CN103969374A - 一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物检测技术领域，公开了一种桑叶中阿苯达唑(ABZ)持留量的测定方法。本发明采用固相萃取法对目标物质进行纯化，纯化采用氨基固相萃取柱，并选用体积比为(5～20)：(80～95)的甲醇-二氯甲烷混合液活化固相萃取柱，用体积比为(1～10)：(90～99)的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，可以使得桑叶中的干扰组分几乎完全被萃取柱填料吸附，而目标成分阿苯达唑几乎完全洗脱而出，达到了桑叶组织中阿苯达唑的良好分离与富集，纯化后的样品可直接通过液相色谱进行定量。该方法具有简单易行、成本低且检测结果重复性好、准确度高的优点。

Description

一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法。

背景技术

中国蚕桑具有5000多年的历史，我国蚕丝及其丝绸制品的产销量约占世界总量的70％，是唯一可垄断世界贸易市场的出口商品。家蚕微粒子病因其具有胚种传染能力而对蚕种生产具有毁灭性的影响，是世界产丝国的检疫对象。近二十余年来，家蚕微粒子病在我国呈全国流行趋势，淘汰超毒蚕种量达数百万张，经济损失惨重。现有研究表明阿苯达唑是治疗家蚕微粒子病较理想的药物(杨琼，邢东旭，廖森泰等.家蚕微粒子病治疗药物的研究.广东蚕业，2010，44:35-37)。

阿苯达唑(albendazole，ABZ)是一种高效低毒，对线虫、吸虫及绦虫均具有较强驱防效应的苯并咪唑类药物，已被广泛应用于人体医学、畜禽养殖、水产养殖等多个领域。其在体内代谢为亚砜类或砜类后，抑制寄生虫对葡萄糖的吸收，导致虫体糖原耗竭，或抑制延胡索酸还原酶系统，阻碍ATP产生，使寄生虫无法存活和繁殖。目前，阿苯达唑作为饲料添加剂或配制成悬浊液喷洒桑叶是给家蚕喂食阿苯达唑的两种有效途径，对于广大蚕农而言，后者可操作性和经济性更强，更容易被接受。因此，喷洒在桑叶上阿苯达唑持留量的动态变化规律及其在桑叶上的药效期成为蚕桑业关注的焦点。然而，目前在阐明桑叶阿苯达唑持留量和药效随时间降解变化规律尚需要建立测定桑叶上阿苯达唑含量的方法。

早在20世纪80年代初，国外已有对不同生物材料中阿苯达唑及其代谢物残留量测定方法的研究报道，Alvinerie和Galtier(Alvinerie M,Galtier P.Simultaneous determination of albendazole and its principal metabolites in plasma bynormal phase high-performance liquid chromatography.Journal of Pharmaceutical&Biomedical Analysis，1984，2：73-79)利用正向高效液相色谱实现了绵羊血浆中阿苯达唑及其代谢物的同时测定，使用的UV检测器灵敏度较低。到了21世纪初，国内外在人体医学、畜禽养殖、水产养殖等多领域对各种生物组织材料中丙硫咪唑或苯并咪唑类物质测定方法的研究报道也逐渐丰富起来，如免疫分析法、毛细管电泳法、气-质联用法，液-质联用法等。Kitzman等(Dennis K，Cheng K，Fleckenstein L，HPLC assay for albendazole and metabolites in humanplasma for clinical pharmacokinetic studies.Journal of Pharmaceutical andBiomedical Analysis，2002，30：801-813)利用C18固相萃取柱对含阿苯达唑的人体血样在HPLC上机前进行萃取，能有效祛除杂质、排除干扰；Mottier等(Mottier L，Alvarez L，Lanusse C，Quantitative chromatographic determination ofseveral benzimidazole anthelmintic molecules in parasite material.Journal ofChromatography B，2003，798：117-125)也利用固相萃取柱、反向HPLC技术同时对绵羊、牛等绦虫寄主体内的苯并咪唑类药物含量进行了测定；林海丹等(林海丹，谢守新，吴映璇.固相萃取高效液相色谱法测定乳粉中苯并咪唑类药物残留.分析试验室，2005，24：27-29)建立了固相萃取高效液相色谱测定乳粉中苯并咪唑类药物残留的方法；刘勇军等(刘勇军，吴银良，姜艳彬，刘兴国，王海.固相萃取高效液相色谱法测定猪肉中六种苯并咪唑类药物残留的研究.食品科学，2009，30：212-214)也成功利用了固相萃取高效液相色谱法对猪肉中六种苯并咪唑类药物残留量进行了研究。这些已有的测定技术大多是通过固相萃取来达到待测物质与基体的分离纯化，然后利用高效液相色谱进行检测，这些方法均具有针对性强，灵敏度高和检测速率快的优越性。然而，由于植物基体组织与动物基体组织的成分差异，导致现有技术的固相萃取条件并不能实现植物基体组织中阿苯达唑的分离纯化，特别是桑叶中的黄酮类、生物碱和植物甾醇等成分会对阿苯达唑的检测产生严重的干扰，从而无法直接用高效液相色谱对桑叶基体组织中阿苯达唑的含量进行测定。

