CN106706868B - 人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用 - Google Patents

人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106706868B
CN106706868B CN201611001769.0A CN201611001769A CN106706868B CN 106706868 B CN106706868 B CN 106706868B CN 201611001769 A CN201611001769 A CN 201611001769A CN 106706868 B CN106706868 B CN 106706868B
Authority
CN
China
Prior art keywords
albumen
hsp27
expression
beta
adrenoreceptor agonists
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611001769.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106706868A (zh
Inventor
王方雨
邓瑞广
张改平
胡骁飞
王晶
卢清侠
邢广旭
余秋颖
罗俊
郝俊芳
赵东
杨继飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Academy of Agricultural Sciences filed Critical Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201611001769.0A priority Critical patent/CN106706868B/zh
Priority to US16/349,846 priority patent/US10859587B2/en
Priority to PCT/CN2016/109503 priority patent/WO2018090413A1/zh
Publication of CN106706868A publication Critical patent/CN106706868A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106706868B publication Critical patent/CN106706868B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9406—Neurotransmitters
    • G01N33/9433—(Nor)adrenaline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Abstract

本发明属于药物残留检测领域，特别涉及人工表达HSP27蛋白在检测β2‑肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用。本发明借助分子对接技术，利用表达纯化的HSP27进行ELISA筛选，最终得到的蛋白可特异结合β2‑肾上腺素受体激动剂类药物。结果证明，人工合成的HSP27蛋白可与β2‑肾上腺素受体激动剂类药物有很好的结合。由于β2‑肾上腺素受体激动剂类药物种类较多，且难以得到相对于这一类药物的抗体，本发明适配得到的HSP27蛋白能够很好地规避了这一难题，并且蛋白可进行人工合成方法快速取得，检测成本也非常低廉。本发明的人工合成蛋白产量高，且纯化效果良好，与药物的特异性结合较高。

