CN108680676A - 定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了定量检测乳制品中β‑受体阻断剂类药物的方法。该方法包括：将乳制品酶解后调节pH值至碱性，以便得到酶解后样品；将所述酶解后样品与提取溶剂混合，以便得到样品提取液粗品；将所述样品提取液粗品进行固相萃取，以便得到净化后的样品提取液；将所述净化后的样品提取液挥干后复溶，以便得到待测溶液；以及利用HPLC‑Q‑OrbitrapHRMS对所述待测溶液进行检测，以便获得所述乳制品中的β‑受体阻断剂类药物的浓度。该方法分离效率高，鉴定准确，并且，操作方便，检测快速、重现性好。

Description

定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体地，涉及定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法。

背景技术

β-受体阻断剂(β-blockers，BBS)是一类能选择性地与β-肾上腺素受体结合，从而拮抗神经递质和儿茶酚胺对β-受体激动作用的药物。由于该类药物具有一定的镇静作用，能提高某些运动项目的成绩，常被非法使用于体育赛事而被世界反兴奋剂组(WADA)所禁用。BBS在畜牧养殖业中也常被非法用作镇静剂，一方面通过降低动物的运动量来促进饲料转化率；另一方面还可缓解应激反应以降低动物在运输、交配、分娩等压力下的发病率和死亡率以及避免对肉质的不良影响(SPE肉，苍白软湿肉综合症，一种劣质肉)。BBS常通过肌肉注射和静脉注射方式给药，且往往在动物屠宰或运输前数小时使用，导致其在可食动物组织中残留风险较高，对人体造成的健康风险更大。此外，BBS类药物可在体内发生代谢，转化为具有药理活性且能在体内蓄积的代谢物，例如，4-羟基苯基卡维地洛(卡维地洛的代谢物)，与卡维地洛本身相比，此代谢物呈现比原药约十三倍高的肾上腺素受体阻滞效能。世界上一些地区和组织已经为动物源食品中的卡拉洛尔设定了最大残留限量(MRL)，以保护消费者的健康。该物质被列于附件一中，其中对于猪肾中此类物质的MRL为25.0μg/kg，牛肾为15.0μg/kg。欧盟也对奶粉中卡拉洛尔含量做出了相应的要求，其最大残留限量为1.0μg/kg。目前，我国当前既未批准BBS可作为兽药使用，也未明确相关限量要求。由于食用高含量此类物质的食物对消费者健康有害，所以有必要控制β-受体阻滞剂的使用。因此，需要建立含有代谢物的BBS样药物的高通量分析方法。

目前，国内外关于此类物质残留的检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)，气相色谱法(GC)，气相色谱-质谱法(GC/MS，GC/MS/MS)，液相色谱法(LC)和液相色谱串联质谱法(LC/MS，LC/MS/MS)。其中ELISA法检测后需要其他方法验证，LC法灵敏度较低，无法满足对禁用药物检测的要求。GC有较好的灵敏度，但前处理需衍生化，费时较长。LC/MS/MS作为目前报道较多的方法，可以进行多残留定性定量检测，但大多数液相色谱通常与低分辨率质谱(Low-Resolution Mass Spectrometry，LRMS)分析仪一起使用，如三重四极杆。

由此，β-受体阻断剂药物的定量分析检测方法有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法，该方法可高效、快速、准确、全面地检测出乳制品中存在的β-受体阻断剂类药物，操作方便，重现性好。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将乳制品酶解后调节pH值至碱性，以便得到酶解后样品；将所述酶解后样品与提取溶剂混合，以便得到样品提取液粗品；将所述样品提取液粗品进行固相萃取，以便得到净化后的样品提取液；将所述净化后的样品提取液挥干后复溶，以便得到待测溶液；以及利用HPLC-Q-Orbitrap HRMS对所述待测溶液进行检测，以便获得所述乳制品中的β-受体阻断剂类药物的浓度。

根据本发明实施例的定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法，采用固相萃取法对提取液粗品进行净化，沉淀蛋白效果，萃取的脂肪等亲脂性成分更少，使净化后的样品提取液的杂质显著减少，β-受体阻断剂类药物的回收率显著提高。同时，采用HPLC-Q-OrbitrapHRMS对样品进行检测，兼具高效液相色谱的高分离能力及高分辨质谱的高分辨率和高灵敏度，对乳制品中的多种β-受体阻断剂类药物进行分离和鉴定，分离效率高，鉴定准确，并且，操作方便，检测快速、重现性好。

另外，根据本发明上述实施例的定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述酶解处理是利用EDTA酶解液进行的，所述EDTA酶解液含有β-葡糖苷酸酶和/或芳基硫酸酯酶。

