CN105784880A

CN105784880A - 用于检测β-受体激动剂的组合检测试剂及其检测方法

Info

Publication number: CN105784880A
Application number: CN201610344800.4A
Authority: CN
Inventors: 李鹰飞
Original assignee: Qingdao Yingkang Food Test Technology Service Co Ltd
Current assignee: Lv Jing
Priority date: 2016-05-23
Filing date: 2016-05-23
Publication date: 2016-07-20
Anticipated expiration: 2036-05-23
Also published as: CN105784880B

Abstract

本发明提供了用于检测β‑受体激动剂的组合检测试剂及其检测方法，所述组合检测试剂包括含有多种β‑受体激动剂对照品的有机溶剂溶液、水解酶以及蛋白沉淀剂。本发明采用液相色谱串联质谱测定法检测。本发明所述组合检测试剂可以同时分析33种β‑受体激动剂，检测范围最广泛；本发明采用水解酶可以将代谢产物水解成原型化合物，提高分析物浓度；样品处理对生物样品中的33种β‑受体激动剂进行净化和富集；本发明具有简便、准确、快速、稳定的优点；所需样本量少，化学试剂使用量小，绿色环保；样品处理无需衍生化等复杂步骤；检测结果不受内源性物质的干扰；假阴性假阳性率低；适用于大量样本的快速分析。

Description

用于检测β-受体激动剂的组合检测试剂及其检测方法

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种用于检测β-受体激动剂的组合检测试剂及其检测方法。

背景技术

β-受体激动剂在动物饲养过程中过量使用的情况下表现为营养再分配效应，尤其是当用药量为治疗剂量的5-10倍时，能改变养分的代谢途径，促进动物肌肉生长，促进动物体蛋白质沉积，特别是骨骼肌中蛋白质的合成，抑制脂肪的合成和积累，促使营养成分由脂肪向肌肉转移，瘦肉可相对增加10％以上。β-受体激动剂易在动物组织，特别是内脏中积聚残留，并通过食物链进入人体。人体中累计摄入剂量超过一定值，或食用β-受体激动剂类浓度较高的内脏组织如肝、肾、或肺时，易出现毒副反应，危害人体健康，造成安全隐患。因此，虽然β-受体激动剂能起到“瘦肉”作用，却对人体健康危害过大，因而它们也在全球遭到禁用。其中，β-受体激动剂中仅雷托巴胺是比较特殊的“瘦肉精”，瘦肉效率非常高，在动物体内几乎不积累，人体试验发现摄入量不超过67μg/kg时，对于人体没有明显损害，约二十个国家允许使用雷托巴胺，但仍有超过一百六十个国家禁止使用该药。其它的“瘦肉精”，则几乎被全世界所有国家禁用。我国禁止任何β-受体激动剂用作动物促生长剂。

目前，关于β-受体激动剂类药物的检测方法已有很多的文献报道，包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、毛细管电泳法、免疫传感器法等。酶联免疫吸附测定法(ELISA)、胶体金免疫层析法、免疫传感器法等生物检测法仅用于大批量样品的筛选，但是却很难分辨样品中的各详细组分，假阴性假阳性率高，灵敏度低或准确性差；现有的高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用、毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用等方法，则存在检测的化合物少，样品使用量大，操作繁琐，耗用化学试剂量大，不环保，检测通量低，分析时间长等问题。

发明内容

针对上述β-受体激动剂检测的现状，本发明的目的是提供了一种用于检测β-受体激动剂的组合检测试剂及其检测方法，本发明提供的组合检测试剂可以检测畜、禽肉、组织及其相关制品和畜、禽尿、唾液等体液生物样品中多达33种β-受体激动剂。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了用于检测β-受体激动剂的组合检测试剂，所述组合检测试剂包括：含有多种β-受体激动剂对照品的有机溶剂溶液、水解酶和蛋白沉淀剂，所述水解酶为β-葡萄糖苷酸酶和/或芳基硫酸酯酶；含有的每种β-受体激动剂对照品在有机溶剂溶液中的浓度均为0.1ng-20ng/mL，所述蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈或乙酸乙酯。

