CN114563507B - 一种动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法、检测方法及应用 - Google Patents
一种动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法、检测方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供一种动物组织内的β‑受体激动剂残留的处理方法、检测方法及应用，属于食品检测技术领域。动物组织内的β‑受体激动剂残留的处理方法包括：向含有样品、内标物、缓冲液和β‑葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶的第一混合液中插入超声探针，在700～1100W的输出功率条件下超声探针辅助酶解1～5min。本申请的动物组织内的β‑受体激动剂残留的处理方法，通过超声探针辅助酶解能够在5min内达到传统酶解16h的提取效率，大幅降低动物组织内的β‑受体激动剂残留的处理时间，具有更高效、准确和便利的特点。
Description
技术领域
本申请涉及食品检测技术领域，具体而言，涉及一种动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法、检测方法及应用。
背景技术
β-受体激动剂俗称“瘦肉精”，属于苯乙醇胺类药物，医学临床上主要用于扩张支气管和增加肺通气量，可治疗支气管哮喘等呼吸系统疾病。因其具有加速脂肪分解、促进蛋白质合成和提高饲料转化率等功效，β-受体激动剂被大量非法用于动物养殖，以提高瘦肉率。此外，由于β-受体激动剂(特别是沙丁胺醇)对动物毛细血管具有显著扩张作用，使饲喂后动物在短时间内饮水量大增，达到类似于“注水肉”的效果。由于此类饲喂往往是在出栏或屠宰前，药物未经过充分代谢，导致残留量高，因而比养殖环节饲喂更加危险。我国早就公告禁止克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等β-受体激动剂用于畜禽养殖，随着多年来持续高压打击以及全国范围内生猪定点屠宰政策的实施，生猪“瘦肉精”问题已基本得到解决。然而，经近些年曝光，发现“瘦肉精”非法使用有从生猪向反刍动物转移的趋势。
为对“瘦肉精”进行有效监控，目前国内外已开发了大量关于动物组织、尿液、血液和饲料中β-受体激动剂的确证分析方法。研究显示β-受体激动剂易在肝脏葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶的作用下生成极性更强的葡萄糖醛酸和硫酸结合态，增加水溶性，从而有利于从尿液和胆汁中排出，这也被证实为β-受体激动剂主要的解毒和代谢途径。因此，目前针对动物组织、尿液、血液中β-受体激动剂的检测主要采用酶解结合固相萃取(Solid-PhaseExtraction，简称SPE)方法，但酶解时间往往长达16h以上，固相萃取时间也较长，特别是在对全国性“瘦肉精”监测大批量样品处理时，工作效率较低，纯手动操作带来的检测偏差也较大。
发明内容
本申请提供了一种动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法、检测方法及应用，其能够快速且准确检测动物组织内是否含有β-受体激动剂及定量。
本申请的实施例是这样实现的：
在第一方面，本申请示例提供了一种动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法，其包括：向含有样品、内标物、缓冲液和β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶的第一混合液中插入超声探针，在700～1100W的输出功率条件下超声探针辅助酶解1～5min。
在上述技术方案中，本申请的动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法，通过超声探针辅助酶解能够在5min内达到传统酶解16h的提取效率，大幅降低动物组织内的β-受体激动剂残留的处理时间，具有更高效、准确和便利的特点。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第一种可能的示例中，上述β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶和样品的单元质量比≥85000units/g。
可选地，β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶的浓度≥400units/mL。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第二种可能的示例中，上述第一混合液的pH值为5～7。
可选地，第一混合液的pH值为5～6。
可选地，第一混合液的pH值为5.5。
在上述示例中，缓冲液用于将第一混合液的pH值调节至5～7。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第三种可能的示例中，完成上述酶解后制得第二混合液，向第二混合液中加入沉淀剂，并离心取上清液。
可选地，沉淀剂为质量分数为70～72wt％的高氯酸溶液。
