CN106896172A - 一种动物源性食品中兽药多残留快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动物源性食品中兽药多残留快速检测方法。所述检测方法包括如下步骤：(1)采用乙腈水溶液提取待检测的动物源性食品，得提取液；(2)采用十八烷基硅烷键合硅胶和乙腈饱和正己烷净化提取液，离心后取上清液；上清液依次经浓缩、定容和乙腈饱和正己烷净化处理；(3)采用超高液相色谱‑串联质谱法检测经步骤(2)处理后的处理液，即实现对动物源食品中兽药残留的检测。本发明检测方法操作简便、快捷、溶剂用量少，本发明首次将此方法应用到动物源性食品检测中，能同时对动物产品中四环素类、青霉素类和磺胺类、喹诺酮类、β激动剂类等133种兽药一起进行快速的定性、定量，检出限完全能够满足检测需求，检测效率大大提升。

Description

一种动物源性食品中兽药多残留快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种动物源性食品中兽药多残留快速检测方法，属于食品检测方法技术领域。

背景技术

兽药残留是当前食品安全的重要问题，目前有100多种兽药在使用，大量的动物源性食品需要做兽药残留分析，检验任务既繁重又时间紧迫。我们国家的标准相对比较全面，但每个标准针对的检测项目比较单一，例如GB/T 20759-2006《畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定—液相色谱-串联质谱法》、GB/T 20366-2006《动物源产品中喹诺酮类残留量的测定—液相色谱-串联质谱法》、GB/T 20756-2006《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定—液相色谱-串联质谱法》等，因此建立快速、高效、灵敏、可靠且实用的兽药残留分析方法对于食品安全具有重要的现实意义。

2003年，Anastassiades和Lehotay开发了一种快速(quick)、简单(easy)、便宜(cheap)、高效(effective)、耐用(rugged)和安全(safe)的农产品中农药多残留样品前处理方法，并用首字母缩写将此种方法命名为QuEChERS。QuEChERS自发布以来，因其简化了以前繁杂的萃取步骤并扩大了所萃取农残的范围，被包括美国官定分析化学家协会AOAC在内的多个国际农药残留分析机构广泛采纳，并在农药残留领域获得了大量的应用。近年来已有不少研究把QuEChERS用在兽药残留领域，由于样品基质的不同、兽药和农药的化学性质不同等因素，相关研究取得了一定成果但也存在一些问题，比如检测项目仍然较少、四环素等与其他类难以同时检测、净化过程复杂等。因此需要提供一种高效快速、操作简单同时又能满足国内外限量及法规要求的多兽药残留检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种动物源性食品中兽药多残留快速检测方法，本发明检测方法具有检测高效且结果准确的特点。

本发明所提供的动物源性食品中兽药多残留的快速检测方法，包括如下步骤：

(1)采用乙腈水溶液提取待检测的动物源性食品，得提取液；

(2)采用十八烷基硅烷键合硅胶和乙腈饱和正己烷净化所述提取液，离心后取上清液；所述上清液依次经浓缩、定容和所述乙腈饱和正己烷净化处理；

(3)采用超高液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法检测经步骤(2)处理后的处理液，即实现对所述动物源食品中兽药残留的检测。

上述的快速检测方法中，所述动物源性食品指的是全部可食用的动物组织以及蛋和奶，包括肉类及其制品(含动物脏器)、水生动物产品等。

上述的快速检测方法中，步骤(1)中，所述乙腈水溶液的用量为：1g所述动物源性食品：1～10ml所述乙腈水溶液或1g所述动物源性食品：5ml所述乙腈水溶液；

所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比可为2～19：1，具体可为4：1；

进行涡旋振荡以进行充分的提取。

上述的快速检测方法中，步骤(2)中，采用所述十八烷基硅烷键合硅胶和所述乙腈饱和正己烷净化所述提取液的步骤为：将所述提取液与所述十八烷基硅烷键合硅胶混合，然后利用所述乙腈饱和正己烷进行涡旋提取，弃去正己烷层，移取所述上清液。