Description

人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残 留方面的应用
技术领域
本发明属于药物残留检测领域，特别涉及人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用。
背景技术
β2-肾上腺素受体激动剂，又称为β2-兴奋剂，是一类苯乙胺类化学合成衍生物，通常以盐酸盐等形式保存，常见的包括盐酸克仑特罗、溴布特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、盐酸马布特罗等。由于β2-肾上腺素受体激动剂能够促动物肌肉组织增长、减少脂肪沉积、改善肉质、提高饲料转化率等，因此上世纪80年代起，作为饲料添加剂广泛应用于畜禽生产中。其提高瘦肉产量的机理是通过肾上腺受体刺激腺苷酸环化酶的合成，从而升高环磷酸腺苷(c AMP)的浓度以增加激素敏感脂酶活性，加快脂肪分解；另外它还可降低血液中Mg2+浓度，间接促进肌肉兴奋，抑制蛋白质分解和脂肪合成，进而增加肌肉蛋白合成。人食用含有瘦肉精的猪肉、内脏及其加工产品后会导致中毒，典型症状为：肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、战栗等，严重者可致人死亡。目前β2-肾上腺素受体激动剂的快速检测方法，无论是ELISA法还是金标记试纸条法都是建立在免疫学的基础上，通过抗原与抗体的特异作用而建立。β2-AR(肾上腺素受体)是G蛋白偶联受体(GPCR)超级家族中的一员，作为GPCR的典型已经深入研究其结构功能，调节机制及信号传导等生理作用。G蛋白偶联受体在大肠杆菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物等所有的表达系统中都能够表达蛋白，且具有一定的功能活性，但因受体的种类不同和宿主细胞特点的不同而有所差异。
分子对接(Molecular Docking)是研究药物小分子与蛋白质受体大分子之间相互作用的方法，其本质是配体(Ligand)与受体(Receptor)的相互识别，并涉及到分子的空间变化与能量改变，是药物分子设计中的重要方法之一。
热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSP)，又称热应激蛋白(Heat StressProteins，HSP)或应激蛋白(Stress Proteins，SP)，是细胞或生物体在一些应激原，如高温、缺氧、氧化应激、感染、饥饿、创伤、代谢等条件诱导下，高效表达的一组高度保守的蛋白质，广泛分布于各种生物体内。HSP27是分子量在15～30ku之间s HSP亚家族(低分子量热休克蛋白)中的重要一员，主要参与微丝的稳定和细胞因子信号转导，保护细胞免受各种应激因素的损伤等。目前，还没有HSP27能够检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物的相关报道。
发明内容
本发明借助分子对接技术，利用人工表达的HSP27蛋白与β2-肾上腺素受体激动剂类药物特异性结合，最终得到一种新的β2-肾上腺素受体激动剂类药物检测方法。人工合成HSP27蛋白，纯化后进行ELISA结合实验，结果证明，人工合成的蛋白与β2-肾上腺素受体激动剂类药物有良好的结合能力，进一步验证了分子对接技术的可行性。借助本发明的蛋白，可应用于对β2-肾上腺素受体激动剂类药物定性和定量的检测。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用。
所述的人工表达HSP27蛋白可以与β2-肾上腺素受体激动剂类药物特异性结合。
所述的人工表达HSP27蛋白，包括以所述的人工表达HSP27蛋白为核心，任何对该蛋白的人工表达方式，包括但不局限于原核表达系统、真核表达系统、酵母表达系统对蛋白的表达。
将所述人工表达HSP27蛋白用于β2-肾上腺素受体激动剂类药物的检测，其中包括但不局限于酶联免疫检测方法。
将所述人工表达HSP27蛋白用于β2-肾上腺素受体激动剂类药物的定量和定性检测中。
利用所述的人工表达HSP27蛋白可以与β2-肾上腺素受体激动剂类药物特异性结合，制备β2-肾上腺素受体激动剂类药物的检测试剂盒、试纸条或试纸卡。
本发明的有益效果：
(1)本发明借助分子对接技术，利用表达纯化的HSP27进行ELISA筛选，最终得到的蛋白可特异结合β2-肾上腺素受体激动剂类药物。结果证明，人工合成的HSP27蛋白可与β2-肾上腺素受体激动剂类药物有很好的结合。
(2)由于β2-肾上腺素受体激动剂类药物种类较多，且难以得到相对于这一类药物的抗体，本发明适配得到的HSP27蛋白能够很好地规避了这一难题，并且蛋白可进行人工合成方法快速取得，检测成本也非常低廉。
(3)本发明的人工合成蛋白产量高，且纯化效果良好，与药物的特异性结合较高。
(4)本发明适配得到的HSP27蛋白，表达过程简便，更易操作；通过对药物进行标记，可快速地对药物残留进行定性和定量检测。
附图说明
图1为HSP27蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定结果。图中，M为广谱180KD的蛋白Marker，1为纯化后的HSP27蛋白。
图2为HSP27蛋白纯化后与小分子ELISA反应结果。图中横坐标为HSP蛋白不同包被浓度，纵坐标为OD值；每个HSP蛋白包被浓度对应的柱状从左到右依次为CL-BIO、RAC-BIO、FH-BIO(BIO代表生物素)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1 小分子对接技术
1、对接准备
对接所需的小分子β2-肾上腺素能受体激动剂分子结构均从ZINC上下载，并对其结构进行优化，以获得其能量最小化状态，以备后续对接。
蛋白为β2肾上腺素能受体蛋白2RH1和热休克蛋白27(HSP27)3ROR，均从PDB数据库中下载，去除相应的配体和非必要部分，加氢及能量最小化。
依据文献报道，2RH1对接口袋设定为包含Asp113、Asn312、Ser203、Phe193、Phe289、Phe290、Val114、Val117、Trp109、Tyr308、Tyr316、Tyr199、Trp286和Thr118残基的区域，Threshold定义为0.50，Bloat定义为10A。
依据3ROR的具体情况，对接口袋设定为包含Glu99、Asp65、Arg209、Phe100、Tyr50、Cys103、Asp203、Tyr202、Ser200、Asn199、Glu198、Trp62、Met66、Met67、Val98和Ser45等残基所在区域，Threshold定义为0.50，Bloat定义为10A。
2、分子对接
以上述蛋白对接区域作为受体，以小分子做为配体，采用FlexX方法进行对接工作，对接条件设置以SYBYL中的默认条件为准。以对接结果的Total_Score值为最终判断依据。相同小分子对两种蛋白的对接结果见表1。
表1 β2-肾上腺素受体激动剂类药物与蛋白对接结果
3、对接结果分析
对接结果分析表明，β2-肾上腺素受体激动剂类药物与HSP27的对接结果大多数高于与β2-肾上腺素受体的对接结果，可以说明β2-肾上腺素受体激动剂类药物与HSP27的结合能力要更好。
实施例2 HSP27蛋白表达实验
根据GenBank中公布的HSP27基因序列设计相应引物扩增其CDS区序列，序列酶切后连接至pLSLa载体，经PCR鉴定、测序后，转化至BL21(DE3)宿主菌加IPTG进行诱导表达，利用琼脂糖树脂柱进行目的蛋白纯化，利用SDS-PAGE鉴定表达纯化蛋白的特性(结果见图1)。图1结果表明，本发明人工合成蛋白产量高，且纯化效果良好。
实施例3 HSP27蛋白鉴定
选择人工表达HSP27蛋白最适浓度作为包被抗原，50μL/孔包被在酶标板上，将板放置于37℃的恒温培养箱中反应2h，PBST洗涤4遍，室温晾干。加入质量分数1％BSA作为封闭液，200μL/孔，37℃恒温反应1h，PBST洗涤4遍，室温晾干。然后加入梯度浓度的HSP27多抗血清，50μL/孔，设置阴性对照(NC)，37℃恒温30min，洗板4遍。再每孔加入50μL羊抗鼠二抗(1:1000)，37℃恒温30min，洗板4遍。用TMB显色液100μL/孔进行显色反应，10min后用50μL2mol/L H2SO4终止反应。用酶标仪在OD450nm处对每孔进行读数。
表2人工表达HSP27蛋白ELISA鉴定结果
实施例4 HSP27蛋白与小分子结合实验
1、将人工表达的HSP27的BL21(DE3)宿主菌菌液(实施例2)进行超声破碎，然后以100μg/mL(蛋白量计)进行梯度ELISA板包被，50μL/孔；
2、将100ng/mL的小分子偶联生物素，以50μL/孔的量加入到上述ELISA板中，震荡器上混匀，37℃条件下避光孵育30min；用酶标板洗板机洗4次，或手工甩掉酶标板孔中的液体，用稀释后的缓冲液加满各孔，再甩干，如此重复洗涤4次；
3、在酶标板中加入HRP-标记链霉亲和素偶联物，37℃条件下进行反应30min；同上步骤洗涤4次。
4、根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中，每孔加100μl，在酶标板震荡器上震荡30s，室温显色10min；
5、每孔加入50μl 2mol/L的硫酸终止反应，在酶标板震荡器上震荡30s，然后用酶标仪读取各孔在450nm处的吸光值，判定结果(结果见图2)。
图2结果表明，小分子FH(非诺特罗)、CL(克伦特罗)和RAC(莱克多巴胺)等肾上腺素受体激动剂可与HSP27相结合；HSP27可起到体外与肾上腺素受体激动剂相结合的作用，这为借助HSP检测肾上腺素受体激动剂奠定了基础。