可选地，高氯酸溶液和样品的体积质量比为0.5～2mL/g。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第四种可能的示例中，制得上述上清液后，采用全自动固相萃取仪对上清液进行净化，上清液的进样速率为1～3mL/min。
在上述示例中，固相萃取的方法能够去除上清液中的大分子蛋白和脂肪，全自动固相萃取仪能够实现样品的批量、自动化处理，提高样品的处理的工作效率，并有效避免人为操作带来的结果偏差。本申请以全自动固相萃取仪净化与超声探针辅助酶解配合，该配合方法具有快速、简便和高通量的特点，适用于大批量的动物组织样品的处理。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第五种可能的示例中，采用全自动固相萃取仪对上述上清液进行净化包括：先对管路进行冲洗，然后依次进行活化处理、上样、淋洗和洗脱。
活化处理包括先采用甲醇活化，再采用去离子水活化。
淋洗包括先采用去离子水淋洗，再采用甲醇淋洗。
洗脱包括采用氧化甲醇溶液洗脱并收集液体。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第六种可能的示例中，上述β-受体激动剂包括克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗、克伦普罗、妥布特罗、利托君、沙美特罗、喷布特罗、马喷特罗、福莫特罗、异克舒令、克伦赛罗和拉贝特罗中的任意一种或多种；
内标物包括克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3、苯乙醇胺A-D3、氯丙那林-D7、西马特罗-D7、西布特罗-D9、马布特罗-D9、克伦普罗-D7和沙美特罗-D3中的任意一种或多种。
在第二方面，本申请示例提供了一种动物组织内的β-受体激动剂残留的检测方法，其包括：先采用上述的动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法对样品进行前处理，然后采用液相色谱-串联质谱联用法对经处理后的样品进行分析，内标法定量。
在上述技术方案中，本申请的动物组织内的β-受体激动剂残留的检测方法能够大幅降低检测时长，提高检测效率，实现大批量动物组织样品的日常监测。
结合第二方面，在本申请的第二方面的第一种可能的示例中，上述液相色谱的色谱柱采用Waters Acquity BEH C18色谱柱，柱温为32～38℃。
在第三方面，本申请示例提供了一种上述的动物组织内的β-受体激动剂残留的检测方法在检测β-受体激动剂的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请的超声探针辅助酶解示意图；
图2为本申请试验例1猪肝添加22种β-受体激动剂(1.0μg/kg)UPLC-MS/MS谱图的第一部分；
图3为本申请试验例1猪肝添加22种β-受体激动剂(1.0μg/kg)UPLC-MS/MS谱图的第二部分；
图4为本申请试验例1猪肝添加22种β-受体激动剂(1.0μg/kg)UPLC-MS/MS谱图的第三部分；
图5为本申请试验例1猪肝添加22种β-受体激动剂(1.0μg/kg)UPLC-MS/MS谱图的第四部分；
图6为本申请试验例1猪肝添加22种β-受体激动剂(1.0μg/kg)UPLC-MS/MS谱图的第五部分；
图7为本申请试验例1中猪肝添加22种β-受体激动剂(1.0μg/kg)UPLC-MS/MS谱图的第六部分；
图8为本申请试验例2中酶用量对提取效率的影响示意图的第一部分；
图9为本申请试验例2中酶用量对提取效率的影响示意图的第二部分；
图10为本申请试验例3中酶解时间对提取效率的影响示意图的第一部分；
图11为本申请试验例3中酶解时间对提取效率的影响示意图的第二部分；
图12为本申请试验例4中超声探针处理时间对22种β-受体激动剂的稳定性影响示意图的第一部分；
图13为本申请试验例4中超声探针处理时间对22种β-受体激动剂的稳定性影响示意图的第二部分；
图14为本申请试验例5中超声探针输出功率对22种β-受体激动剂的稳定性影响示意图的第一部分；
图15为本申请试验例5中超声探针输出功率对22种β-受体激动剂的稳定性影响示意图的第二部分。
图标：100-超声探针：200-超声波发生器；300-样品。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下针对本申请实施例的一种动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法、检测方法及应用进行具体说明：
本申请提供一种动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法，其包括：向含有样品、内标物、缓冲液和β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶的第一混合液中插入超声探针。
β-受体激动剂包括克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗、克伦普罗、妥布特罗、利托君、沙美特罗、喷布特罗、马喷特罗、福莫特罗、异克舒令、克伦赛罗和拉贝特罗中的任意一种或多种；