步骤(2)中，采用乙腈饱和正己烷净化处理所述上清液的步骤为：采用所述乙腈饱和正己烷涡旋提取依次经经浓缩和定容的所述上清液，离心后过0.22μm PTFE滤膜。

上述的快速检测方法中，步骤(2)中，所述动物源性食品与所述十八烷基硅烷键合硅胶(C18)的质量比可为2～10：1，具体可为4：1；

所述乙腈饱和正己烷的用量为：1g所述动物源性食品：1～5ml所述乙腈饱和正己烷或1g所述动物源性食品：2.5ml所述乙腈饱和正己烷；

所述乙腈饱和正己烷可按照下述方法制备：乙腈与正己烷以体积比1：1振荡混合，静置分层后取上层即为所述乙腈饱和正己烷；

本发明中，固相萃取填料采用C18填料，结合所述乙腈饱和正己烷实现对样品的净化，能够有效去除动物源性食品中的脂肪、磷脂等干扰杂质。

上述的快速检测方法中，步骤(2)中，所述浓缩采用氮吹浓缩的方式，氮吹时控制浓缩程度不使样品完全吹干，有效降低回收率损失，得到的定容液用高灵敏度UPLC-MS/MS进行兽药多残留分析；

采用甲酸乙腈溶液和水进行所述定容；

进行所述检测之前，还包括将步骤(2)处理后的处理液过滤的步骤，如过0.22μmPTFE滤膜。

上述的快速检测方法中，步骤(3)中，所述超高液相色谱-串联质谱法采用下述检测条件：

色谱条件如下：

流动相：A相为摩尔浓度为2～10mM的乙酸铵水溶液(具体可为5mM)，B相为甲醇；

洗脱梯度：0～1.0min，0～90％A相；1.0～2.5min，90％～60％A相；2.5～3.5min，60％～30％A相；3.5～4.0min，30％～20％A相；4.0～5.5min，20％～10％A相；5.5～6.5min，10％A相；6.5～6.51min，10％～90％A相，均指的是体积百分含量；

质谱条件如下：

电喷雾电离负离子模式，多反应监测扫描模式；

上述检测条件下能够检测氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、琥珀氯霉素、地克珠利、尼卡巴嗪和玉米赤霉醇8种兽药。

上述的快速检测方法中，步骤(3)中，所述超高液相色谱-串联质谱法采用下述检测条件：

色谱条件如下：

流动相：A相为甲酸铵-甲酸溶液，其中，甲酸铵的摩尔浓度为2～10mM(具体可为5mM)，甲酸的体积浓度为0.05～0.2％(具体可为0.1％)，B相为甲醇；

洗脱梯度：0～1.0min，0～90％A相；1.0～3.5min，90％～65％A相；3.5～5.5min，65％～55％A相；5.5～6.0min，55％～20％A相；6.0～7.5min，20％～5％A相；7.5～9.5min，5％A相；9.5～9.51min，10％～5％～90％A相，均指的是体积百分含量；

质谱条件如下：

电喷雾电离正离子模式，多反应监测扫描模式；

上述检测条件下能够检测剩余的125种兽药：阿苯哒唑、阿维菌素、α、β-群勃龙、金刚烷胺、氨基比林、阿莫西林、氨苄青霉素、阿奇霉素、杆菌肽A、班布特罗盐酸盐、溴布特罗、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢呋辛、头孢噻呋、氯丙嗪、金霉素、西马特罗、塞布特罗、西诺沙星、环丙沙星、盐酸克伦特罗、盐酸克伦潘特、克伦丙罗、克林霉素、氯羟吡啶、氯丙那林、氯舒隆、邻氯青霉素、达氟沙星、地塞米松/倍他米松、敌菌净、双氯青霉素、地昔尼尔、二氟沙星、地美硝唑、多巴胺、强力霉素、依诺沙星、恩诺沙星、依普菌素、红霉素、乙氧酰胺苯甲酯、芬苯哒唑、仲丁威、非诺特罗、氟苯哒唑、氟甲喹、氟尼辛、羟基地美硝唑、氢化可的松、交沙霉素、吉他霉素、左旋咪唑、林可霉素、洛美沙星、马布特罗、马喷特罗、马波沙星、甲苯哒唑、甲硝哒唑、羟基甲硝哒唑、萘夫西林、萘啶酸、甲苄喹啉、诺氟沙星、氧氟沙星、竹桃霉素、奥比沙星、奥美普林、邻氯青霉素、奥芬哒唑、恶喹酸、土霉素、培氟沙星、喷布洛尔、青霉素G、青霉素V、安替比林、苯乙醇胺A、吡喹酮、泼尼松龙、醋酸泼尼松、普萘洛尔、乙胺嘧啶、莱克多巴胺、利福昔明、洛硝哒唑、罗红霉素、沙丁胺醇、沙拉沙星、螺旋霉素、苯甲酰磺胺、磺胺醋酰、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺多辛、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、新诺明、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺喹垩啉、磺胺噻唑、磺胺二甲异噁唑、特布他林、四环素、泰妙菌素、泰地罗新、替米考星、替硝唑、群勃龙醋酸酯、三氯苯哒唑、甲氧苄氨嘧啶、曲吡那敏、托拉菌素A、妥布特罗、泰乐菌素、维吉尼霉素M1和齐帕特罗。

