CN103424479B - 莫能菌素、盐霉素和拉沙洛西残留分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于兽药残留分析技术领域，公开了一种羧基化合物聚醚药物氢取代衍生反应高效液相色谱柱前衍生化反应分析方法。所述的聚醚类药物含有羧基基团与荧光试剂1-溴乙酰芘发生反应，产物具有极强的荧光活性。优化反应条件：以18-冠醚-6溶液为相转移催化剂，1-溴乙酰芘溶液作为衍生化试剂，30～70℃水浴150min，待冷却后经高效液相色谱仪检测，衍生产物在激发波长为360nm，发射波长为420nm时有最大的荧光强度，最小检出量为50μg/L，在200～1600μg/L范围内对峰面积呈线性响应，结果重现性良好，3个浓度、15次重复的变异系数小于7.8％，各项指标均能满足莫能菌素、盐霉素和拉沙洛西三种聚醚类药物残留分析的要求。
Description
技术领域
本发明属于兽药残留分析技术领域，与分析化学有关。本发明具体涉及一种聚醚药物莫能菌素、盐霉素和拉沙洛西残留快速检测方法及应用。本发明以聚醚药物18-冠醚-6溶液为相转移催化剂，1-溴乙酰芘溶液作为衍生化试剂，与含羧基的聚醚类药物构建衍生化反应体系，得到测试标样，然后通过高效液相色谱进行分离检测。
背景技术
聚醚类抗生素又称聚醚离子载体类药物(Polyetherionophores)。这类药物具有抗菌和抗球虫的作用，并且能促进动物生长发育和提高饲料转化率等。本类药物主要有莫能霉索(monensin)、盐霉素(salinomycin)、拉沙里菌素(lasalocid)等。其结构在直链碳骨架上，连成多个四氢呋喃、四氢吡喃等含氧杂环；分子一端有一羧基；在结晶状态，分子两端可借助氢键相连而成环状构型；亦可形成多种金属盐，而呈环状结构，具有离子载体性质。其中以前两种药物在国内较为常用。它们对虫体具有选择性作用。其抗虫作用机理可能是通过一般的渗透现象而发挥疗效。本类药物可与碱金属一价或二价阳离子(如钾、钠、钙等离子)形成亲脂性络合物，通过生物膜，，妨碍离子的正常平衡或转运而起作用。聚醚类药物化学结构式如下所示：
虽然聚醚类离子载体抗生素在推荐剂量对肉鸡是安全的，但是中毒事件常有发生。主要是由于使用剂量过大、药物在饲料中混料不均匀而使局部浓度过大或与其他药物联合应用而产生中毒。由于聚醚类抗生素中毒时确诊比较困难，故一旦发生中毒常造成重大的经济损失。为了加强兽药残留监控工作，保证动物性食品卫生安全，我国农业部规定莫能菌素、盐霉素在畜禽肌肉组织中最大残留限量分别为1500μg/kg，600μg/kg，莫能菌素、盐霉素和拉沙里菌素在畜禽类肝脏肾脏组织中的最大残留限量分别为4500μg/kg，1800μg/kg和400μg/kg。欧盟对动物组织及其附属产品中的残留也做了严格的限制。目前国内外关于动物可食性组织中聚醚类药物残留检测方法报道较少。国内有报道了鸡蛋中莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素和拉沙西洛霉素残留总量的方法，动物组织中莫能菌素和盐霉素的LC-MS/MS检测方法，但对于用高效液相色谱测定莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素等药物的报道还较少。因此建立简便、快捷的检测莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素这3种药物的高效液相色谱检测方法非常必要。
1-溴乙酰芘中含有活性溴基团，可以与药物中的羧基相互作用，同时含有荧光基团。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种聚醚药物莫能菌素、盐霉素和拉沙洛西残留快速检测方法及应用。本发明以聚醚药物18-冠醚-6溶液为相转移催化剂，1-溴乙酰芘溶液作为衍生化试剂，与含羧基的聚醚类药物构建衍生化反应体系，得到测试标样，然后通过高效液相色谱进行分离检测。通过荧光分光光度计测定表明，本发明的含羧基的聚醚类药物与溴乙酰芘反应产物的荧光强度高，灵敏度高，反应快速高效、操作简便。
本发明的总体技术方案是：确立羧基化合物标样与溴乙酰芘进行衍生化反应的条件→衍生产物高效液相色谱(HPLC)分离检测方法的建立→样本的分析检测。
本发明衍生化试剂为溴乙酰芘溶液，该物质与含羧基的聚醚类药物发生衍生化反应具有反应速度快、反应产物荧光活性高等特点，在反应温度40～65℃时，反应时间为100～180min，其衍生产物在激发波长：360nm，发射波长：420nm时具有最大的荧光强度。
衍生反应的具体条件为：衍生化反应体系中溴乙酰芘与含羧基的聚醚类药物的最佳摩尔比例为1∶5～10，相转移催化剂为1mg/mL的18-冠醚-6溶液，反应体系最佳pH值3～6，最佳反应温度为40～65℃；最佳反应时间为100～180min。反应方程式如下：
式中：R为莫能菌素、盐霉素或拉沙洛西除去羧基以外的基团。
更详细的发明步骤是：
1、羧基化合物与溴乙酰芘的衍生化反应
将净化后氮气吹干后的样本残渣，加入250μL的18-冠醚-6溶液及250μL的1-溴乙酰芘溶液，混合均匀后，在50℃水浴中衍生化反应150min，待冷却后用高效液相色谱仪检测。
2、衍生产物HPLC测定的优化条件