内标物包括克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3、苯乙醇胺A-D3、氯丙那林-D7、西马特罗-D7、西布特罗-D9、马布特罗-D9、克伦普罗-D7和沙美特罗-D3中的任意一种或多种。
β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶和样品的单元质量比≥85000units/g。
当β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶和样品的单元质量比为800units/g，β-受体激动剂具有较好的回收率，不同的β-受体激动剂的回收率均在90％以上。继续增加β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶的用量，β-受体激动剂的回收率的增幅并不明显。
但由于β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶价格昂贵，为了尽可能降低试验成本，选择β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶和样品的单元质量比为400units/g，也能够基本满足检测需求。
缓冲液用于调节第一混合液的pH值至5～7。
可选地，第一混合液的pH为5～6。
可选地，第一混合液的pH为5.5。
缓冲液包括乙酸铵溶液、柠檬酸溶液和磷酸盐溶液中的任意一种或多种。
可选地，缓冲液的浓度为0.1～0.2mol/L。
请参阅图1，超声探针100的一端连接于超声波发生器200，另一端伸入到样品中，且超声探针100的端部伸入到样品300中的位置为样品的三分之一到三分之二的高度处。
设置超声波发生器200的输出功率为700～1100W。
在本申请的一种实施方式中，超声波发生器200的输出功率为1100W。在本申请的其他一些实施方式中，超声波发生器200的输出功率还可以为700W、800W、900W或1000W。
将超声探针100的端部伸入到样品300中后，辅助酶解1～5min。
在本申请的一种实施方式中，超声探针辅助酶解的时间为120s。在本申请的其他一些实施方式中，超声探针辅助酶解的时间还可以为60s、90s、150s、180s、210s、240s、270s或300s。
超声探针100可以为直径为1mm、2mm或3mm的钛探针。
完成酶解后制得第二混合液，向第二混合液中加入沉淀剂混匀，在8000～11000的转速下离心3～6min，取上清液。
可选地，沉淀剂为质量分数为70～72wt％的高氯酸溶液。
可选地，高氯酸溶液和样品的体积质量比为0.5～2mL/g。
可选地，离心为冷冻离心。
采用全自动固相萃取仪对上清液进行净化，上清液的进样速率为1～3mL/min。
固相萃取的方法能够去除上清液中的大分子蛋白和脂肪，全自动固相萃取仪能够实现样品的批量、自动化处理，提高样品的处理的工作效率，并有效避免人为操作带来的结果偏差。
采用全自动固相萃取仪对上清液进行净化时，将上清液全部过固相萃取柱，按表1进行程序设定。洗脱后，收集洗脱液于50℃氮气吹至近干，用1.0mL乙腈/水溶液(体积比10:90，且含0.1v/v％甲酸)复溶，过0.22μm有机滤膜，制得第三混合液。
表1全自动固相萃取仪净化程序
| 序号 | 净化程序 | 溶剂 | 输出方式 | 流速(mL/min) | 体积(mL) |
| 1 | 冲洗管路 | 甲醇 | 废液 | 60 | 5 |
| 2 | 活化 | 甲醇 | 废液 | 10 | 5 |
| 3 | 活化 | 水 | 废液 | 10 | 5 |
| 4 | 上样 | / | 废液 | 1～3 | 6 |
| 5 | 淋洗 | 水 | 废液 | 2 | 3 |
| 6 | 淋洗 | 甲醇 | 废液 | 2 | 3 |
| 7 | 洗脱 | 氨化甲醇溶液 | 收集 | 2 | 3 |
可选地，固相萃取柱为赛默飞MCX固相萃取柱。
本申请还提供一种动物组织内的β-受体激动剂残留的检测方法，其包括：先采用上述的动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法对样品进行前处理，然后采用液相色谱-串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)对经处理后的样品进行分析，内标法定量。
液相色谱条件：Waters Acquity BEH C18色谱柱(100mm×3.0mm，1.7μm)；柱温35℃；进样室温度4℃；进样体积10μL；流动相A为0.1v/v％甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.45mL/min。其中，梯度洗脱条件如表2。
表2流动相梯度洗脱条件
| 时间(min) | 流速(mL/min) | 流动相A(0.1v/v％甲酸溶液) | 流动相B(乙腈) | 切换模式 |
| 0 | 0.45 | 95 | 5 | 6 |
| 1.0 | 0.45 | 95 | 5 | 6 |
| 2.0 | 0.45 | 80 | 20 | 6 |
| 6.0 | 0.45 | 70 | 30 | 6 |
| 7.0 | 0.45 | 20 | 80 | 6 |
| 8.0 | 0.45 | 2 | 98 | 6 |
| 10.0 | 0.45 | 2 | 98 | 6 |