根据本发明的实施例，所述EDTA酶解液还含有乙酸铵，所述乙酸铵与所述EDTA的体积比为1：2-3。

根据本发明的实施例，所述EDTA酶解液与所述乳制品的比例为1:10-11。

根据本发明的实施例，所述酶解后样品的pH值为10.0。

根据本发明的实施例，所述提取溶剂为含有氯化钠的乙腈。

根据本发明的实施例，所述乙腈与所述乳制品的比例为(16-24)ml：1g，优选地，为20ml：1g。

根据本发明的实施例，所述氯化钠与所述乳制品的质量比为1.2-2.5:1。

根据本发明的实施例，利用Oasis PRiME HLB固相萃取柱进行所述固相萃取。

根据本发明的实施例，所述固相萃取的洗脱液为甲醇-水溶液，和甲醇-乙腈混合液，其中，甲醇-水溶液的甲醇与水的体积比为(17-20)：1，甲醇-乙腈混合液的甲醇与乙腈的体积比为1:(8-10)。

根据本发明的实施例，所述检测的进样量为2μL。

根据本发明的实施例，所述HPLC-Q-Orbitrap HRMS的质谱条件为：离子源：HESI源；扫描模式：Full MS/dd-MS2；质量分析器：Q-Obitrap；一级分辨率：70000，二级分辨率：17500；NCE碰撞能量：15％～35％；离子传输管温度：300-400℃；鞘气压力：35psi；辅助气压力：10arb；喷雾电压：3.5kV，色谱条件为：色谱柱：C8色谱柱，10cm×4.6mm，3μm；柱温：30-40℃。

根据本发明的实施例，所述HPLC-Q-Orbitrap HRMS的流动相的水相为1％的甲酸溶液，有机相为甲醇。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：利用待检测的β-受体阻断剂类药物标准品配置各β-受体阻断剂类药物的标准品储备液；将所述各β-受体阻断剂类药物的标准品储备液进行梯度稀释，以便得到标准品工作液；向所述标准品工作液中添加内标，以便得到含有内标的工作液；利用HPLC-Q-Orbitrap HRMS对所述含有内标的工作液进行检测，以便得到标准曲线；以及基于所述标准曲线，以便获得所述乳制品中的β-受体阻断剂类药物的浓度。

在此基础上，本发明进一步提供了一种定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)乳制品检测：乳制品置于聚丙烯比色管中，先采用含有β-葡糖苷酸酶和/或芳基硫酸酯酶的EDTA提取液酶解，再用氢氧化钠调节pH值到碱性，以含有氯化钠的乙腈为提取溶剂进行提取，以便得到提取液粗品，其中，所述提取溶剂中，乙腈与所述乳制品的比例为(16-24)ml：1g，氯化钠与所述乳制品的质量比为1.2-2.5:1；利用Oasis PRiME HLB固相萃取柱对所述提取液进行净化，以便得到净化后的样品提取液；取2ml所述净化后的样品提取液进行旋蒸，并用甲醇和水复溶，并采用滤膜过滤，取2μL过滤后的液体进样至HPLC-Q-Orbitrap HRMS中进行检测，以便得到所述乳制品的检测数据，(2)标准曲线制作：利用待检测的β-受体阻断剂类药物标准品配置各β-受体阻断剂类药物的标准品储备液；将所述β-受体阻断剂类药物的标准品储备液进行梯度稀释，以便得到标准品工作液；向所述标准品工作液中添加内标，以便得到含有内标的工作液；利用HPLC-Q-Orbitrap HRMS对所述含有内标的工作液进行检测，以便得到标准曲线，(3)结果分析：基于所述标准曲线和所述乳制品的检测数据，以便获得所述乳制品中的β-受体阻断剂类药物的浓度。

根据本发明实施例的定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法，采用固相萃取法对提取液粗品进行净化，沉淀蛋白效果，萃取的脂肪等亲脂性成分更少，使净化后的样品提取液的杂质显著减少，β-受体阻断剂类药物的回收率显著提高。同时，采用HPLC-Q-Orbitrap HRMS对样品进行检测，兼具高效液相色谱的高分离能力及高分辨质谱的高分辨率和高灵敏度，对乳制品中的多种β-受体阻断剂类药物进行分离和鉴定，分离效率高，鉴定准确，并且，操作方便，检测快速、重现性好。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的四种不同色谱柱分离羟基阿替洛尔的总离子流结果示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的不同流动相下目标物阿替洛尔和普拉洛尔的分离效果示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的不同进样量的目标物提取离子的结果示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的样品提取离子流和二级质谱结果示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的五种不同提取溶剂的回收率对比示意图；

图6显示了根据本发明一个实施例的不同提取溶剂体积的回收率对比示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法。根据本发明实施例的定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法，采用固相萃取法对提取液粗品进行净化，沉淀蛋白效果，萃取的脂肪等亲脂性成分更少，使净化后的样品提取液的杂质显著减少，β-受体阻断剂类药物的回收率显著提高。同时，采用HPLC-Q-Orbitrap HRMS对样品进行检测，兼具高效液相色谱的高分离能力及高分辨质谱的高分辨率和高灵敏度，对乳制品中的多种β-受体阻断剂类药物进行分离和鉴定，分离效率高，鉴定准确，并且，操作方便，检测快速、重现性好。