色谱柱：Waters XBridge C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm；
柱温：30℃；
流动相：水：甲醇(v/v＝3∶97)；
流速：1.0mL/min；
检测器：荧光检测器激发波长：360nm，发射波长：420nm。
本发明的效果是：
本发明克服了液相法柱后反应检测不易找到合适的流动相及反应过程难以控制的缺陷，较现有的检测方法灵敏度提高了10倍，更适合残留痕量分析。
附图说明
图1猪肌肉样品空白色谱图。
图2猪肌肉样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为375，150，100μg/kg)色谱图。
图3猪肌肉样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为750，300，200μg/kg)色谱图。
图4猪肌肉样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为1500，600，400μg/kg)色谱图。
图5猪肝脏样品空白色谱图。
图6猪肝脏样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为1125，450，300μg/kg)色谱图。
图7猪肝脏样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为2250，900，600μg/kg)色谱图。
图8猪肝脏样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为4500，1800，1200μg/kg)色谱图。
图9猪肾脏样品空白色谱图。
图10猪肾脏样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为1125，450，300μg/kg)色谱图。
图11猪肾脏样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为2250，900，600μg/kg)色谱图。
图12猪肾脏样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为4500，1800，1200μg/kg)色谱图。
图13鸡肌肉样品空白色谱图。
图14鸡肌肉样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为375，150，100μg/kg)色谱图。
图15鸡肌肉样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为750，300，200μg/kg)色谱图。
图16鸡肌肉样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为1500，600，400μg/kg)色谱图。
图17鸡肝脏样品空白色谱图。
图18鸡肝脏样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为1125，450，300μg/kg)色谱图。
图19鸡肝脏样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为2250，900，600μg/kg)色谱图。
图20鸡肝脏样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为4500，1800，1200μg/kg)色谱图。
图21鸡肾脏样品空白色谱图。
图22鸡肾脏样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为1125，450，300μg/kg)色谱图。
图23鸡肾脏样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为2250，900，600μg/kg色谱图。
图24鸡肾脏样品添加聚醚类衍生化产物(莫能菌素、盐霉素、拉沙洛菌素分别为4500，1800，1200μg/kg)色谱图。
具体实施方式
实施例1：羧基化合物与溴乙酰芘的衍生化反应
(1)莫能菌素钠，盐霉素钠，拉沙洛西(拉沙里菌素A钠盐)与溴乙酰芘衍生化反应
准确称取适量的莫能菌素钠，盐霉素钠，拉沙洛西(拉沙里菌素A钠盐)对照品100mg，用甲醇溶解至10mL容量瓶中，分别配制成10mg/mL的标准储备液。分别准确吸取莫能菌素钠，盐霉素钠，拉沙洛西(拉沙里菌素A钠盐)标准储备液1500μL，600μL，400μL，至10mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，混匀即得(浓度分别为：1.5mg/mL，0.6mg/mL，0.4mg/mL)。从各容量瓶中取1mL，至10mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，得到分别浓度为150μg/mL，60μg/mL，40μg/mL的混合标准工作液。准确移取标准混合工作液5μL，10μL50μL，100μL，150μL，200μL，用氮气吹干后，将吹干后的残渣，加入250μL的18-冠醚-6溶液和250μL的1-溴乙酰芘溶液，混合均匀后，在50℃水浴中衍生化150min，冷却。