进一步的：所述含有多种β-受体激动剂对照品的有机溶剂溶液为含有33种β-受体激动剂的体积比为50％的甲醇溶液；所述33种β-受体激动剂为沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、班布特罗、特布他林、齐帕特罗、塞曼特罗、西布特罗、溴布特罗、克伦丙罗、妥布特罗、利托君、马喷特罗、喷布洛尔、马布特罗、福莫特罗、阿福特罗、克仑潘特、溴氯布特罗、奥西那林、利妥特灵、苯氧丙酚胺、克仑塞罗、R-美托洛尔、S-美托洛尔、苯乙醇胺A、非诺特罗、拉贝特罗、异克仑潘特和丙卡特罗。

进一步的：所述蛋白沉淀剂为乙腈。

进一步的：所述组合检测试剂还包括流动相添加剂，所述流动相添加剂为甲酸。

本发明还提供了利用所述的用于检测β-受体激动剂的组合检测试剂的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

(1)生物样品前处理：对待检测样品利用液液萃取法、蛋白沉淀法或滤膜过滤法进行预处理；

(2)取所述含有多种β-受体激动剂对照品的有机溶剂溶液直接进样；获得每种β-受体激动剂的标准曲线；得到线性方程、相关系数和线性范围；

(3)对预处理后的待检测样品进行液相色谱串联质谱检测：

(4)将质谱检测得到的各β-受体激动剂的峰面积，代入步骤(2)中对照品获得的标准曲线，得到对应β-受体激动剂的含量。

进一步的：所述步骤(1)中液液萃取法为：将待检测固体样品粉碎，加水，匀浆，所述水的加入体积与样品重量比为1:1-6:1；之后匀浆液用乙酸乙酯萃取，离心，35-45℃的条件下将有机相吹干，加入甲醇复融，离心，微孔滤膜过滤，取滤液用于分析。

进一步的：所述步骤(1)中蛋白沉淀法为：将待检测固体样品粉碎，加水，匀浆，之后匀浆液加入甲醇或乙腈沉淀，所述甲醇或乙腈的加入体积与样品重量比为1:1-6:1；离心，取上清液，微孔滤膜过滤，取滤液用于分析。

进一步的：所述步骤(1)中滤膜过滤法为：将液体待检测样品用微孔滤膜过滤，滤液加入甲醇或乙腈沉淀，所述甲醇或乙腈的加入体积与样品重量比为1:1-6:1；离心，取上清液用于分析。

进一步的：所述步骤(3)中色谱条件为：采用硅胶键合相填料柱，流动相由A相+B相组成：A相为乙腈水，含体积百分比为0.002％-0.1％的甲酸，B相为乙腈，含体积百分比为0.002％-0.1％的甲酸，A相：B相的体积比为1-99％：99-1％。

进一步的：所述步骤(3)中质谱条件为：电喷雾电离源ESI，正离子多反应监测扫描MRM，气帘气35～40psi，离子化电压+5500V，温度450～550℃，喷雾气40～55psi，辅助加热气40～60psi。

本发明的优点和技术效果是：

1、本发明提供的检测试剂组合可以同时分析33种β-受体激动剂，检测范围最广泛；

2、本发明配制的对照品溶剂，无需处理可直接进样；

3、本发明采用水解酶可以将代谢产物水解成原型化合物，提高分析物浓度；

4、本发明样品处理中采用蛋白沉淀或液液萃取的方案，对生物样品中的33种β-受体激动剂进行净化和富集；

5、本发明在样品的色谱分离中，采用细口径的色谱短柱和梯度洗脱法，降低样品基质对质谱响应抑制的同时对33种β-受体激动剂进行快速分离，保证测定结果的正确性情况下，简化了操作步骤。

6、应用本发明所述试剂组合的检测方法具有简便、准确、快速、稳定的优点；而且所需样本量少，化学试剂使用量小，绿色环保；样品处理无需衍生化等复杂步骤；检测结果不受内源性物质的干扰；假阴性假阳性率低；试剂成本低廉，适用于大量样本的快速分析。

附图说明

图1是本发明中33种β-受体激动剂的提取离子流色谱图；其中图1a、图1b、图1c、图1d为33种β-受体激动剂的提取离子流色谱图。

图2是本发明实施例2中猪肝样品中检测到克伦特罗的提取离子流色谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。该例子仅是应用范例。不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。