本发明实施例的定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法，可以对27种β-受体阻断剂类药物进行检测，这27种β-受体阻断剂类药物包括21种洛尔类β-受体阻断剂类药物及其6种代谢物，具体地为卡拉洛尔、氧烯洛尔、普萘洛尔、阿普洛尔、比索洛尔、倍他洛尔、索他洛尔、吲哚洛尔、纳多洛尔、噻吗洛尔、醋丁洛尔、塞利洛尔、拉贝洛尔、氯拉洛尔、喷布洛尔、普拉洛尔、卡维地洛、布拉洛尔、阿替洛尔、艾司洛尔、美托洛尔、二醋洛尔、羟基美托洛尔、羟基阿替洛尔、羟基噻吗洛尔、羟基普萘洛尔、羟苯基卡维地洛。

为了便于理解该申请，以检测乳粉为例，对本发明实施例的定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法进行解释说明，其中，根据本发明的实施例，该方法包括：

S100酶解处理

根据本发明的实施例，将乳制品酶解后调节pH值至碱性，得到酶解后样品。其中，乳制品的种类不受特别的限制，可以是奶粉、液体奶、奶酪等。

根据本发明的实施例，酶解处理是利用EDTA酶解液进行的，该EDTA酶解液含有β-葡糖苷酸酶和/或芳基硫酸酯酶。这是由于β-受体阻断剂类部分药物(通常为含有酚基结构的药物如拉贝洛尔和卡拉洛尔)易在生物体内形成葡糖醛酸轭合物或硫酸轭合物，β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶可以分解和抑制葡糖醛酸轭合物和硫酸轭合物的产生。

根据本发明的实施例，该EDTA酶解液还含有乙酸铵，其中，乙酸铵与EDTA的体积比为1：2-3。乙酸铵作用一种缓冲试剂，可以使酶解的pH值环境保持稳定，如pH＝5.2，而接近中性(pH＝5.2)的酶解环境能显著减少基质共萃取物，缓冲液中加入EDTA可减免强极性目标物与金属阳离子形成复合物而影响提取效率。

根据本发明的实施例，该EDTA酶解液与该乳制品的比例为1:10-11。加入该比例的EDTA酶解液，其酶解效果完全，又不会浪费酶解液。

根据本发明的实施例，该酶解后样品的pH值为10.0。由此，有利于β-受体阻断剂类药物从乳制品上解离，便于后续药物提取，药物的提取率高。

S200提取处理

根据本发明的实施例，将该酶解后样品与提取溶剂混合，得到样品提取液粗品。由此，使β-受体阻断剂类药物溶于提取溶剂内，便于药物的分析检测。

在残留分析实验中，提取溶剂的选择尤为重要：复杂基质中可能影响待测物质谱响应的杂质较多，待测物在基质中残留量通常为ppb级(μg/kg)，而某些杂质含量却很高，因此在提取溶剂选择时，需要充分考虑基质中干扰物质的性质和待测物的性质，尽可能完全地将待测物从基质中提取出来，而尽量减少基质中干扰物质的溶出。发明人针对乳制品脂肪和蛋白含量高的特点，以及β-受体阻断剂类药物的溶解性特点，采用乙腈为提取溶剂，并添加氯化钠，氯化钠可促使盐析分层。根据本发明的实施例，该提取溶剂可以为含有氯化钠的乙腈。由此，β-受体阻断剂类药物的提取率高，且杂质少。

由于乳制品中蛋白及脂肪含量较多，提取溶剂与乳制品的比例可以直接影响药物的提取率。如果提取溶剂比例过高会导致提取溶解的浪费，而提取溶剂比例过低又会使提取不全。根据本发明的实施例，乙腈与该乳制品的比例可以为(16-24)ml：1g，优选地，乙腈与该乳制品的比例可以为20ml：1g。根据本发明的实施例，氯化钠与该乳制品的质量比为1.2-2.5:1。由此，多种β-受体阻断剂类药物在该提取溶剂中的溶解度和回收率高，杂质干扰小，重现性好。

S300固相萃取

根据本发明的实施例，将样品提取液粗品进行固相萃取，得到净化后的样品提取液。由此，通过固相萃取，进一步去除提取液中的杂质。

根据本发明的实施例，利用Oasis PRiME HLB固相萃取柱进行固相萃取。OasisPRiME HLB固相萃取柱是“基质吸附型”固相萃取小柱，上样过程中，小柱中的填料仅对提取液粗品中的杂质基质有吸附作用，去除蛋白和脂肪的效果好，能高效去除提取液中的杂质，使检测结果中的杂质干扰更小。

根据本发明的实施例，固相萃取的洗脱液为甲醇-水溶液，和甲醇-乙腈混合液，其中，甲醇-水溶液的甲醇与水的体积比为(17-20)：1，进一步优选地，可以为19：1，甲醇-乙腈混合液的甲醇与乙腈的体积比可以为1:(8-10)，进一步优选地，可以为1：9。具体地，可以采用甲醇-水溶液和甲醇-乙腈混合液依次淋洗固相萃取柱。由此，去除提取液中的杂质的效果更好，使检测结果中的杂质干扰更小。

S400挥干后复溶

根据本发明的实施例，将净化后的样品提取液挥干后复溶，得到待测溶液。具体地，可以取2ml净化后的样品提取液旋蒸近干，并用甲醇和水复溶，经涡旋后过滤膜，得到可以直接进样检测的待测品。