Claims (6)

1.人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的人工表达HSP27蛋白可以与β2-肾上腺素受体激动剂类药物特异性结合。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以所述的人工表达HSP27蛋白为核心，任何对该蛋白的人工表达方式，包括原核表达系统、真核表达系统、酵母表达系统对蛋白的表达。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述人工表达HSP27蛋白用于β2-肾上腺素受体激动剂类药物的检测，其中包括酶联免疫检测方法。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，将所述人工表达HSP27蛋白用于β2-肾上腺素受体激动剂类药物的定量和定性检测中。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述的人工表达HSP27蛋白可以与β2-肾上腺素受体激动剂类药物特异性结合，制备β2-肾上腺素受体激动剂类药物的检测试剂盒、试纸条或试纸卡。
CN201611001769.0A 2016-11-15 2016-11-15 人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用 Active CN106706868B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611001769.0A CN106706868B (zh) 2016-11-15 2016-11-15 人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用
US16/349,846 US10859587B2 (en) 2016-11-15 2016-12-12 Application of artificially expressed HSP27 protein in detecting a residue of a β2-adrenergic receptor agonist-based drug
PCT/CN2016/109503 WO2018090413A1 (zh) 2016-11-15 2016-12-12 人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611001769.0A CN106706868B (zh) 2016-11-15 2016-11-15 人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106706868A CN106706868A (zh) 2017-05-24
CN106706868B true CN106706868B (zh) 2018-12-04