发明内容

为了解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法，包含以下操作步骤：

(1)样品提取：用乙腈萃取桑叶得到萃取液，萃取液浓缩后加入甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待净化液；

(2)样品纯化：采用氨基固相萃取柱，先用甲醇：二氯甲烷的体积比为(5～20)：(80～95)的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗活化固相萃取柱，然后立即加入步骤(1)中的待净化液，用甲醇：二氯甲烷的体积比为(1～10)：(90～99)的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，将收集的洗脱液浓缩后用甲醇定容，过微孔滤膜得到待检测液；

(3)样品检测：采用液相色谱对步骤(2)中待检测液进行检测，通过与标准曲线的比对得出样品中阿苯达唑的浓度并计算出阿苯达唑在桑叶中的持留量。

步骤(1)中所述样品提取的具体步骤为：准确称取0.6～1.0质量份干桑叶粉，用60～100质量份乙腈浸泡，涡旋振荡提取10～30min，真空抽滤料液，滤液转到具塞量筒中，加4～8质量份NaCl，振摇后静置分层，吸取30.0～50.0质量份上层乙腈溶液于旋转蒸发仪浓缩至质量的1/15～1/25，加入1～3质量份体积比为10：90的甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待净化液。

步骤(2)中所述氨基固相萃取柱规格为体积3～6mL，填料量300～500mg；所述微孔滤膜的孔径为0.22～0.45μm。

步骤(3)中所述标准曲线的制备方法为：精确称取阿苯达唑标准品25mg，在100mL乙腈中振荡至完全溶解，得到250μg/mL的标准储备液，再用乙腈将其稀释成浓度分别为5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、250μg/mL的标准溶液，标准溶液分别用液相色谱仪进行检测，绘制溶液浓度与峰面积的标准曲线。

步骤(3)中所述液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：Hypersil BDS C18，300mm×4.0mm，5μm；

流动相：体积比为(20～33)：(30～66)：(1～5)的乙腈-水-冰乙酸溶液；

柱温：35～40℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；检测器波长：254～292nm。

本发明的检测原理为：样品提取步骤通过选用合适溶剂萃取出桑叶中的阿苯达唑成分；样品纯化步骤的目的是要将阿苯达唑与桑叶中的黄酮类、生物碱和植物甾醇等干扰组分进行分离并进行富集，针对桑叶成分的特殊性，本发明选用氨基固相萃取柱，并选用甲醇：二氯甲烷的体积比为(5～20)：(80～95)的甲醇-二氯甲烷混合液活化固相萃取柱，用甲醇：二氯甲烷的体积比为(1～10)：(90～99)的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，可以使得干扰组分几乎完全被萃取柱填料吸附，而目标成分几乎完全洗脱而出；样品检测步骤通过液相色谱中阿苯达唑的峰面积与标准曲线进行比对得到其浓度，然后计算出桑叶组织中阿苯达唑的持留量。

本发明的技术方法具有如下优点及有益效果：

(1)本发明针对桑叶成分的特殊性，在样品纯化过程中通过采用特定的萃取柱和洗脱液，即可实现阿苯达唑与桑叶中干扰组分的良好分离，分离后的阿苯达唑可直接进行液相色谱定量分析，方法简单易行、成本低且检测结果重复性好；

(2)通过本发明的固相萃取条件具有较高的加标回收率，能实现阿苯达唑的良好富集，具有准确度高、灵敏度高的优点。

附图说明

图1为本发明绘制的标准曲线；图2为浓度为5μg/mL的阿苯达唑乙腈标准溶液的色谱图；图3～6分别为实施例1～4中样品检测的色谱图；图7为对比实施例1中样品检测的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