S500检测分析

根据本发明的实施例，利用HPLC-Q-Orbitrap HRMS对所述待测溶液进行检测，获得所述乳制品中的β-受体阻断剂类药物的浓度。由此，检测的灵敏度高，速度快，重现性好，操作简单。

发明人实验研究发现，随着进样量的增加，目标物的分离度减小，峰形变差。根据本发明的实施例，当检测的进样量为2μL时，杂质的干扰小，各β-受体阻断剂类药物的分离度大，峰形好。

根据本发明的实施例，该HPLC-Q-Orbitrap HRMS的质谱条件为：离子源：HESI源；扫描模式：Full MS/dd-MS2；质量分析器：Q-Obitrap；一级分辨率：70000，二级分辨率：17500；NCE碰撞能量：15％～35％；离子传输管温度：300-400℃，优选地，为350℃；鞘气压力：35psi；辅助气压力：10arb；喷雾电压：3.5kV，色谱条件为：色谱柱：C8色谱柱，10cm×4.6mm，3μm，优选地，可以选取C8色谱柱；柱温：30-40℃。由此，在该色谱和质谱条件下，色谱峰型的峰形更好，检测的灵敏度和稳定性更高。

根据本发明的实施例，HPLC-Q-Orbitrap HRMS的流动相的水相为1％的甲酸溶液，有机相为甲醇。在检测过程中，常采用普萘洛尔和阿替洛尔做内标，以1％的甲醇溶液为水相，可以使普萘洛尔和阿替洛尔这对同分异构体响应更高和峰形更好。进而，该流动相的灵敏度高。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：利用待检测的β-受体阻断剂类药物标准品配置各β-受体阻断剂类药物的标准品储备液；将各β-受体阻断剂类药物的标准品储备液进行梯度稀释，得到标准品工作液；向标准品工作液中添加内标，得到含有内标的工作液；利用HPLC-Q-Orbitrap HRMS对含有内标的工作液进行检测，得到标准曲线；基于该标准曲线，获得所述乳制品中的β-受体阻断剂类药物的浓度。由此，通过绘制标准曲线，并将待测样本的检测值与标准曲线进行比较，从而获得待测乳制品中β-受体阻断剂类药物的浓度。

在此基础上，本发明进一步提供了一种定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)乳制品检测：将乳制品置于聚丙烯比色管中，先采用含有β-葡糖苷酸酶和/或芳基硫酸酯酶的EDTA提取液酶解，再用氢氧化钠调节pH值到碱性，以含有氯化钠的乙腈为提取溶剂进行提取，以便得到提取液粗品，其中，所述提取溶剂中，乙腈与所述乳制品的比例为(16-24)ml：1g，氯化钠与所述乳制品的质量比为1.2-2.5:1；利用Oasis PRiME HLB固相萃取柱对所述提取液进行净化，以便得到净化后的样品提取液；取2ml所述净化后的样品提取液进行旋蒸，并用甲醇和水复溶，并采用滤膜过滤，取2μL过滤后的液体进样至HPLC-Q-Orbitrap HRMS中进行检测，以便得到所述乳制品的检测数据；

(2)标准曲线制作：利用待检测的β-受体阻断剂类药物标准品配置各β-受体阻断剂类药物的标准品储备液；将所述β-受体阻断剂类药物的标准品储备液进行梯度稀释，以便得到标准品工作液；向所述标准品工作液中添加内标，以便得到含有内标的工作液；利用HPLC-Q-Orbitrap HRMS对所述含有内标的工作液进行检测，以便得到标准曲线；

(3)结果分析：基于所述标准曲线和所述乳制品的检测数据，以便获得所述乳制品中的β-受体阻断剂类药物的浓度。

根据本发明实施例的定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法，采用固相萃取法对提取液粗品进行净化，沉淀蛋白效果，萃取的脂肪等亲脂性成分更少，使净化后的样品提取液的杂质显著减少，β-受体阻断剂类药物的回收率显著提高。同时，采用HPLC-Q-Orbitrap HRMS对样品进行检测，兼具高效液相色谱的高分离能力及高分辨质谱的高分辨率和高灵敏度，对乳制品中的多种β-受体阻断剂类药物进行分离和鉴定，分离效率高，鉴定准确，并且，操作方便，检测快速、重现性好。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1

色谱-串联质谱仪器分析中色谱柱的选择对待测物质定量准确性至关重要。在高分辨质谱系统中，应最大程度考虑色谱峰形的对称性，以确保开发的检测方法以峰面积对目标物进行定量时，会有更接近真值的定量结果。考虑到β-受体阻断剂类药物pK≈9呈碱性，其极性范围较宽，为实现此类目标物的超快速色谱分析，除采用超快速色谱硬件系统外，色谱柱与流动相的选择非常关键。市售色谱柱填料类型很多，在本实施例中，对HPLC-Q-Orbitrap HRMS的多种类型色谱柱的保留行为及分离度进行分析比较，具体如下：

色谱柱类型：ALORICHC8(10cm×4.6mm，3μm)、Waters ACQUITYBEH C18(1.7μm，2.1×50mm)、Accucore aQ(2.6μm，150×2.1mm)、Waters ACQUITY UPLCTMBEH Phenyl(1.7μm，2.1×50mm)、ALORICHC8(10cm×4.6mm，3μm)