本发明检测方法采用乙腈水体系进行提取，采用QuEChERS技术结合液液萃取技术对样品进行净化。乙腈水体系相较传统乙腈或醋酸乙腈体系能够提高四环素类、青霉素类的提取效率，使得四环素类、青霉素类药物与其他药物可以同时获得较好的提取效果；QuEChERS技术是用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的；液液萃取技术是利用化合物在两种互不相溶(或微溶)的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。

本发明检测方法操作简便、快捷、溶剂用量少，本发明首次将此方法应用到动物源性食品检测中，能同时对动物产品中四环素类、青霉素类和磺胺类、喹诺酮类、β激动剂类等133种兽药一起进行快速的定性、定量，检出限完全能够满足检测需求，检测效率大大提升。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

配制133种兽药混合标准品溶液，向阴性猪精瘦肉、鸡肉和猪五花肉中分别添加检出限水平的标准品，添加水平均等于或小于我国的限量标准，每个含量水平重复6次。

实施例1、检测猪精瘦肉中的兽药残留

取上述猪精瘦肉，检测其兽药残留含量，步骤如下：

(1)提取：称取均匀制样的样品2.0g于50mL离心管中，加入10mL乙腈+水(4+1)溶液，涡旋振荡5min提取后，4000r/min离心5min。

(2)净化：转移步骤(1)离心后得到的全部提取液到装有0.5g C18填料的离心管中，再加入5mL乙腈饱和正己烷(乙腈与正己烷以体积比1：1振荡混合，静置分层后取上层即为乙腈饱和正己烷)，涡旋混匀1min，4000r/min离心5min后，弃去正己烷层，准确移取5.0mL上清液至10mL具塞刻度管中，于40℃水浴下氮吹浓缩至0.5mL以下，加入400μL 0.25％甲酸乙腈，超纯水定容至1.0mL，涡旋混合1min，转移定溶液至2mL聚丙烯离心管中，加入800μL乙腈饱和正己烷涡旋混合，14000rpm离心5min，过0.22μm PTFE滤膜，按步骤(3)中所述仪器条件，上机检测。

(3)UPLC/MS/MS检测：

a、在该色谱条件下，用于检测氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、琥珀氯霉素、地克珠利、尼卡巴嗪、玉米赤霉醇共8种兽药。

仪器条件：液相条件：A：5mM的乙酸铵水溶液，B：甲醇。

离子源：ESI^-。

色谱柱：ACQUITY UPLC^TM HSS T3 2.1×100mm×1.8μm Column。

洗脱梯度和洗脱液流速如表1中所示。

表1洗脱梯度和洗脱液流速

时间(min)	流速(ml/min)	％A(V)	％B(V)
				0	0.4	90	10
1.0	0.4	90	10
				2.5	0.4	60	40
3.5	0.4	30	70
				4.0	0.4	20	80
5.5	0.4	10	90
				6.5	0.4	10	90
6.51	0.4	90	10

