CN108828082A - 一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法：均质处理的鱼肉，用乙酸乙酯萃取，正己烷净化，乙腈浓缩，外标法定量，高效液相色谱串联质谱法检测。本发明提出了一种快速筛选合格乙酸乙酯的方法，以避免可能存在的能氧化阿苯达唑的杂质。本方法中阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑氨基砜的检测限分别为0.27、0.09和0.11μg/kg。欧盟和中国对阿苯达唑在反刍动物中的最高残留限量规定，残留标志为阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑氨基砜总和，在肌肉基质中不得超过100μg/kg。因此本方法十分适用于检测鱼肉中阿苯达唑的残留，具有简单快速、成本低、灵敏度高的优点。

Description

一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法
本发明涉及一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，属于环境保护技术领域。
背景技术
阿苯达唑(ABZ)是一种高效广谱驱虫药，被广泛应用于包括水产养殖业在内的多个领域。在生物体内，阿苯达唑会迅速代谢为3个主要代谢物：阿苯达唑亚砜(ABZ-SO)，阿苯达唑砜(ABZ-SO2)和阿苯达唑氨基砜(ABZ-NH2-SO2)。它的驱虫活性主要决定于它的一级代谢物ABZ-SO，ABZ-SO也可以单独作为驱虫药使用。动物试验研究发现了ABZ和ABZ-SO都存在致畸效应。有文献提出，在服用ABZ后的初始阶段，生物体内最可能被检测到的残留是ABZ-SO和ABZ-SO2，残留时间最长的是ABZ-NH2-SO2。目前各国家机构、国际组织已有的对阿苯达唑最高残留限量(MRL)的定义，残留标志存在一定的争议。欧盟和中国对ABZ在反刍动物体内最高残留限量(MRL)的定义，以ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的总和作为ABZ的残留标志，肌肉基质中MRL为100μg/kg。
乙酸乙酯被许多研究者认为是从高蛋白质鱼肉基质中提取苯并咪唑类残留最合适的溶剂，目前涉及使用乙酸乙酯提取ABZ的文献中，乙酸乙酯中可能存在引起ABZ大量氧化成ABZ-SO的杂质并没有被报道。目前国内已有的标准方法和近10年的文献方法中，检测动物产品中阿苯达唑类残留主要的前处理方法是固相萃取法(SPE)和液-液萃取法(LLE)。固相萃取法操作复杂，成本高昂。内标物，尤其是同位素内标的引入更加重了检测成本，不利于推广。多数文献在同时检测几十甚至上百种兽药的时候，没有良好匹配相关国家机构或国际组织对阿苯达唑MRL的规定。因此，为了预防鱼肉中ABZ残留给人类带来的健康风险，如何开发一种普适性高、成本低廉、简单快速、灵敏度高的检测方法是目前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，参考欧盟、中国的MRL法规，以代谢物ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的总和作为ABZ的残留标志，规定鱼肉基质中最高残留限量不超过100μg/kg，提供一种普适性高、成本低廉、简单快速、灵敏度高的检测方法。
为解决上述技术问题，提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，包括以下步骤：
S1、称取2g均质鱼肉放入50mL离心管，提取过程为：加入10mL筛选合格的乙酸乙酯，涡旋1min，超声10min，6000rpm离心5min，上层清液转移至100mL旋蒸瓶；
S2、重复S1中的提取过程，合并上清液，旋蒸至干；
S3、旋蒸瓶内的残留物，用1mL有机溶剂溶解，超声1min助溶，溶液转移至4mL离心管；
S4、用2mL除脂溶剂分两次洗涤旋蒸瓶，溶液合并至4mL离心管，涡旋1min，6000rpm离心5min，除去上层溶剂；
S5、吸取700μL的下层清液，氮吹至干，用等体积的水溶液溶解，涡旋1min，过0.22μm有机相针式滤器，用液相色谱串联质谱法检测，外标法定量。
上述的方法，优选的，所述S1步骤中所述筛选合格乙酸乙酯的步骤具体为：
S1-1,、将30mL乙酸乙酯放入100mL旋蒸瓶，40℃旋蒸旋蒸至干；
S1-2、用1mL标准工作液溶解，超声1min助溶，过0.45μm有机相针式滤器，随后用高效液相色谱法(紫外检测器)检测，与等浓度标准工作液色谱图对照，色谱图没有明显差异则为筛选合格的乙酸乙酯。
上述的方法，优选的，所述S1-1步骤中，所述旋蒸方式为40℃减压旋蒸。