流动相：甲酸-水/乙腈

使用甲酸-水/乙腈为流动相，上机检测浓度为100μg/L确定柱子类型。

检测结果，各色谱柱的色谱图，如图1所示，以阿替洛尔(右侧谱图中优先所出色谱峰)和普拉洛尔(右侧谱图中后出色谱峰)(两者为同分异构体)及羟基阿替洛尔(左侧谱图)为例。

图1A中，使用Waters ACQUITY BEH C18(1.7μm，2.1×50mm)分析时，羟基阿替洛尔峰形较差，可能发生了部分分解，对定性及定量结果影响很大；图1B中，使用Accucore aQ(2.6μm，150×2.1mm)色谱柱分离时，羟基阿替洛尔出峰较早，低于1.5分钟，可能在色谱柱上没有保留；图1D中使用Waters ACQUITY UPLCTM BEH Phenyl(1.7μm，2.1×50mm)时，羟基阿替洛尔出峰较早，可能在目标物出在柱子上的保留不好，且出现两个峰，发生分解。因此BEH C18色谱柱、Accucore aQ色谱柱及BEH Phenyl色谱柱均不是最适合分离该27种β-受体阻断剂及代谢物类药物的色谱柱。如图1C所示，使用C8色谱柱对目标物进行分离时色谱峰形尖锐，无明显拖尾、前延等情况，因此C8色谱柱是最适用于β-受体阻断剂及代谢物类药物分离的色谱柱，对于β-受体阻断剂物质色谱峰形的改善、峰宽减小等有很大帮助。

液相分离时，固定相的选择上尤为重要，C8色谱柱的填料为高纯硅胶，比普通C18色谱柱具有更好的亲水性，但亲水性又弱于HILIC色谱柱。对于极性范围较广的β-受体阻断剂及代谢物类物质而言，如本实施例的实验结果所示，C8色谱柱更适用于极性、溶解性、结构等复杂多样的β-受体阻断剂及代谢物类药物的分离。

实施例2

在分离方面，色谱中依照“相似相溶”原则，待分离物质吸附在色谱柱上，通过流动相的洗脱可将具有不同极性和结构性质的物质自色谱柱上分时间段依次洗脱下来，达到分离的目的，流动相选择合适，则色谱图会呈现出较为尖锐和对称的峰型，在以峰面积进行定量时，峰形对称，半峰宽合适，没有拖尾、分叉等现象，则色谱峰积分结果和定量准确程度就会与真值更为接近。此外，使用质谱检测器进行检测时，流动相还将直接影响待测物的离子化形式和离子化程度，从而间接影响待测物的质谱响应和定性结果。

本实施例以27种β-受体阻断剂及代谢物类物质的100.0μg/kg混合标准品溶液作为测定对象，SUPELCOC8为固定相，对水-甲醇(H2O-MeOH)和水-乙睛(H2O-ACN)的流动相体系进行分析比较。

结果如图2所示，其中，图2A中，检测样品中阿替洛尔和普拉洛尔的质量比为2：1进行分析检测，从实验结果可以看出，甲醇-水的使用使得普萘洛尔和阿替洛尔这对同分异构体响应更高和峰形更好。这可能是由于甲醇具有质子供体特性，有助于化合物形成正加成物。图2B中，水相方面，分别加入0.1％、0.001％和0.0％(无甲酸)甲酸进行检测，检测样品中阿替洛尔和普拉洛尔的质量比为1：1，结果表明甲酸使目标离子稳定，提高离子化效率，实现更好的色谱分离，并且色谱峰的峰形更好。因此，采用0.1％甲酸水溶液-甲醇为流动相，化合物的分离度和灵敏度更高。

实施例3

本实施例以阿替洛尔和普萘洛尔一对同分异构体为例，对不同的进样量的进行分析比较。本实施例以27种β-受体阻断剂及代谢物类物质的100.0μg/kg混合标准品溶液作为测定对象，SUPELCOC8为固定相，对0.1％甲酸水-甲醇(0.1％HAc/H2O-MeOH)流动相体系，对进样量进行分析比较。

实验结果如图3所示，随着进样量的增加，目标物的分离不好，峰形变差。分析可能有两个原因有两个：第一个原因是随着注射量的增加，目标物的溶剂效应明显，当进样量较低可以获得良好的峰形。第二个原因可能是当进样量比较小时，一些含量小的杂质可能响应不到，或柱的吸附使得杂质能够被完全吸收，从而完全不可检测。但随着进样量的增加，杂质的响应就会被检测到。因此，选择2.0μL作为进样量，峰形好，杂质干扰小。