| 10.1 | 0.45 | 95 | 5 | 6 |
| 12.0 | 0.45 | 95 | 5 | 6 |
串联质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描(ESI+)，多反应监测模式(MRM)；脱溶剂气为高纯氮气，流速800L/h；碰撞气为高纯氩气，流速0.13mL/min，使用前调节各气体流量以使质谱灵敏度达到最优状态。β-受体激动剂和内标的MRM条件如表3所示。
表3β-受体激动剂和内标的MRM质谱条件
本申请还提供一种上述的动物组织内的β-受体激动剂残留的检测方法在检测β-受体激动剂的应用。
以下结合实施例对本申请的一种动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法、检测方法及应用作进一步的详细描述。
实施例1
本申请实施例提供动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法、检测方法，其包括：
1、仪器和试剂
Waters Acquity XEVO TQS超高效液相色谱-串联质谱仪，配备电喷雾离子源(ESI)，MassLynx 4.1工作站(美国Waters公司)；HD 2200超声波发生器(德国Bandelin公司)，配有直径为3mm钛探针；RayKol Fotector Plus全自动固相萃取仪(睿科仪器(厦门)有限公司)；3K15高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；N-EVAP 112氮吹仪(美国Organomation公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Milli-Q公司)；BS 210S分析天平(德国Sartorius公司)；MS2Minishaker旋涡振荡器(德国IKA公司)。
22种β-受体激动剂为克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗、克伦普罗、妥布特罗、利托君、沙美特罗、喷布特罗、马喷特罗、福莫特罗、异克舒令、克伦赛罗和拉贝特罗。
10种β-受体激动剂内标为克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3、苯乙醇胺A-D3、氯丙那林-D7、西马特罗-D7、西布特罗-D9、马布特罗-D9、克伦普罗-D7和沙美特罗-D3。
22种β-受体激动剂和10种β-受体激动剂内标均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。
β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶(≥85000units/mL)购自美国Sigma公司；色谱纯甲醇、乙腈、甲酸、氨水购自美国Fisher公司；乙酸铵、冰乙酸、高氯酸(分析纯)购自国药集团化学试剂公司；Oasis MCX固相萃取柱(60mg/3cc)购自美国Waters公司；0.22μm有机滤膜购自天津市腾达过滤器件厂)。
2、配制溶液
β-受体激动剂单标储备液：分别精密称取22种β-受体激动剂标准品于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，每种β-受体激动剂配制成浓度均为1mg/mL的单标储备液，4℃避光保存。
β-受体激动剂混合标准工作液：分别吸取各β-受体激动剂单标储备液，用0.2v/v％甲酸水溶液稀释成浓度为1g/mL的混合标准工作液，4℃避光保存。
β-受体激动剂内标储备液：分别精密称取10种β-受体激动剂内标于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度均为100g/mL的内标储备液，4℃避光保存。
β-受体激动剂内标工作液：分别吸取各β-受体激动剂内标储备液，用0.2v/v％甲酸水溶液稀释成浓度为200ng/mL的内标工作液，4℃避光保存。
乙酸铵缓冲液(0.2mol/L，pH值为5.2)：称取15.4g乙酸铵，溶于约800mL水中，用冰乙酸调节pH至5.2，用水稀释至1L。
高氯酸溶液(30％，v/v)：取30mL高氯酸与70mL水混匀。
氨化甲醇洗脱液(5％，v/v)：取5mL氨水与95mL甲醇混匀。
3、β-受体激动剂残留的处理方法
称取2g猪肝样品于10mL离心管中，加入10μL内标工作液，涡旋混匀，继续加入5mL乙酸胺缓冲液和20μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混匀，将超声探针插入样品溶液约1/2高度处，在1100W输出功率下超声探针辅助辅酶120s后制得第二混合液。向第二混合液中加入1mL高氯酸溶液，旋涡混匀30s，在转速10000r/min下冷冻离心5min，取上清液；
采用全自动固相萃取仪对上清液进行净化时，将上清液全部过固相萃取柱，按上述表1进行程序设定，上样速率为2mL/min。洗脱后，收集洗脱液于50℃氮气吹至近干，用1.0mL乙腈/水溶液(体积比10:90，且含0.1v/v％甲酸)复溶，过0.22μm有机滤膜，制得第三混合液。
4、β-受体激动剂残留的检测方法
采用液相色谱-串联质谱联用法对经处理后的样品进行分析，内标法定量。
液相色谱条件：Waters Acquity BEH C18色谱柱(100mm×3.0mm，1.7μm)；柱温35℃；进样室温度4℃；进样体积10μL；流动相A为0.1w％甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.45mL/min。其中，梯度洗脱条件如上述表2。
串联质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描(ESI+)，多反应监测模式(MRM)；脱溶剂气为高纯氮气，流速800L/h；碰撞气为高纯氩气，流速0.13mL/min，使用前调节各气体流量以使质谱灵敏度达到最优状态。22种β-受体激动剂和内标的MRM条件如上述表3所示。
试验例1
空白样品按实施例1(无2g猪杆样品)进行提取和净化，在SPE洗脱液中分别加入10μLβ-受体激动剂混合标准工作液和10μLβ-受体激动剂内标工作液，氮气吹干、复溶，使得22种β-受体激动剂的浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0μg/L。以目标化合物的浓度为横坐标，定量离子峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表4所示。在0.5～100μg/L线性范围内，方法的线性关系良好(r≥0.9971)。以信噪比(S/N＝3)为检出限，S/N＝10为定量限，确定本方法的检出限、定量限分别为0.3和1.0μg/kg。
表4基质添加标准曲线回归方程和相关系数
在空白基质中添加β-受体激动剂混合标准工作液，并设置3个添加水平(1、2和10μg/kg)，按照实施例1的方法分别进行6次平行试验，计算回收率和变异系数(RSD)，代表性的添加回收UPLC-MS/MS谱图见图2～7。结果见表5和6，22种β-受体激动剂的平均回收率在81.2～100.7％之间，满足残留检测方法要求。
表5方法的准确度和精密度
表6方法的准确度和精密度
为进一步验证方法的准确度，从英国政府化学家实验室(Laboratory of theGovernment Chemist，LGC)购买猪肝标准样品，分别采用本方法和国家标准方法《进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》(SN/T 1924-2011)进行测定，标准方法测得克伦特罗、沙丁胺醇含量分别为2.87±0.10μg/kg、1.74±0.08μg/kg，本方法测得克伦特罗、沙丁胺醇含量分别为2.90±0.03μg/kg、1.76±0.04μg/kg，表明本方法建立的分析方法性能良好。
试验例2
称取2g猪肝样品，分别加入10、20、30、50、80、100μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，按实施例1的方法进行提取和测试，并在SPE洗脱液中分别加入10μLβ-受体激动剂混合标准工作液，结果如表7、图8和图9所示。其中，图8和图9中每种药物的横坐标从左向右依次为10、20、30、50、80和100μL。
表7分别加入10、20、30、50、80、100μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶的回收率
由表7、图8和图9可知，加入20μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶时22种β-受体激动剂均取得了较好的回收率(＞90％)，继续增加酶的用量，回收率增幅并不明显。
试验例3
称取2g猪肝样品，按实施例1的方法进行提取和测试，并在SPE洗脱液中分别加入10μLβ-受体激动剂混合标准工作液，分别在超声探针上酶解处理30、60、90、120、150、180、240、300s，结果如表8、图10和图11所示。其中，图10和图11中每种药物的横坐标从左向右依次为30、60、90、120、150、180、240和300s。
表8分别在超声探针上酶解处理30、60、90、120、150、180、240、300s的回收率
由表8、图10和图11可知，在酶解时间为60～300s时，22种β-受体激动剂均可取得较为满意的回收率，特别是当酶解时间≥120s时，22种β-受体激动剂均可达到90％以上。继续提高酶解时间，回收率提升并不明显。
试验例4
将2g猪肝改为10μLβ-受体激动剂混合标准工作液，超声探针的处理时间率分别为1、2、3、4、5、6、7和8min，按实施例1的方法进行提取和测试，结果如表9、图12和图13所示。其中，图12和图13中每种药物的横坐标从左向右依次为1、2、3、4、5、6、7和8min。
表9超声探针分别处理1、2、3、4、5、6、7和8min的相对响应值
由表9、图12和图13可知，在5min内，22种β-受体激动剂的稳定性良好，但超过5min后，苯乙醇胺A、班布特罗、沙美特罗和福莫特罗可能发生了降解。
将2g猪肝改为10μLβ-受体激动剂混合标准工作液，超声探针的输出功率分别为700、800、900、1000和1100W，按实施例1的方法进行提取和测试，结果如表10、图14和图15所示。其中，图14和图15中每种药物的横坐标依次为700、800、900、1000和1100W。