上述的方法，优选的，所述S1-2步骤中，所述标准工作液为阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑氨基砜的混合液。
上述的方法，优选的，所述S2步骤中，所述旋蒸方式为40℃减压旋蒸。
上述的方法，优选的，所述S3步骤中，有机溶剂为乙腈。
上述的方法，优选的，所述S4步骤中，除脂溶剂为正己烷。
上述的方法，优选的，水溶液为20％乙腈水溶液。
上述的方法，优选的，所述S5步骤中，外标法所用标准工作液中，溶质为阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑氨基砜，溶剂为20％乙腈水溶液。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，能快速筛选合格乙酸乙酯。乙酸乙酯被广泛认为是从高蛋白鱼肉中提取苯并咪唑类残留的最优溶剂，在它长期或不妥当储存中可能存在导致ABZ快速氧化成ABZ-SO的杂质目前尚无文献报导，本发明发现并填补了这一空白。
(2)本发明提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，提取溶剂乙酸乙酯以及用以富集的乙腈不需要额外修饰，简化了前处理步骤。
(3)本发明提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，富集溶剂采用与正己烷互不相容的乙腈。与甲醇相比，它不会发生乳化，与正己烷分层更明显。与极性较高的乙腈水溶液或甲醇水溶液相比，它可以很大程度保留极性更低的ABZ。对于同时检测ABZ和它的代谢物ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2来说，有重要的指导意义。
(4)本发明提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，定量方法采用外标法。同位素内标物是最合适的内标，但是通常不容易得到且成本高昂不利于推广。在能准确定量的前提下，本发明可以降低检测成本，进一步简化前处理步骤。
(5)本发明提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，除脂溶剂采用正己烷，和C18、PSA、硅藻土、中性氧化铝和NH2净化粉末相比，它可以显著提高ABZ-NH2-SO2的回收率，减少目标分析物被净化剂吸附导致的损失。ABZ-NH2-SO2是被目前已有ABZMRL法规的全部国家机构、国际组织公认的残留标志或残留标志之一。
(7)本发明提供了一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，检测仪器采用LC-MS/MS，对ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的检测限分别为0.27、0.09和0.11μg/kg，总检测限为0.47μg/kg，灵敏度非常高可充分满足实际检测需求。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为阿苯达唑在生物体内的代谢路线图。
图2为实施例1中阿苯达唑发生氧化代谢行为的色谱图。
图3为实施例2中筛选合格乙酸乙酯的色谱图。
图4为实施例3中验证正己烷中存在大量阿苯达唑的色谱图。
图5为实施例4中的除脂步骤中30％乙腈水溶液pH对阿苯达唑回收率的影响说明。
图6为实施例5中除脂步骤中有机溶剂比例对阿苯达唑回收率的影响说明。
图7为实施例6中不同净化剂对阿苯达唑及三种主要代谢物回收率的影响说明。
图8为实施例7中的前处理流程图。
图9为实施例7中液相色谱串联质谱法中阿苯达唑代谢物的色谱图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售
实施例1
一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，发现从高蛋白基质中提取苯并咪唑类的常用提取剂乙酸乙酯存在能快速氧化ABZ为ABZ-SO的杂质，包括以下步骤：
(1)样品a的制备
取7.5mL乙酸乙酯放入15mL聚丙烯离心管，常温氮吹至干，加入1mL500μg/L混合标准工作液(含有ABZ，ABZ-SO，ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，溶剂为20％甲醇水溶液)，涡旋1min，过0.45μm有机相针式滤器，随后用高效液相色谱(紫外检测器)检测。
(2)样品b的制备
取同一试剂瓶的30mL乙酸乙酯放入100mL旋蒸瓶，40℃减压旋蒸至干，从收集得到的馏分中取7.5mL放入15mL聚丙烯离心管，常温氮吹至干，加入1mL 500μg/L混合标准工作液(含有ABZ，ABZ-SO，ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，溶剂为20％甲醇水溶液)，涡旋1min，过0.45μm有机相针式滤器，随后用高效液相色谱(紫外检测器)检测。