实施例4

称取2.0000g奶粉样品到50mL聚丙烯离心管中，加入5mL去离子水充分混合后，混合物依次加入100.0μL的ISTD混合标准溶液(1.0μg/mL)，40.0μL β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶和5.00mL EDTA提取液。将混合物在旋转器上混合1min后，50℃下水浴低速震荡酶解60min。待其冷却至室温后，用3.0mol/L氢氧化钠溶液将萃取液的pH调节至10.0。提取溶剂乙腈(20.00mL)，氯化钠(2.5000g)依次加入到混合物中，摇匀震荡提取30min，然后将提取物在4℃下以10000rps离心10min，将上清液转移到另一个聚丙烯离心管中。重复上述操作合并上清液于同一个试管中。取2.00mL上清液在40℃的水浴中用温和的N2气流将其蒸发至近干，吹干后将残留物用1.00mL甲醇-水(1:1)溶解，涡旋摇匀过0.22μm尼龙膜到1mL的进样小瓶中，上机检测。

提取溶剂不同种类：按照上述实验步骤操作，只改变提取溶剂种类，分别为含0.1％甲酸的乙腈、含1％甲酸的乙腈、含0.1％乙酸的乙腈和含1％乙酸的乙腈，对提取溶剂进行优化，结果如图5所示，经实验证明，乙腈的提取能力最好，所有化合物提取回收率高且回收稳定。

体积：得到最优提取溶剂后，按照上述实验步骤操作，只改变提取溶剂体积，提取溶剂的体积分别为5、10、15、20和25毫升，结果如图6所示，经实验证明提取溶剂量为15ml时目标物基本提取完全，但为保证回收率稳定，最后确定提取溶剂量为20ml。

实施例4

婴幼儿奶粉基质复杂，蛋白质、脂质、维生素及配方成分等有机杂质较多，因此前处理过程中样品净化于检测结果的准确性而言十分重要。本实施例比较了不同的净化方式，分别为固相萃取(SPE)、QuEChERS和直接提取-低温离心，具体如下：

(1)固相萃取(SPE)：称取2.0000g奶粉样品到50mL聚丙烯离心管中，加入5mL去离子水充分混合后，混合物依次加入100.0μL的ISTD混合标准溶液(1.0μg/mL)，40.0μLβ-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶和5.00mL EDTA提取液。将混合物在旋转器上混合1min后，50℃下水浴低速震荡酶解60min。待其冷却至室温后，用3.0mol/L氢氧化钠溶液将萃取液的pH调节至10.0。乙腈(20.00mL)，氯化钠(2.5000g)依次加入到混合物中，摇匀震荡提取30min，然后将提取物在4℃下以10000rps离心10min，将上清液转移到另一个聚丙烯离心管中。重复上述操作合并上清液于同一个试管中。取2.00mL上清液直接通过OasisPRiME HLB(6cc 200mg)固相萃取柱。待样品全部通过后，用甲醇-水(5:95；v/v)和甲醇-乙腈(1:9；v/v)依次淋洗，收集所有流出液。在40℃的水浴中用温和的N2气流将全部的流出液蒸发至近干，吹干后将残留物用1.00mL甲醇:水(1:1)溶解，涡旋摇匀过0.22μm尼龙膜到1mL的进样小瓶中，上机检测。

(2)QuEChERS：称取2.0000g奶粉样品到50mL聚丙烯离心管中，加入5.00mL去离子水充分混合，混合物依次加入100.0μL的ISTD混合标准溶液(1.0μg/mL)，40.0μLβ-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶和5.00mLEDTA提取液。将混合物在旋转器上混合1min后，50℃下水浴低速震荡酶解60min。待其冷却至室温后，用3.0mol/L氢氧化钠溶液将萃取液的pH调节至10.0。乙腈(20.00mL)，氯化钠(2.5000g)加入到混合物中，摇匀震荡提取30min，然后将提取物在4℃下以10000rps离心10min，将上清液转移到另一个聚丙烯离心管中。重复上述操作合并上清液于同一个试管中。取上清液依次加入0.9000g无水硫酸镁、150.0mgPSA和150.0mg C18，涡旋摇匀5min后，10000rps低温离心5min。取2.00mL上清液在40℃的水浴中用温和的N2气流将其蒸发至近干，吹干后将残留物用1.00mL甲醇-水(1:1)溶解，涡旋摇匀过0.22μm尼龙膜到1mL的进样小瓶中，上机检测。

(3)直接提取-低温离心：称取2.0000g奶粉样品到50mL聚丙烯离心管中，加入5.00mL去离子水充分混合，混合物依次加入100.0μL的ISTD混合标准溶液(1.0μg/mL)，40.0μLβ-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶和5.00mLEDTA提取液。将混合物在旋转器上混合1min后，50℃下水浴低速震荡酶解60min。待其冷却至室温后，用3.0mol/L氢氧化钠溶液将萃取液的pH调节至10.0。乙腈(20.00mL)，氯化钠(2.5000g)加入到混合物中，摇匀震荡提取30min，然后将提取物在4℃下以10000rps离心10min，将上清液转移到另一个聚丙烯离心管中。重复上述操作合并上清液于同一个试管中。取2.00mL上清液在40℃的水浴中用温和的N2气流将其蒸发至近干，吹干后将残留物用1.00mL甲醇-水(1:1)溶解，涡旋摇匀过0.22μm尼龙膜到1mL的进样小瓶中，上机检测。