实施例1

1.实验仪器与试剂

1.1实验仪器

AcQuity^TM UPLC超高压液相色谱仪、Oasis MCX固相萃取(SPE)小柱(6mL，150mg)均购自美国Waters，API5500Qtrap质谱仪购自美国AB，漩涡混合器，TTL-DCII型氮吹仪，IKA高速组织匀浆机，超纯水仪(Simplicity，默克密理博公司)，超声波提取仪(KQ-250B，昆山市超声仪器有限公司)、IKA T18Basic高速分散机(德国)。

1.2实验试剂

三氯乙酸(分析纯)，甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，甲酸纯度为99％，33种β-受体激动剂(纯度均≥99％):西马特罗、福莫特罗、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、班布特罗、齐帕特罗均购自美国Sigma，氯丙那林、马布特罗、溴布特罗、非诺特罗、克伦丙罗、妥布特罗、特布它林、克伦特罗、莱克多巴胺、苯氧丙酚胺、克伦潘特、克伦异潘特、马喷特罗、利托君、丙卡特罗、吡布特罗、溴代克伦特罗、克伦赛罗、异丙喘宁、塞布特罗均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH。

2.检测方法

2.1待检测样品前处理

选取猪肝样品，切块，去筋膜，准确称取1.00g，加入3ml水，经高速组织捣碎机均匀捣碎制成匀浆样品，准确称取2.00g匀浆样品，置于10mL离心管内，加入5μL的β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，混匀，37酸孵育30min，加入甲醇3mL，涡旋混匀5min，超声提取15min，4℃14000g离心10min；收集上清液，待过固相萃取小柱。MCX柱用6mL甲醇、6mL水活化，将上清液过柱，弃去滤液，用6mL水淋洗，最后用6mL 5％甲醇氨洗脱，洗脱液用氮气吹干后，用0.1％甲酸水溶液定容至0.2mL，漩涡混合1min，微孔滤膜过滤，UPLC-MS/MS进样20μl测定。

2.2液相色谱串联质谱分析

色谱条件：色谱柱:ACQUITY UPLC^TM BEH C18柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；柱温40℃；进样体积20μL；采用硅胶键合相填料柱，流动相A为乙腈水(乙睛和水的体积比为5：95)，含0.05％的甲酸溶液，流动相B为乙腈，含0.05％的甲酸溶液；流速0.3mL/min；流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 33种β-受体激动剂的液相洗脱条件

质谱条件:采用电喷雾电离源ESI正离子的离子化模式，进行多反应监测(MRM)扫描，气帘气35～40psi，离子化电压+5500V，温度450～550℃，喷雾气40～55psi，辅助加热气40～60psi，接口加热气On，碰撞气Medium。多反应监测模式(MRM)种，每个化合物检测两对离子，一对用于定量，一对用于定性。

3技术方案的优化

3.1、色谱条件优化

本发明选用2.1×50mm，1.7μm的C18色谱柱在相对较短时间内保证33种β受体激动剂的有效分离。实验比较甲醇-水、乙腈-水体系作为流动相对33种β受体激动剂的分离效果的影响，为了提高分析的效率减少分析时间，采用洗脱能力较强的乙腈-水流动相系统，实验采用梯度洗脱方式获得理想的色谱分离效果，单个运行过程时间仅需6min。通过优化，发现流动相中甲酸含量为0.05％时，33种β-受体激动剂的灵敏度最高，且基质效应最小。

3.2、质谱条件优化

采用流动注射方式，在正离子和负离子模式下对每种化合物进行一级质谱扫描获得其分子离子峰；在确定各类化合物的准分子离子峰后分别对其进行二级质谱分析，获得其碎片离子信息，确定定量离子和辅助定性离子。通过优化碎裂电压(Fragmentor，V)、碰撞电压(Collision Energy，eV)等参数，使33种β受体激动剂的准分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大；对毛细管电压、雾化压力、干燥气温度、干燥气流量等进行优化，使每种待测化合物的离子化效率达到最佳。质谱离子源参数见表2。

表2 33种β受体激动剂的质谱离子源条件(带*者为定量离子)

3.3、样品前处理优化

由于β-受体激动剂的母核为苯乙胺基团，呈弱碱性，因此在酸性溶液中易于解离提取。已知强酸型蛋白沉淀剂如高氯酸等对这类物质提取效果较好，此外，加入适量的有机溶剂可能会改善提取效率。

常用的水解方法有酶水解、酸水解和碱水解。本发明采用酶水解方式，简化了操作步骤，节省试验时间，能更好地满足快速检测的需求。

待测33种β受体激动剂溶于甲醇、乙腈等有机试剂，本发明采用甲醇作为沉淀剂，以清除样品中的蛋白质，经优化发现当甲醇与匀浆样品3:1时，质谱分析几乎不存在离子抑制(基质效应)。

经比对，本发明检测方法可直接采用试剂组合中的溶液进样，建立标准曲线，不需要空白基质配制标准曲线。

实验选用甲醇作为提取试剂，振荡混匀后超声提取30min，过0.22μm有机滤膜后进样检测，结果显示甲醇/水体系对33种β受体激动剂的提取效率高达90％以上。

4、线性范围与检出限

将33种β受体激动剂的标准溶液添加到空白基质中做标准曲线，配制浓度为0.1、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10、20ng/mL的标准溶液，绘制33种β受体激动剂的标准曲线，相关系数均大于0.99(见表3)。标准曲线(如图1所示)线性良好r≥0.99(n＝5)。

33种β受体激动剂总离子流图见图1a、图1b、图1c、图1d所示，从图1中可以看出，沙丁胺醇保留时间为2.07min；克伦特罗保留时间为2.37min；莱克多巴胺保留时间为2.25min；氯丙那林保留时间为2.30min；班布特罗保留时间为2.39min；特布他林保留时间为2.07min；齐帕特罗保留时间为2.05min；塞曼特罗保留时间为2.52min；西布特罗保留时间为2.24min；溴布特罗保留时间为2.42min；克伦丙罗保留时间为2.34min；妥布特罗保留时间为2.36min；利托君保留时间为2.17min；马喷特罗保留时间为3.11min；喷布洛尔保留时间为2.45min；马布特罗保留时间为2.46min；福莫特罗保留时间为2.33min；阿福特罗保留时间为2.65min；克仑潘特保留时间为2.34min；溴氯布特罗保留时间为2.43min；奥西那林保留时间为2.52min；异丙肾上腺素保留时间为2.65min；苯氧丙酚胺保留时间为2.65min；克仑塞罗保留时间为2.79min；苯乙醇胺A保留时间为2.23min；非诺特罗保留时间为2.22min；拉贝特罗保留时间为2.73min；异克仑潘特保留时间为2.20min；吡布特罗保留时间为2.24min；沙美特罗保留时间为2.53min；克伦异磅特罗保留时间为2.76min；克伦磅特罗保留时间为2.37min；羟甲基克伦特罗保留时间为2.37min。

表3 33种β-受体激动剂在猪肝中的定量限、线性范围和相关系数

5、回收率与精密度

本发明考察了该方法的回收率及精密度，在空白样品中添加3个不同水平(0.2、2、20ng/mL)的33种β受体激动剂按实验方法测定回收率，每个水平重复测定6次。结果显示，33种β受体激动剂的平均回收率为90.2％～111％，相对标准偏差均小于8.24％(结果见表4)。

表4方法加标回收率及精密度

实施例2、待检测样品的具体检测分析

实验待检测的实际待检测样品从山东省市场购买，处理后，储存在4℃的冰箱中备用。用本发明检测方法对购买的10份猪肝样品进行检测，发现一例阳性样品，克伦特罗含量为0.71ng/mL，见图2所示。

本实施例具体检测方法如下：

(1)生物样品预处理：本实施例预处理采用蛋白沉淀法(使用所述组合检测试剂中的蛋白沉淀剂)进行处理。猪肝样品，切块，去筋膜，准确称取1.00g，加入3ml水，经高速组织捣碎机均匀捣碎制成匀浆样品，准确称取2.00g匀浆样品，置于10mL离心管内，加入5μL的β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，混匀，37酸孵育30min，加入甲醇3mL，涡旋混匀5min，超声提取15min，4℃14000g离心10min；收集上清液。

(2)取所述组合检测试剂中的含有多种β-受体激动剂对照品的有机溶剂溶液直接进样；获得每种β受体激动剂的标准曲线；得到线性方程、相关系数和线性范围。

(3)对预处理后的待测样品进行液相色谱串联质谱分析：将MCX柱用6mL甲醇、6mL水活化，将上清液过柱，弃去滤液，用6mL水淋洗，最后用6mL 5％甲醇氨洗脱，洗脱液用氮气吹干后，用0.1％甲酸水溶液定容至0.2mL，漩涡混合1min，微孔滤膜过滤，UPLC-MS/MS进样20μl测定。