(3)样品c的制备
取1mL 500μg/L混合标准工作液(含有ABZ，ABZ-SO，ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，溶剂为20％甲醇水溶液)，过0.45μm有机相针式滤器，随后后用高效液相色谱(紫外检测器)检测。
高效液相色谱条件：
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18 HPLC柱(4.6×250mm,5μm)；
表1：流动相及洗脱条件
时间(min) 乙腈(％) 甲醇(％) 0.05mol/L乙酸铵(％)
0 10 8 82
10 40 20 40
15 50 20 30
20 50 20 30
25 10 8 82
流速：1.0mL/min；
进样体积：50μL；
柱温：40℃；
检测波长：292nm。
样品a、b、c的色谱图参见图2。
从图2的结果可知：所使用的色谱纯乙酸乙酯中存在能快速氧化ABZ为ABZ-SO的杂质。
实施例2
一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，筛选合格的乙酸乙酯，选用不同厂家乙酸乙酯(2瓶Merck色谱纯、2瓶Sigma-Aldrich色谱纯、1瓶山东富宇化工分析纯，其中1瓶Merck和1瓶Sigma-Aldrich的色谱纯乙酸乙酯被确认足够新鲜)，处理步骤与实施例1中样品a的制备一致。同时准备一份标准溶液，处理步骤与实施例1中样品c的制备一致。高效液相色谱条件与实施例1一致。考察结果参见图3。
从图3的结果可知：Sigma-Aldrich和Merck的新鲜乙酸乙酯中不存在能使ABZ快速氧化成ABZ-SO的杂质，Merck的旧乙酸乙酯已经明显变质，并且和Sigma-Aldrich的色谱纯旧乙酸乙酯、山东富宇化工的分析纯旧乙酸乙酯一样，存在能使ABZ快速氧化成ABZ-SO的杂质，这个杂质的产生可能和乙酸乙酯的保存不当或者过长时间放置有关。
实施例3
一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，考察常用除脂溶剂正己烷对阿苯达唑回收率的影响，包括以下步骤：
(1)样品a的制备
取1mL 500μg/L混合标准工作液(含有ABZ，ABZ-SO，ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，溶剂为20％甲醇水溶液)放入4mL聚丙烯离心管，随后加入1mL正己烷，涡旋1min，6000rpm离心5min。上层正己烷转移至新的4mL聚丙烯离心管。下层水溶液中重新加入1mL正己烷，涡旋1min，6000rpm离心5min。上层正己烷合并至第2只离心管，常温氮吹至干，加入1mL 20％甲醇水溶液，涡旋1min，过0.45μm有机相针式滤器，随后用高效液相色谱(紫外检测器)检测。
(2)样品b的制备
上述实验中，下层水溶液过0.45μm有机相针式滤器，随后用高效液相色谱(紫外检测器)检测。
(3)样品c的制备
与实施例1中样品c的制备一致。
高效液相色谱条件与实施例1一致，考察结果参见图4。
从图4的结果可知，有大量正己烷损失在上层正己烷中，导致回收率非常低。阿苯达唑的极性远弱于它的三种代谢物，更容易溶解在非极性溶剂正己烷中，因此实际用正己烷除脂步骤中应适当调整下层溶液极性。
实施例4
一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，考察常用除脂溶剂正己烷在使用时，下层溶液pH对阿苯达唑回收率的影响，包括以下步骤：
(1)上层样品的制备
取8份1mL 500μg/L混合标准工作液(含有ABZ，ABZ-SO，ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，溶剂为30％乙腈水溶液，用乙酸和氨水分别调节pH为2、3、4、5、6、7、8和9)，分别放入4mL聚丙烯离心管，加入1mL正己烷，涡旋1min，6000rpm离心5min。上层正己烷转移至新的4mL聚丙烯离心管。下层水溶液中重新加入1mL正己烷，涡旋1min，6000rpm离心5min。上层正己烷合并至第2只离心管，常温氮吹至干，加入1mL 30％乙腈水溶液溶解，涡旋1min，过0.45μm有机相针式滤器，随后用高效液相色谱(紫外检测器)检测。
(2)下层样品的制备
上述实验中，下层水溶液过0.45μm有机相针式滤器，随后用高效液相色谱(紫外检测器)检测。
(3)标准溶液样品的制备
取1mL 500μg/L混合标准工作液(含有ABZ，ABZ-SO，ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，溶剂为30％乙腈水溶液)，过0.45μm有机相针式滤器后用高效液相色谱(紫外检测器)检测。
高效液相色谱条件与实施例1一致。
回收率＝样品峰面积÷标准溶液峰面积×100％，考察结果参见图5。
从图5的结果可知，ABZ回收率在下层溶液pH＝5附近时，回收率最高。3个代谢物的回收率没有受到明显的影响。
实施例5
一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，考察常用除脂溶剂正己烷在使用时，下层溶液有机相溶剂种类、比例对阿苯达唑回收率的影响，包括以下步骤：
(1)甲醇类上层样品的制备
取4份1mL 500μg/L混合标准工作液(含有ABZ，ABZ-SO，ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，溶剂分别为20％、40％、60％、80％甲醇水溶液)，分别放入4mL聚丙烯离心管，加入1mL正己烷，涡旋1min，6000rpm离心5min。上层正己烷转移至新的4mL聚丙烯离心管。下层水溶液中重新加入1mL正己烷，涡旋1min，6000rpm离心5min。上层正己烷合并至第2只离心管，常温氮吹至干，加入1mL 20％甲醇水溶液溶解，涡旋1min，过0.45μm有机相针式滤器，随后用高效液相色谱(紫外检测器)检测。
(2)乙腈类上层样品的制备
取6份1mL 500μg/L混合标准工作液(含有ABZ，ABZ-SO，ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，溶剂分别为20％、30％、40％、60％、80％、100％乙腈水溶液)，分别放入4mL聚丙烯离心管，加入1mL正己烷，涡旋1min，6000rpm离心5min。上层正己烷转移至新的4mL聚丙烯离心管。下层水溶液中重新加入1mL正己烷，涡旋1min，6000rpm离心5min。上层正己烷合并至第2只离心管，常温氮吹至干，加入1mL 20％乙腈水溶液，涡旋1min，过0.45μm有机相针式滤器后用高效液相色谱(紫外检测器)检测。
(3)标准溶液样品的制备
取2份1mL 500μg/L混合标准工作液(含有ABZ，ABZ-SO，ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，溶剂分别为20％甲醇水溶液、20％乙腈水溶液)，过0.45μm有机相针式滤器，随后用高效液相色谱(紫外检测器)检测。
高效液相色谱条件与实施例1一致。
阿苯达唑损失率＝样品峰面积÷标准溶液峰面积×100％，考察结果参见图6。
从图6的结果可知：下层溶液有机相比例较低时，ABZ的损失较多；有机相比例较高时候，ABZ的损失较少，并且乙腈要优于等比例的甲醇。根据色谱图结果，下层溶液在相同有机相比例下，乙腈色谱峰响应略高于甲醇；下层溶液有机相比例较高时，色谱峰有出现拖尾的情况，乙腈的拖尾情况比甲醇严重。100％的甲醇与正己烷相互作用时会出现乳化现象，不利于分层。因此选用20％-30％乙腈水溶液作为标准溶液的溶剂，100％乙腈作为正己烷除脂时下层溶液的溶剂，除脂后氮吹，用低浓度乙腈水溶液溶解，可有效提高ABZ回收率，并获得响应高、峰形好的色谱图。
实施例6
一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，考察几种常用除脂溶剂、净化剂对阿苯达唑及其代谢物回收率的影响。
(1)提取步骤：
1.1、称取6份2g均质雄鱼鱼肉放入50mL离心管，加标浓度为100μg/kg(含有ABZ，ABZ-SO，ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2)，平衡15-20分钟，提取过程为：加入10mL筛选合格的乙酸乙酯，涡旋1min，超声10min，6000rpm离心5min，上层清液转移至100mL旋蒸瓶；
1.2、重复1.1中的提取过程，合并上清液，40℃减压旋蒸至干，残留物用mL乙腈溶解，超声1min助溶，溶液转移至4mL离心管；
(2)净化步骤
2.1、其中1份样品用2mL正己烷分2次洗涤旋蒸瓶，洗涤液合并至4mL离心管，涡旋1min，6000rpm离心5min，除去上层溶剂，取700μL下层清液转移至1.5mL聚丙烯离心管。
2.2、另外5份样品分别加入50mg PSA、NH2、C18、硅藻土和中性Al2O3净化剂粉末，涡旋1min，6000rpm离心5min，取700μL下层清液转移至1.5mL聚丙烯离心管。
(3)再溶解步骤
上述样品全部常温氮吹至干，用700μL 20％乙腈水溶液溶解，涡旋1min，同时另外准备一份200μg/L混合标准工作液(含有ABZ，ABZ-SO，ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，溶剂为20％乙腈水溶液)，上述样品全部过0.45μm有机相针式滤器，随后用高效液相色谱(紫外检测器)检测。