Family

ID=58940935

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611001769.0A Active CN106706868B (zh) 2016-11-15 2016-11-15 人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US10859587B2 (zh)
CN (1) CN106706868B (zh)
WO (1) WO2018090413A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114563507B (zh) * 2021-10-13 2023-11-10 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种动物组织内的β-受体激动剂残留的处理方法、检测方法及应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20040950A1 (es) * 2003-02-14 2005-01-01 Theravance Inc DERIVADOS DE BIFENILO COMO AGONISTAS DE LOS RECEPTORES ADRENERGICOS ß2 Y COMO ANTAGONISTAS DE LOS RECEPTORES MUSCARINICOS
CN1847851A (zh) * 2006-04-03 2006-10-18 河南省农业科学院生物技术研究所 莱克多巴胺残留快速检测试纸条
CN102653561B (zh) * 2012-05-22 2013-11-06 中国农业大学 一种单链抗体及其在检测β-兴奋剂中的应用
CN104280437B (zh) * 2013-12-17 2017-01-11 南京师范大学 一种β-肾上腺素受体激动剂多残留检测免疫传感器及其检测方法
CN104280541A (zh) * 2014-10-21 2015-01-14 南京师范大学 β-肾上腺素受体激动剂多簇抗原及宽谱特异性抗体及其制备
CN104387467A (zh) * 2014-10-22 2015-03-04 南京师范大学 一种β-肾上腺素受体激动剂多残留检测试剂盒及试纸
CN104311659A (zh) * 2014-10-22 2015-01-28 南京师范大学 β-肾上腺素受体激动剂多簇抗原、宽谱特异性抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106706868A (zh) 2017-05-24
WO2018090413A1 (zh) 2018-05-24
US10859587B2 (en) 2020-12-08
US20190277867A1 (en) 2019-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sadoul et al. Measuring cortisol, the major stress hormone in fishes
Hurley et al. The Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinases are AMP-activated protein kinase kinases
Mishra et al. Influence of induced heat stress on HSP70 in buffalo lymphocytes
Hu et al. Characterization of C1q in teleosts: insight into the molecular and functional evolution of C1q family and classical pathway
Long et al. Ablation of PM20D1 reveals N-acyl amino acid control of metabolism and nociception
Reddy et al. Interaction of a kinesin-like protein with calmodulin isoforms from Arabidopsis
Joseph et al. Molecular Docking of Phytoligands to the viral protein receptor P. monodon Rab7
CN106706868B (zh) 人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用
Laurchan et al. Molecular characterization and cross-allergenicity of tropomyosin from freshwater crustaceans
Qiu et al. Temporal transcriptome reveals that circadian clock is involved in the dynamic regulation of immune response to bacterial infection in Bombyx mori
Eniafe et al. Agemone mexicana flavanones; apposite inverse agonists of the β2-adrenergic receptor in asthma treatment
Asturiano et al. Sandwich immunoassay for determination of vitellogenin in golden grey mullet (Liza aurata) serum as a field exposure biomarker
Sempere et al. 8-[3H]-hydroxy-2-(di-n-propylamino) tetralin binding sites in blood lymphocytes of rats and the modulation by mitogens and immobilization
Gobl et al. Histone methyltransferase DOT1L is involved in larval molting and second stage nymphal feeding in Ornithodoros Moubata
Wang et al. Establishment and evaluation of Erns/E2 fusion protein-based indirect ELISA for detection of Classical swine fever virus antibody.
Jiao et al. Effects of honokiol on insulin resistance in diabetic rats and its mechanism.
CN101580881A (zh) 评价暑热证及中药药效的基因芯片
Wu YuYuan et al. Clone and tissue expression analysis of PmTLR13 gene in Pinctada fucata martensii.
Sarapultsev et al. Combined in silico, ex vivo, and in vivo assessment of L-17, a thiadiazine derivative with putative neuroprotective and antidepressant-like effects
Xia et al. Analysis of nutritional component contents in egg, eggshell and feather of Chinese monal (Lophophorus lhuysii).
Shao et al. A novel peptide-based ELISA for efficient detection of antibody against chicken infectious anemia virus.
Zhu JunJie et al. Molecular identification and expression analysis of a novel cyclophilin a gene in the red swamp crayfish, Procambarus clarkii.
Liu XiaoQiang et al. The cDNA cloning, expression profiling and functional characterization of octopamine receptor 3 (TcOctβR3) in Tribolium castaneum.
Gong HuiQiong et al. Progress in research on insect bursicon and its receptor.
Gao Hong et al. Characterization of the antibody response to heat shock protein 70 (Sj HSP70) of Schistosoma japonicum and the immunological diagnostic value of that protein.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant