ND | ND | ND | ND | ND | ND | 1.614 |
| 黄曲霉毒素G<sub>1</sub> | ND | ND | ND | ND | ND | ND | 1.774 |
| 黄曲霉毒素G<sub>2</sub> | ND | ND | ND | ND | ND | ND | 1.974 |
以下通过一个实例对本发明的技术方案进行补充说明。采用本发明建立的方法对某产地的当归采集六份进行测试，由表3可见，该产地六份当归均未检出黄曲霉毒素B1、 B2、G1、G2，阳性对照含量为1.614-2.04ppb。说明所建立的方法能够满足实际需求。
表3当归中黄曲霉毒素浓度
| 目标物 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 阳性对照 |
| 黄曲霉毒素B<sub>1</sub> | ND | ND | ND | ND | ND | ND | 2.04 |
| 黄曲霉毒素B<sub>2</sub> | ND | ND | ND | ND | ND | ND | 1.614 |
| 黄曲霉毒素G<sub>1</sub> | ND | ND | ND | ND | ND | ND | 1.774 |
| 黄曲霉毒素G<sub>2</sub> | ND | ND | ND | ND | ND | ND | 1.974 |
虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。
Claims (5)
1.一种超高效液相色谱质谱法测定当归中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法，其特征在于，具体包含以下步骤：
步骤1)、样品制备：称取适量当归在真空干燥箱95-110℃下烘烤以除去药材中的水分，冷却后粉碎，过标准筛200-800μm以均匀中药材，减少称量均匀度问题；
步骤2)、样品提取：药材过筛之后加入8-10ml的正己烷饱和的乙腈和2-4ml乙腈饱和的正己烷，以防止当归吸附各类黄曲霉毒素；在超声仪2k-10kHz中超声提取10-50min，以使提取液充分接触药材增大提取率；离心机中离心3-10min；静置保存；
步骤3)、免疫亲和富集当归中待测物：准确量取3-7ml静置过后的下层样品溶液，在氮吹仪下氮吹至干，加入0.5-1.5ml甲醇溶解，再加入10-30ml纯化水，充分混匀；
连接检查免疫亲和萃取系统，调节压力以4-8ml/mi流速加载样液通过免疫亲和柱，待样液全部通过免疫亲和柱后，用纯化水清洗柱子，除去残留在柱子里的当归提取物，在使1.5-5ml空气通过柱子，除去柱子中残留的超纯水；
步骤4)、样品洗脱：用0.5-1.5ml甲醇以1-2ml/min的流速洗脱待测物；洗脱液体用0.22微米有机相滤膜过滤于2ml棕色进样小瓶中保存待检；
步骤5)、利用超高效色谱串联三重四级杆质谱上机测定当归中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。
2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱质谱法测定当归中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的方法，其特征在于，步骤3)中，在免疫亲和柱必须放置至室温后，排去保护液至三分之一，富集期间不得放空免疫亲和柱，待样液全部通过亲和柱后，需用两倍体积的纯化水进行冲洗，以便除去残留的药材提取物；氮吹温度为35℃。
3.根据权利要求1所述的超高效液相色谱质谱法测定当归中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的方法，其特征在于，步骤5)中，检测条件如下：
色谱条件：
(1)色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；
(2)流动相：A：0.5-2％醋酸5-7mmol/L乙酸铵溶液；B：甲醇；
(3)流速：0.2-0.32ml/min；进样体积：1-10μl；柱温：22-27℃；
(4)碰撞气为氮气；
质谱条件：
(1)电离方式：电喷雾离子源，正离子模式；采用三重四级杆质谱检测；
(2)毛细管电压：2200-2700V；喷嘴电压：1800-2300V；雾化器压力：36-44psi；
(3)质谱扫描方式：采用多反应离子检测。
4.根据权利要求3所述的超高效液相色谱质谱法测定当归中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的方法，其特征在于，超高效液相色谱梯度洗脱如下：
5.根据权利要求3所述的超高效液相色谱质谱法测定当归中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的方法，其特征在于，4种黄曲霉毒素定性定量离子
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022262245A1 (zh) * | 2021-06-15 | 2022-12-22 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种水溶性发酵药物中微量黄曲霉毒素分析检测方法 |
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| CN109932467A (zh) * | 2018-08-10 | 2019-06-25 | 烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 超高效液相色谱－四级杆/高分辨质谱法测定花生中黄曲霉毒素和农药残留的方法 |
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