实验结果发现，QuEChERS法中除水步骤可能导致部分水溶性β-受体阻断剂类药物，例如索他洛尔回收率不足50％，而用其他两项可达70％的损失，回收率较低，因此不适用于筛查奶粉样品中此类药物的净化处理。其余两种净化方法，回收率基本相似，但OasisPRiME HLB(6cc 200mg)固相萃取柱净化后的基质效应相对于直接提取-低温离心较低，由此，Oasis PRiME HLB(6cc 200mg)固相萃取柱的净化效果更佳。

实施例5

利用本发明实施例的定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法，以奶粉为例，验证检测方法的可靠性，具体如下：

1、实验方法

(1)称取2.0000g奶粉样品到50mL聚丙烯离心管中，加入5.00mL去离子水充分混合后，混合物依次加入100.0μL的ISTD混合标准溶液(1.0μg/mL)，40.0μLβ-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶和5.00mL EDTA提取液。

(2)将步骤(1)得到的混合物在旋转器上混合1min后，50℃下水浴低速震荡酶解60min。待其冷却至室温后，用3.0mol/L氢氧化钠溶液将萃取液的pH调节至10.0。乙腈(20.00mL)，氯化钠(2.5000g)依次加入到混合物中，摇匀震荡提取30min，然后将提取物在4℃下以10000rps离心10min(若分层不明显，可加些乙酸铅沉淀蛋白，但对柱子影响较大)，将上清液转移到另一个聚丙烯离心管中。重复上述操作合并上清液于同一个试管中。

(3)取2.00mL上清液直接通过Oasis PRiME HLB(6cc 200mg)固相萃取柱。待样品全部通过后，用甲醇-水(5:95；v/v)和甲醇-乙腈(1:9；v/v)依次淋洗，收集所有流出液。在40℃的水浴中用温和的N2气流将全部的流出液蒸发至近干，吹干后将残留物用1.00mL甲醇-水(1:1)溶解，涡旋摇匀过0.22μm尼龙膜到1mL的进样小瓶中，上机检测。

其中的UPLC-Q-Orbitrap HRMS的色谱条件为：色谱柱采用ALORICHC8(10cm×4.6mm，3μm)；柱温30℃；流动相：A相：0.1％甲酸水溶液，B相:甲醇；流速：0.5mL/min；进样量：2μL，流动相梯度洗脱程序如表1所示。

表1 液相梯度洗脱程序-C8柱

其中的UPLC-Q-Orbitrap HRMS中的质谱条件为：离子源：HESI源；扫描模式：FullMS/dd-MS2；质量分析器：Q-Obitrap；一级分辨率：70000，二级分辨率：17500；NCE碰撞能量：15％～35％；离子传输管温度：350℃；鞘气压力：35psi；辅助气压力：10arb；喷雾电压：3.5kV。27种β-受体阻滞剂及代谢物的质谱参数见表2。

表2 β-受体阻滞剂及代谢物的质谱参数

2、实验结果

经UPLC-Q-Orbitrap HRMS检测分析得到的27种β-受体阻滞剂及代谢物的回收率和精密度如表3所示。

仪器检出限LOD是通过稀释纯溶剂中的目标化合物来分析测定，测定值均在0.008～0.02μg/L的范围内。标准曲线是由目标化合物的峰面积与同位素内标物的峰面积的比值得到的，校准曲线的线性通过相关系数(r²)进行评估。结果表明，27种β-受体阻断剂类药物在0.5～100μg/L范围内线性良好，r²均大于0.9900，说明该方法适合27种β-受体阻断剂类药物的定量分析。

精密称取的2g空白奶粉样品，加入一定浓度的上述配制好的混合标准工作液，加入5.00mL去离子水充分混合后，混合物依次加入100.0μL的ISTD混合标准溶液(1.0μg/mL)，40.0μLβ-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶和5.00mL EDTA提取液。将混合物在旋转器上混合1min后，50℃下水浴低速震荡酶解60min。待其冷却至室温后，用3.0mol/L氢氧化钠溶液将萃取液的pH调节至10.0。乙腈(20.00mL)，氯化钠(2.5000g)依次加入到混合物中，摇匀震荡提取30min，然后将提取物在4℃下以10000rps离心10min(若分层不明显，可加些乙酸铅沉淀蛋白，但对柱子影响较大)，将上清液转移到另一个聚丙烯离心管中。重复上述操作合并上清液于同一个试管中。取2.00mL上清液直接通过Oasis PRiME HLB(6cc 200mg)固相萃取柱。待样品全部通过后，用甲醇-水(5:95；v/v)和甲醇-乙腈(1:9；v/v)依次淋洗，收集所有流出液。在40℃的水浴中用温和的N2气流将全部的流出液蒸发至近干，吹干后将残留物用1.00mL甲醇-水(1:1)溶解，涡旋摇匀过0.22μm尼龙膜到1mL的进样小瓶中，上机检测。并计算β-受体阻滞剂药物的回收率、日内精密度及日间精密度，具体计算结果如表3所示。

表3 β-受体阻滞剂药物的平均回收率、日内精密度及日间精密度

在三个浓度水平加标下，β-受体阻滞剂药物回收率在66.1～100.4％之间，表明该方法准确度良好，日内精密度和日间精密度均小于10％，表明方法重复性好，可对双酚类化合物进行定量检测。