试验材料来源：

于2013年5月和10月分别进行两批次田间试验，试验地位于广州市郊的广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所白云基地内的国家桑树种质资源华南分圃，土壤质地为红黏土。供试桑树为长势良好的3年生品种“粤椹大10”(粤桑审2006002)。实验区分为处理一区、处理二区和空白区，每区面积50m²。处理一区和二区均用阿苯达唑(购于常州亚邦齐晖医药化工有限公司，纯度≥98％)悬浊液进行均匀喷桑处理：处理一区喷洒浓度为1000mg/L，处理二区喷洒浓度为1500mg/L，喷洒量均为5L/区；空白区则用同样体积的清水喷洒均匀。每个实验区设3小区，为3个重复。第一次喷药在5月份进行，处理后0(当天)、1、2、3、4、5、6、7、8、9d用五点法分别在各实验区取样，每区共取500g鲜叶，立即运回实验室进行冷冻干燥，并研磨成桑叶粉末(80目)，得到待测干桑叶粉和空白干桑叶粉。

标准曲线绘制：

精确称取阿苯达唑标准品25mg，在100mL乙腈中振荡至完全溶解，得到250μg/mL的标准储备液，再用乙腈将其稀释成浓度分别为5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、250μg/mL的标准溶液；

采用以下液相色谱条件对标准溶液进行测定：

色谱柱：Hypersil BDS C18，300mm×4.0mm，5μm；

流动相：体积比为33：66：1的乙腈-水-冰乙酸溶液；

柱温：35℃；流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；检测器波长：292nm；

所得结果以标准溶液的浓度值(x)为横坐标，以各浓度所得的对应峰面积数值(y)为纵坐标绘制标准曲线，结果如图1所示；5μg/mL标准溶液的色谱图如图2所示。

实施例1

一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法，具体操作步骤如下：

(1)样品提取：准确称取0.8g待测干桑叶粉，加80g乙腈浸泡，涡旋振荡提取20min，真空抽滤料液，滤液转到100mL具塞量筒中，加6g NaCl，振摇1min后静置分层，吸取40.0g上层乙腈溶液于旋转蒸发仪在45℃条件下浓缩至1/20，加入2g体积比为10：90的甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待净化液；

(2)样品纯化：首先用5mL甲醇：二氯甲烷的体积比为10：90的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗氨基固相萃取柱，氨基固相萃取柱规格为体积6mL，填料量300mg，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，弃去淋洗液，立即加入步骤(1)中的待净化液，用4.0mL甲醇：二氯甲烷的体积比为1：99的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，将收集的洗脱液于旋转蒸发仪浓缩至1/20，用甲醇准确定容至4.0mL，在涡旋仪上混匀，过0.22μm微孔滤膜得到待检测液；

(3)样品检测：采用以下液相色谱条件对步骤(2)中的待检测液进行测定：

色谱柱：Hypersil BDS C18，300mm×4.0mm，5μm；

流动相：体积比为33：66：1的乙腈-水-冰乙酸溶液；

柱温：35℃；流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；检测器波长：292nm。

测定结果如图3所示，由图中可以看出：试验样品中阿苯达唑的保留时间(8.191min)与标准品的保留时间(8.037min)基本一致，峰形良好，周围基本无杂质峰干扰，通过与标准曲线的比对可计算出本实施例试验样品中阿苯达唑的持留量为236.69mg/kg。

实施例2

一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法，具体操作步骤如下：

(1)样品提取：准确称取0.6g待测干桑叶粉，加60g乙腈浸泡，涡旋振荡提取25min，真空抽滤料液，滤液转到100mL具塞量筒中，加4g NaCl，振摇1min后静置分层，吸取50.0g上层乙腈溶液于旋转蒸发仪在45℃条件下浓缩至1/20，加入3g体积比为10：90的甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待净化液；

(2)样品纯化：首先用5mL甲醇：二氯甲烷的体积比为20：80的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗氨基固相萃取柱，氨基固相萃取柱规格为体积3mL，填料量300mg，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，弃去淋洗液，立即加入步骤(1)中的待净化液，用4.0mL甲醇：二氯甲烷的体积比为10：90的甲醇-二氯甲烷混合液洗脱，将收集的洗脱液于旋转蒸发仪浓缩至1/20，用甲醇准确定容至4.0mL，在涡旋仪上混匀，过0.30μm微孔滤膜得到待检测液；

(3)样品检测：采用以下液相色谱条件对步骤(2)中的待检测液进行测定：

色谱柱：Hypersil BDS C18，300mm×4.0mm，5μm；

流动相：体积比为33：66：1的乙腈-水-冰乙酸溶液；

柱温：35℃；流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；检测器波长：292nm。

测定结果如图4所示，由图中可以看出：试验样品中阿苯达唑的保留时间(8.194min)与标准品的保留时间(8.037min)基本一致，峰形良好，周围基本无杂质峰干扰，通过与标准曲线的比对可计算出本实施例试验样品中阿苯达唑的持留量为92.60mg/kg。

实施例3

一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法，具体操作步骤如下：

(1)样品提取：准确称取1.0g待测干桑叶粉，加100g乙腈浸泡，涡旋振荡提取10min，真空抽滤料液，滤液转到100mL具塞量筒中，加8g NaCl，振摇1min后静置分层，吸取30.0g上层乙腈溶液于旋转蒸发仪在45℃条件下浓缩至1/15，加入1g体积比为10：90的甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待净化液；

(2)样品纯化：首先用5mL甲醇：二氯甲烷的体积比为5：95的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗氨基固相萃取柱，氨基固相萃取柱规格为体积5mL，填料量500mg，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，弃去淋洗液，立即加入步骤(1)中的待净化液，用4.0mL甲醇：二氯甲烷的体积比为5：95的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，将收集的洗脱液于旋转蒸发仪浓缩至1/20，用甲醇准确定容至4.0mL，在涡旋仪上混匀，过0.45μm微孔滤膜得到待检测液；

(3)样品检测：采用以下液相色谱条件对步骤(2)中的待检测液进行测定：

色谱柱：Hypersil BDS C18，300mm×4.0mm，5μm；

流动相：体积比为33：66：1的乙腈-水-冰乙酸溶液；

柱温：35℃；流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；检测器波长：292nm。

测定结果如图5所示，由图中可以看出：试验样品中阿苯达唑的保留时间(8.229min)与标准品的保留时间(8.037min)基本一致，峰形良好，周围基本无杂质峰干扰，通过与标准曲线的比对可计算出本实施例试验样品中阿苯达唑的持留量为253.91mg/kg。

实施例4

一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法，具体操作步骤如下：

(1)样品提取：准确称取0.8g待测干桑叶粉，加100g乙腈浸泡，涡旋振荡提取20min，真空抽滤料液，滤液转到100mL具塞量筒中，加8g NaCl，振摇1min后静置分层，吸取50.0g上层乙腈溶液于旋转蒸发仪在45℃条件下浓缩至1/25，加入2g体积比为10：90的甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待净化液；

(2)样品纯化：首先用5mL甲醇：二氯甲烷的体积比为5：95的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗氨基固相萃取柱，氨基固相萃取柱规格为体积6mL，填料量500mg，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，弃去淋洗液，立即加入步骤(1)中的待净化液，用4.0mL甲醇：二氯甲烷的体积比为1：99的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，将收集的洗脱液于旋转蒸发仪浓缩至1/20，用甲醇准确定容至4.0mL，在涡旋仪上混匀，过0.35μm微孔滤膜得到待检测液；

(3)样品检测：采用以下液相色谱条件对步骤(2)中的待检测液进行测定：

色谱柱：Hypersil BDS C18，300mm×4.0mm，5μm；

流动相：体积比为20：30：5的乙腈-水-冰乙酸溶液；

柱温：40℃；流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；检测器波长：254nm。

测定结果如图6所示，由图中可以看出：试验样品中阿苯达唑的保留时间(8.385min)与标准品的保留时间(8.037min)基本一致，峰形良好，周围基本无杂质峰干扰，通过与标准曲线的比对可计算出本实施例试验样品中阿苯达唑的持留量为203.63mg/kg。

对比实施例1

采用现有技术动物组织中阿苯达唑分离的固相萃取条件：固相萃取柱选用HLB柱，分离采用20％体积分数的甲醇水溶液淋洗，然后采用甲醇洗脱，其它检测条件如同实施例1，对实施例1的待测干桑叶粉中阿苯达唑持留量进行检测，测定结果如图7所示。由图7可以看出，目标物质峰峰形不正，拖尾严重，无法达到准确定量的要求。

方法学验证及数据统计分析

参照Buick等的步骤(Buick.A R，Doig M V，Jeal S C，et al.(1990)Methodvalidation in the bioanalytical laboratory.Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis8：629-637.)，对本检测方法进行方法学验证。包括方法的重复性(精密度)、回收率(准确度)、检测限和定量限(灵敏度)；利用色谱仪分析自带软件对液谱、质谱信号数据进行分析、物质峰面积的自动积分、色谱质谱图的生成；对数据进行物质含量、线性回归分析、相对标准偏差等统计分析。验证及分析结果如下所述。