液相色谱、质谱条件同实施例中的2.2，质谱离子源部分优化参数见实施例1中的表2。

(4)将质谱检测得到的各化合物的峰面积，代入步骤(2)中的标准曲线，得到对应β受体激动剂的含量。

本发明采用高效液相色谱串联质谱技术建立了33种β受体激动剂的分析方法。该方法操作简便快速、灵敏度高、专属性强、重复性好，可以同时测定33种β受体激动剂，实现了其高通量分析，可满足中33种β受体激动剂的快速分析的要求。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims

1.用于检测β-受体激动剂的组合检测试剂，其特征在于所述组合检测试剂包括：含有多种β-受体激动剂对照品的有机溶剂溶液、水解酶和蛋白沉淀剂，所述水解酶为β-葡萄糖苷酸酶和/或芳基硫酸酯酶；含有的每种β-受体激动剂对照品在有机溶剂溶液中的浓度均为0.1 ng-20 ng/mL，所述蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈或乙酸乙酯。

2.根据权利要求1所述的用于检测β-受体激动剂的组合检测试剂，其特征在于：所述含有多种β-受体激动剂对照品的有机溶剂溶液为含有33种β-受体激动剂的体积比为50%的甲醇溶液；所述33种β-受体激动剂为沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、班布特罗、特布他林、齐帕特罗、塞曼特罗、西布特罗、溴布特罗、克伦丙罗、妥布特罗、利托君、马喷特罗、喷布洛尔、马布特罗、福莫特罗、阿福特罗、克仑潘特、溴氯布特罗、奥西那林、利妥特灵、苯氧丙酚胺、克仑塞罗、R-美托洛尔、S-美托洛尔、苯乙醇胺A、非诺特罗、拉贝特罗、异克仑潘特和丙卡特罗。

3.根据权利要求1所述的用于检测β-受体激动剂的组合检测试剂，其特征在于：所述蛋白沉淀剂为乙腈。

4.根据权利要求1所述的用于检测β-受体激动剂的组合检测试剂，其特征在于：所述组合检测试剂还包括流动相添加剂，所述流动相添加剂为甲酸。

5.利用权利要求1所述的组合检测试剂的检测方法，其特征在于所述检测方法包括以下步骤：

（1）生物样品前处理：对待检测样品利用液液萃取法、蛋白沉淀法或滤膜过滤法进行预处理；

（2）取所述含有多种β-受体激动剂对照品的有机溶剂溶液直接进样；获得每种β-受体激动剂的标准曲线；得到线性方程、相关系数和线性范围；

（3）对预处理后的待检测样品进行液相色谱串联质谱检测：

（4）将质谱检测得到的各β-受体激动剂的峰面积，代入步骤（2）中对照品获得的标准曲线，得到对应β-受体激动剂的含量。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中液液萃取法为：将待检测固体样品粉碎，加水，匀浆，所述水的加入体积与样品重量比为1:1-6:1；之后匀浆液用乙酸乙酯萃取，离心，35-45 °C的条件下将有机相吹干，加入甲醇复融，离心，微孔滤膜过滤，取滤液用于分析。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中蛋白沉淀法为：将待检测固体样品粉碎，加水，匀浆，之后匀浆液加入甲醇或乙腈沉淀，所述甲醇或乙腈的加入体积与样品重量比为1:1-6:1；离心，取上清液，微孔滤膜过滤，取滤液用于分析。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中滤膜过滤法为：将液体待检测样品用微孔滤膜过滤，滤液加入甲醇或乙腈沉淀，所述甲醇或乙腈的加入体积与样品重量比为1:1-6:1；离心，取上清液用于分析。

9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中色谱条件为：采用硅胶键合相填料柱，流动相由A相+B相组成：A相为乙腈水，含体积百分比为0.002%-0.1%的甲酸，B相为乙腈，含体积百分比为0.002%-0.1%的甲酸，A相：B相的体积比为1-99%：99-1%。

10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中质谱条件为：电喷雾电离源ESI，正离子多反应监测扫描MRM，气帘气35~40 psi，离子化电压+5500 V，温度450~550 °C，喷雾气40~55 psi，辅助加热气40~60 psi。