表9超声探针分别处理700、800、900、1000和1100W的回收率
由表9、图14和图15可知，超声探针的功率为～1100W时，22种β-受体激动剂均可取得较为满意的回收率。
试验例5
将全自动固相萃取仪的上样速率改为2mL/min、10mL/min和5mL/min，按实施例1的方法进行提取和测试。当上样速率为10mL/min或5mL/min时，22种β-受体激动剂的回收率低于50％；当上样速率为2mL/min时，22种β-受体激动剂的回收率均在80％以上。
综上所述，本申请实施例提供一种动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法、检测方法及应用。处理方法通过超声探针辅助酶解能够在5min内达到传统酶解16h的提取效率，大幅降低动物组织内的β-受体激动剂残留的处理时间，显著提高了工作效率。全自动固相萃仪可以在无人值守的情况下完成固相萃取步骤，节约人工时间，同时能够将试验中的人为误差降至最低，相较于手动固相萃取具有操作方便、稳定性强、可批量处理等优点。本申请的处理方法以全自动固相萃取仪净化与超声探针辅助酶解配合，该配合方法具有快速、简便和高通量的特点，适用于大批量的动物组织样品的处理。检测方法能够大幅降低检测时长，提高检测效率，实现大批量动物组织样品的日常监测。
以上所述仅为本申请的具体实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法，其特征在于，所述β-受体激动剂残留的处理方法包括：向含有样品、内标物、缓冲液和β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶的第一混合液中插入超声探针，在700~1100W的输出功率条件下超声探针辅助酶解1~5min，所述第一混合液的pH值为5~7；完成所述酶解后制得第二混合液，向所述第二混合液中加入沉淀剂，并离心取上清液；所述沉淀剂为质量分数为70~72wt%的高氯酸溶液，所述高氯酸溶液和所述样品的体积质量比为0.5~2mL/g；制得所述上清液后，采用全自动固相萃取仪对所述上清液进行净化，所述上清液的进样速率为1~3mL/min；
所述β-受体激动剂包括克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗、克伦普罗、妥布特罗、利托君、沙美特罗、喷布特罗、马喷特罗、福莫特罗、异克舒令、克伦赛罗和拉贝特罗。
2. 根据权利要求1所述的动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法，其特征在于，所述β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶和所述样品的单元质量比≥85000 units/g。
3. 根据权利要求2所述的动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法，其特征在于，所述β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶的浓度≥400 units/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法，其特征在于，所述第一混合液的pH值为5~6。
5.根据权利要求4所述的动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法，其特征在于，所述第一混合液的pH值为5.5。
6.根据权利要求1-3任一项所述的动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法，其特征在于，采用全自动固相萃取仪对所述上清液进行净化包括：先对管路进行冲洗，然后依次进行活化处理、上样、淋洗和洗脱；
所述活化处理包括先采用甲醇活化，再采用去离子水活化；
所述淋洗包括先采用去离子水淋洗，再采用甲醇淋洗；
所述洗脱包括采用氧化甲醇溶液洗脱并收集液体。
7.根据权利要求1~3任一项所述的动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法，其特征在于，所述内标物包括克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3、苯乙醇胺A-D3、氯丙那林-D7、西马特罗-D7、西布特罗-D9、马布特罗-D9、克伦普罗-D7和沙美特罗-D3中的任意一种或多种。
8.一种动物组织内的β-受体激动剂残留的检测方法，其特征在于，所述动物组织内的β-受体激动剂残留的检测方法包括：先采用权利要求1~7任一项所述的动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法对样品进行前处理，然后采用液相色谱-串联质谱联用法对经处理后的样品进行分析，内标法定量。
9. 根据权利要求8所述的β-受体激动剂残留的检测方法，其特征在于，液相色谱的色谱柱采用Waters Acquity BEH C18色谱柱，柱温为32~38℃。
10.一种权利要求8或9所述的动物组织内的β-受体激动剂残留的检测方法在检测β-受体激动剂的应用。
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