方法重复性验证：

选取浓度为15μg/mL、100μg/mL、250μg/mL的标准液和实施例1中的待测干桑叶粉进行测定，在同一天内分别重复进样6次，分析各样品的变异系数，考察日内精密度；对上述样品进行连续三天的重复测定，分析各样品的变异系数，考察日间精密度，结果用保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSDs)表示(见表1)，结果显示日内精密度样品峰保留时间变异系数＜3.00％，峰面积的变异系数范围在2.40％～5.51％；日间精密度样品峰保留时间变异系数＜4.00％；峰面积的变异系数范围在3.70％～5.69％，日内和日间的精密度检验得到的变异系数均在可接受范围，说明本方法具有良好的重复性。

表1精密度试验ABZ信号峰保留时间和峰面积的变异系数(n＝6)

方法加标回收率验证：

精确称取空白干桑叶粉1.0g，按实施例1的步骤(1)和(2)处理后，按阿苯达唑和干桑叶粉的质量比为0.5μg/g、1.0μg/g、5.0μg/g分别添加阿苯达唑标准品，按实施例1的色谱条件，重复测定3次，计算回收率及变异系数，结果如表2所示。

表2加标桑叶阿苯达唑回收率与变异系数

由表2可以看出，阿苯达唑浓度在0.5μg/g以上时，本方法的加标回收率在80.67％以上。

方法检测限及定量限验证：

对标准曲线最低浓度5μg/mL的标样进样量为10μL，S/N＝3时，测算方法的检测限(LOD)为0.02mg/kg DW；当S/N＝10时，测算方法的定量限(LOQ)为0.09mg/kg DW，二者均能满足实际生产中的测定要求。

利用本发明的测定方法研究桑叶中阿苯达唑的持留量规律：

按照实施例1的方法，对各处理区采集的桑叶待测样品进行多次(n＝6)重复测定，绘制桑叶上阿苯达唑的持留量规律，评估药物的时效性。在采样期0～9d内，桑叶样品阿苯达唑持留量范围在304.8～25.15mg/kg，随时间逐渐消解减低，消解动态规律符合一级动力学方程。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法，其特性在于：具体操作步骤如下：

(1)样品提取：用乙腈萃取桑叶得到萃取液，萃取液浓缩后加入甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待净化液；

(2)样品纯化：采用氨基固相萃取柱，先用甲醇：二氯甲烷的体积比为(5～20)：(80～95)的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗活化固相萃取柱，然后加入步骤(1)中的待净化液，用甲醇：二氯甲烷的体积比为(1～10)：(90～99)的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，收集洗脱液后浓缩，用甲醇溶解定容，过微孔滤膜得到待检测液；

(3)样品检测：采用液相色谱对步骤(2)中待检测液进行检测，通过与标准曲线的比对得出样品中阿苯达唑的浓度并计算出阿苯达唑在桑叶中的持留量。

2.根据权利要求1所述的一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法，其特征在于：步骤(1)中所述样品提取的具体步骤为：称取0.6～1.0质量份干桑叶粉，用60～100质量份乙腈浸泡，涡旋振荡提取10～30min，真空抽滤料液，滤液转到具塞量筒中，加4～8质量份NaCl，振摇后静置分层，吸取30.0～50.0质量份上层乙腈溶液于旋转蒸发仪浓缩至质量的1/15～1/25，加入1～3质量份体积比为10：90的甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待净化液。

3.根据权利要求1所述的一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法，其特征在于：步骤(2)中所述氨基固相萃取柱规格为体积3～6mL，填料量300～500mg；所述微孔滤膜的孔径为0.22～0.45μm。

4.根据权利要求1所述的一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法，其特征在于：步骤(3)中所述标准曲线的制备方法为：精确称取阿苯达唑标准品25mg，在100mL乙腈中振荡至完全溶解，得到250μg/mL的标准储备液，再用乙腈将其稀释成浓度分别为5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、250μg/mL的标准溶液，标准溶液分别用液相色谱进行检测，绘制溶液浓度与峰面积的标准曲线。

5.根据权利要求1或4所述的一种桑叶中阿苯达唑持留量的测定方法，其特征在于：所述液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：Hypersil BDS C18，300mm×4.0mm，5μm；

流动相：体积比为(20～33)：(30～66)：(1～5)的乙腈-水-冰乙酸溶液；

柱温：35～40℃；流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；检测器波长：254～292nm。