高效液相色谱条件与实施例1一致。
回收率＝样品峰面积÷标准溶液峰面积×100％，考察结果参见图7。
从图7的结果可知：正己烷作为净化剂可以获得最高的ABZ-NH2-SO2回收率；从ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的总回收率来看，正己烷作为净化剂也有绝对的优势。考虑到以下几个原因：目前已有ABZ MRL定义的国家机构、国际组织，虽然对残留标志有争议，但都肯定了ABZ-NH2-SO2，只有两个国家——新西兰和澳大利亚将ABZ列为残留标志之一；ABZ-SO作为驱虫活性更高的药物可以被单独使用；欧盟和中国大陆将ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的综合定义为ABZ的残留标志，并规定在反刍动物肌肉内不得超过100μg/kg；在筛选合格乙酸乙酯、优化实验方法后，ABZ的回收率没有高于70％，且存在一定的氧化情况。基于上述原因，为了方法的实用性，把ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2作为目标检测物。而对ABZ和代谢物的同时检测，实施例1-5的考察结果具有重要的指导意义。
实施例7
一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，方法简化流程图参见图8，考察检测方法的特异性、准确性、精密性和灵敏性，包含以下步骤：
(1)提取步骤
1.1、称取2g均质草鱼鱼肉放入50mL离心管，加标ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2)，平衡15-20分钟，每一份的提取过程为：加入10mL所筛选合格的乙酸乙酯，涡旋1min，超声10min，6000rpm离心5min，上层清液转移至100mL旋蒸瓶；
1.2、重复1.1中的提取过程，合并上清液，40℃减压旋蒸至干，残留物用1mL乙腈溶解，超声1min助溶，溶液转移至4mL离心管；
(2)用2mL正己烷分2次洗涤旋蒸瓶，洗涤液合并至4mL离心管，涡旋1min，6000rpm离心5min，除去上层溶剂，取700μL下层清液转入1.5mL聚丙烯离心管中。
(3)常温氮吹至干，用700μL20％乙腈水溶液溶解，涡旋1min，过0.22μm有机相针式滤器，随后用液相色谱-串联质谱法检测。
(4)标准工作液(包含ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，溶剂为20％乙腈水溶液)浓度分别为：0.5、1、2、5、20、40、80、100μg/L，过0.22μm有机相针式滤器，随后用液相色谱-串联质谱法检测。为了筛选最优线性范围，以理论浓度为横坐标(x)，目标峰面积为纵坐标(y)做线性回归方程，判断标准：最低浓度偏差小于20％，其余浓度偏差必须小于15％。
液相色谱条件：
固定相：Poroshell 120EC-C18UHPLC柱(3.0×50mm,2.7μm)；
表2：流动相及洗脱条件
时间(min) 0.1％甲酸-水溶液(％) 0.1％甲酸-乙腈溶液(％)
0.00 80 20
4.00 20 80
4.40 20 80
4.50 80 20
8.50 80 20
流速：0.3mL/min；
进样体积：5μL；
柱温：室温。
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测；
电离电压：4000V；
离子源温度：100℃；
锥孔反吹气流量：80L/h；
脱溶剂气温度：320℃；
脱溶剂气流量：8L/min。
表3：3种代谢物母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量参数；
上述步骤1.1中，日内精密性考察：3个加标浓度1、20、40μg/kg，每个浓度5个平行样，在一天内制备；日间精密性考察：3个加标浓度1、20、40μg/kg，分3天制备，每天每个浓度5个平行样；灵敏性考察：加标浓度0.5μg/kg，5个平行样；特异性考察：15种空白不加标鱼样，包括草鱼、鲤鱼、鲫鱼、雄鱼、花鲶、乌鱼、青鱼、鲶鱼、鳊鱼、罗非鱼、翘嘴鲌、银鱼、虾、黄蜡丁和鲢鱼。
上述表3中，阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑氨基砜的定量子离子分别为239.9、158.9和133。
回收率计算样品峰面积÷根据标准工作曲线计算得到的峰面积×100％
灵敏性计算：加标浓度为0.5μg/kg的5个平行样，3.3倍的峰面积标准偏差SD除以标准工作曲线斜率，所得结果为方法检测限(LOD)；10倍的峰面积标准偏差SD除以标准工作曲线斜率，所得结果为方法定量限(LOQ)。
ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的色谱图见图9。
表4：阿苯达唑3种代谢物的线性相关系数(r2)、线性范围、方法检测限(LOD)和方法定量限(LOQ)
表5：日内精密性(用相对标准偏差RSD表示)、平均回收率(n＝5)
表6：日间精密性(用相对标准偏差RSD表示)和平均回收率(n＝15)
由表4-6的结果可知，阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑氨基砜，在线性范围内线性相关系数都超过0.999，线性良好，日内、日间精密度小于15％，平均回收率在87.01％-120.22％范围内，方法检测限分别为0.27、0.09和0.11μg/kg，总和为0.47μg/kg，可充分满足实际鱼样检测需求。
实施例8
一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，考察检测方法在实际鱼样中的应用，考察了湖南、江西、云南、青海、新疆和甘肃6个省的40个鱼样，包含草鱼、鲤鱼、鲫鱼、雄鱼、花鲶、乌鱼、青鱼、鲶鱼、鳊鱼、罗非鱼、翘嘴鲌、银鱼、虾、黄蜡丁和鲢鱼等15种鱼，每10个鱼样做1个平行样，1个加标浓度为1μg/kg的加标样，其余处理步骤与实施例7一致。
考察结果：有1条江西的草鱼被确诊有0.28μg/kg ABZ-SO、0.26μg/kg ABZ-SO2、0.46μg/kg ABZ-NH2-SO2，1个江西的雄鱼被确诊有0.12μg/kg ABZ-NH2-SO2。
以上所述，仅是本发明的较佳实例，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均扔属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (9)

1.一种从鱼肉中提取阿苯达唑类化合物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、称取2g均质鱼肉放入50mL离心管，提取过程为：加入10mL筛选合格的乙酸乙酯，涡旋1min，超声10min，6000rpm离心5min，上层清液转移至100mL旋蒸瓶；
S2、重复S1中的提取过程，合并上清液，旋蒸至干；
S3、旋蒸瓶内的残留物，用1mL有机溶剂溶解，超声1min助溶，溶液转移至4mL离心管；
S4、用2mL除脂溶剂分两次洗涤旋蒸瓶，溶液合并至4mL离心管，涡旋1min，6000rpm离心5min，除去上层溶剂；
S5、吸取700μL下层清液，常温氮吹至干，用等体积的极性溶液溶解，涡旋1min，过0.22μm有机相针式滤器，用液相色谱串联质谱法检测，外标法定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1步骤中所述筛选合格乙酸乙酯的步骤具体为：
S1-1、将30mL乙酸乙酯放入100mL旋蒸瓶，40℃旋蒸至干；
S1-2、用1mL一定浓度的标准工作液溶解，超声1min助溶，过0.45-μm有机相针式滤器，随后用高效液相色谱法(紫外检测器)检测，与等浓度标准工作液色谱图对照，色谱图没有明显差异则为筛选合格的乙酸乙酯。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S1-1步骤中，所述旋蒸方式为40℃减压旋蒸。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S1-2步骤中，所述标准工作液为阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑氨基砜的混合液，溶剂为20％乙腈水溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2步骤中，所述旋蒸方式为40℃减压旋蒸。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S3步骤中，有机溶剂为乙腈。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4步骤中，除脂溶剂为正己烷。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S5步骤中，极性溶液为20％乙腈水溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S5步骤中，外标法所用标准工作液中，溶质为阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑氨基砜，溶剂为20％乙腈水溶液。
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