(2)衍生产物HPLC检测
按如下HPLC检测条件进行测定：
色谱柱：Waters XBridge C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm；
柱温：30℃；
流动相：水：甲醇(v/v＝3∶97)；
流速：1.0mL/min；
进样量：50μL，
检测器：荧光检测器激发波长：360nm，发射波长：420nm。
(3)衍生产物检测结果分析
每个浓度重复3次，将测得的峰面积与相对应浓度绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。标准曲线线性结果见表2，各数据表明本发明的分析方法和仪器条件合理可用。
表2标准曲线线性结果
| 药物名称 | 线性范围/(mg/L) | 线性方程 | 相关系数 |
| 莫能霉素 | 0.75～60 | Y＝4013.7x-135026 | 0.9997 |
| 拉沙洛菌素 | 0.2～16 | Y＝79903x-3E+07 | 0.9996 |
| 盐霉素 | 0.3～24 | Y＝3546.3x-2E+06 | 1.0000 |
实施例2：样本测定
(1)样本的处理
选择鸡和猪的肌肉、肝脏、肾脏组织为实验样本，对莫能菌素，盐霉素，拉沙洛菌素进行添加回收实验。在空白样品中加入适量标准溶液，使样品中浓度分别为LOQ、1MRL、2MRL三个浓度(每种药具体浓度如下表)，样品预处理后检测。同一天内每个浓度重复5个样，计算回收率，并取平均值，计算日内变异系数。每种组织重复5天，计算平均回收率。
提取：准确称取新鲜或解冻后的试样(5±0.05)g置于离心管中，再加异辛烷15mL，旋涡混合2min，8000r/min离心10min，取出上清液，在残渣中加异辛烷15mL重复操作一次。合并两次上清液，待净化。
净化：Silica柱上方添加无水硫酸钠1g，用5mL异辛烷活化，加样品提取液至硅胶柱中，控制流速小于2mL/min，用15mL二氯甲烷淋洗，淋洗后抽干，用甲醇-二氯甲烷洗脱液6mL洗脱。洗脱液用40℃左右的氮气吹干，待衍生化。
衍生化：将吹干后的残渣，加入250μL的18-冠醚-6溶液及250μL的1-溴乙酰芘溶液，混合均匀后，在50℃水浴中衍生化150min，待冷却后用高效液相色谱仪检测。
(2)样本的测定
高效液相色谱-荧光检测器检测，按如下检测条件进行测定：
色谱柱：Waters XBridge C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm；
柱温：30℃；
流动相：水：甲醇(v/v＝3∶97)；
流速：1.0mL/min；
进样量：50μL；
检测器：荧光检测器激发波长：360nm，发射波长：420nm。
(3)测定结果分析
经分析可知，本发明对莫能菌素，盐霉素，拉沙洛菌素在鸡、猪肌肉中定量限分别为375，150和100μg/kg，鸡、猪肝脏和肾脏中定量限分别为1125，450和300μg/kg，可以满足残留检测要求。
根据中华人民共和国农业行业标准《动物性食品中兽药残留检测方法标准编制规则》附录A(规范性附录)，组织中药物添加浓度为浓度为10～100μg/kg：回收率70～110％；批内变异系数小于21％，批间变异系数小于32％。浓度为100～1000μg/kg：回收率80～110％；批内变异系数小于17％，批间变异系数小于26％。本发明的三种浓度的变异系数均小于15％以内，符合兽药残留检测规定。
本发明建立畜禽可食性组织样品中的聚醚类残留的检测方法，其方法的灵敏度、准确度和精密度均符合中国农业部规定的兽药残留检测要求。聚醚类药物在目前只有液相色谱串联质谱法及高效液相色谱-柱后衍生的相关标准，还没有聚醚类药物测定的柱前衍生-高效液相色谱法的标准及相关文献报道，本发明的优势是通过衍生化，使聚醚类药物用高效液相色谱荧光检测器就能检测出来。
Claims (1)
1.一种动物性食品中莫能菌素、盐霉素和拉沙洛西药物残留的分析方法，它包括如下步骤：
(1)准确称取新鲜或解冻后的试样5±0.05g置于离心管中，再加异辛烷15mL，旋涡混合2min，8000r/min离心10min，取出上清液，在残渣中加异辛烷15mL重复操作一次，合并两次上清液，待净化；
(2)Silica柱上方添加无水硫酸钠1g，用5mL异辛烷活化，加样品提取液至硅胶柱中，控制流速小于2mL/min，用15mL二氯甲烷淋洗，淋洗后抽干，用甲醇-二氯甲烷洗脱液6mL洗脱，洗脱液用40℃的氮气吹干，待衍生化；
(3)将吹干后的残渣，加入250μL的18-冠醚-6溶液及250μL的1-溴乙酰芘溶液，混合均匀后，在50℃水浴中衍生化150min，冷却；
(4)采用高效液相色谱-荧光检测器对样本进行检测，检测条件如下：
色谱柱：Waters XBridge C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm；
柱温：30℃；
流动相：按v/v计的水与甲醇的比例为3:97；
流速：1.0mL/min；
进样量：50μL；
检测器：荧光检测器激发波长：360nm，发射波长：420nm。
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