依照上述乳粉中β-受体阻滞剂和6种代谢物的快速定量检测方法对市场上购买的30种不同品牌的婴幼儿配方奶粉进行定性和定量分析。检出一例疑似二醋洛尔的同分异构体，其二级离子中部分碎片离子与二醋洛尔相同，其中包含此类物质的特征离子如图4，推测可能是此类物质的结构类似物，结构如下所示：

综上所述，本发明实施例的定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法，采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS法，可以对乳粉中21种β-受体阻滞剂和6种代谢物进行快速定量检测，分离效率高，鉴定准确，可将27种β-受体阻滞剂类药物进行分离定性及定量，且提取的β-受体阻滞剂类药物的回收率较高，可有效地用于乳粉中β-受体阻滞剂类药物的筛选。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法，其特征在于，包括：

将乳制品酶解后调节pH值至碱性，以便得到酶解后样品；

将所述酶解后样品与提取溶剂混合，以便得到样品提取液粗品；

将所述样品提取液粗品进行固相萃取，以便得到净化后的样品提取液；

将所述净化后的样品提取液挥干后复溶，以便得到待测溶液；以及

利用HPLC-Q-Orbitrap HRMS对所述待测溶液进行检测，以便获得所述乳制品中的β-受体阻断剂类药物的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解处理是利用EDTA酶解液进行的，所述EDTA酶解液含有β-葡糖苷酸酶和/或芳基硫酸酯酶，

任选地，所述EDTA酶解液还含有乙酸铵，所述乙酸铵与所述EDTA的体积比为1：2-3；

任选地，所述EDTA酶解液与所述乳制品的比例为1:10-11；

任选地，所述酶解后样品的pH值为10.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂为含有氯化钠的乙腈，

任选地，所述乙腈与所述乳制品的比例为(16-24)ml：1g，优选地，为20ml：1g；

任选地，所述氯化钠与所述乳制品的质量比为1.2-2.5:1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用Oasis PRiME HLB固相萃取柱进行所述固相萃取。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述固相萃取的洗脱液为甲醇-水溶液，和甲醇-乙腈混合液，其中，甲醇-水溶液的甲醇与水的体积比为(17-20)：1，甲醇-乙腈混合液的甲醇与乙腈的体积比为1:(8-10)。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测的进样量为2μL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPLC-Q-Orbitrap HRMS的质谱条件为：

离子源：HESI源；

扫描模式：Full MS/dd-MS2；

质量分析器：Q-Obitrap；一级分辨率：70000，二级分辨率：17500；

NCE碰撞能量：15％-35％；

离子传输管温度：300-400℃；

鞘气压力：35psi；

辅助气压力：10arb；

喷雾电压：3.5kV，

所述HPLC-Q-Orbitrap HRMS的色谱条件为：

色谱柱：C8色谱柱，10cm×4.6mm，3μm；

柱温：30-40℃。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述HPLC-Q-Orbitrap HRMS的流动相的水相为1％的甲酸溶液，有机相为甲醇。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：

利用待检测的β-受体阻断剂类药物标准品配置各β-受体阻断剂类药物的标准品储备液；

将所述各β-受体阻断剂类药物的标准品储备液进行梯度稀释，以便得到标准品工作液；

向所述标准品工作液中添加内标，以便得到含有内标的工作液；

利用HPLC-Q-Orbitrap HRMS对所述含有内标的工作液进行检测，以便得到标准曲线；以及

基于所述标准曲线，以便获得所述乳制品中的β-受体阻断剂类药物的浓度。

10.一种定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法，其特征在于，包括：

(1)乳制品检测

将乳制品置于聚丙烯比色管中，先采用含有β-葡糖苷酸酶和/或芳基硫酸酯酶的EDTA提取液酶解，再用氢氧化钠调节pH值到碱性，以含有氯化钠的乙腈为提取溶剂进行提取，以便得到提取液粗品，其中，所述提取溶剂中，乙腈与所述乳制品的比例为(16-24)ml：1g，氯化钠与所述乳制品的质量比为1.2-2.5:1；

利用Oasis PRiME HLB固相萃取柱对所述提取液进行净化，以便得到净化后的样品提取液；

取2ml所述净化后的样品提取液进行旋蒸，并用甲醇和水复溶，并采用滤膜过滤，取2μL过滤后的液体进样至HPLC-Q-Orbitrap HRMS中进行检测，以便得到所述乳制品的检测数据，

(2)标准曲线制作

利用待检测的β-受体阻断剂类药物标准品配置各β-受体阻断剂类药物的标准品储备液；

将所述β-受体阻断剂类药物的标准品储备液进行梯度稀释，以便得到标准品工作液；

向所述标准品工作液中添加内标，以便得到含有内标的工作液；

利用HPLC-Q-Orbitrap HRMS对所述含有内标的工作液进行检测，以便得到标准曲线，

(3)结果分析

基于所述标准曲线和所述乳制品的检测数据，以便获得所述乳制品中的β-受体阻断剂类药物的浓度。