b、在该色谱条件下用于检测剩余的125种兽药。

仪器条件：液相条件：A相：甲酸铵-甲酸溶液，其中甲酸的体积浓度为0.1％，甲酸铵的摩尔浓度为5mM，B相：甲醇。

离子源：ESI⁺。

色谱柱：ACQUITY UPLC^TM HSS T3 2.1×100mm×1.8μm Column。

洗脱梯度和洗脱液流速如表2中所示。

表2洗脱梯度和洗脱液流速

质谱条件：动态多反应监测(Dynamic MRM)扫描模式。

所得到的猪精瘦肉中的兽药残留含量的平均回收率和相对标准偏差RSD见表3。

实施例2、检测鸡肉中的兽药残留

取上述鸡肉，检测其兽药残留含量，步骤如下：

(1)提取：称取均匀制样的样品2.0g于50mL离心管中，加入10mL乙腈+水(4+1)溶液，涡旋振荡5min提取后，4000r/min离心5min；

(2)净化：转移步骤(1)离心后得到的全部提取液到装有0.5g C18填料的离心管中，再加入5mL乙腈饱和正己烷，涡旋混匀1min，4000r/min离心5min后，弃去正己烷层，准确移取5.0mL上清液至10mL具塞刻度，于40℃水浴下氮吹浓缩至0.5mL以下，加入400μL0.25％甲酸乙腈，超纯水定容至1.0mL，涡旋混合1min，转移定溶液至2mL聚丙烯离心管中，加入800μL乙腈饱和正己烷涡旋混合，14000rpm离心5min，过0.22μm PTFE滤膜，按步骤(3)中所述仪器条件，上机检测。

(3)UPLC/MS/MS检测：

a、在该色谱条件下，用于检测氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、琥珀氯霉素、地克珠利、尼卡巴嗪、玉米赤霉醇共8种兽药。

仪器条件：液相条件：A：5mM的乙酸铵水溶液，B：甲醇。

离子源：ESI^-。

色谱柱：ACQUITY UPLC^TM HSS T3 2.1×100mm×1.8μm Column。

洗脱梯度和洗脱液流速如表1中所示。

b、在该色谱条件下用于检测剩余的125种兽药。

仪器条件：液相条件：A：甲酸铵-甲酸溶液，其中甲酸的体积浓度为0.1％，甲酸铵的摩尔浓度为5mM，B：甲醇。

离子源：ESI⁺。

色谱柱：ACQUITY UPLC^TM HSS T3 2.1×100mm×1.8μm Column。

洗脱梯度和洗脱液流速如表2中所示。

质谱条件：动态多反应监测(Dynamic MRM)扫描模式。

所得到的鸡肉中的兽药残留含量的平均回收率和相对标准偏差RSD见表3。

实施例3、检测猪五花肉中的兽药残留

取上述猪五花肉，检测其兽药残留含量，步骤如下：

(1)提取：称取均匀制样的样品2.0g于50mL离心管中，加入10mL乙腈+水(4+1)溶液，涡旋振荡5min提取后，4000r/min离心5min；

(2)净化：转移步骤(1)离心后得到的全部提取液到装有0.5g C18填料的离心管中，再加入5mL乙腈饱和正己烷，涡旋混匀1min，4000r/min离心5min后，弃去正己烷层，准确移取5.0mL上清液至10mL具塞刻度，于40℃水浴下氮吹浓缩至0.5mL以下，加入400μL0.25％甲酸乙腈，超纯水定容至1.0mL，涡旋混合1min，转移定溶液至2mL聚丙烯离心管中，加入800μL乙腈饱和正己烷涡旋混合，14000rpm离心5min，过0.22μm PTFE滤膜，按步骤(3)中所述仪器条件，上机检测。

(3)UPLC/MS/MS检测：

a、在改色谱条件下，用于检测氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、琥珀氯霉素、地克珠利、尼卡巴嗪、玉米赤霉醇共8种兽药。

仪器条件：液相条件：A：5mM的乙酸铵水溶液，B：甲醇。

离子源：ESI^-。

色谱柱：ACQUITY UPLC^TM HSS T3 2.1×100mm×1.8μm Column。

洗脱梯度和洗脱液流速如表1中所示。

b、在该色谱条件下用于检测剩余的125种兽药。

仪器条件：液相条件：A：甲酸铵-甲酸溶液，其中甲酸的体积浓度为0.1％，甲酸铵的摩尔浓度为5mM，B：甲醇。

离子源：ESI⁺。

色谱柱：ACQUITY UPLC^TM HSS T3 2.1×100mm×1.8μm Column。

洗脱梯度和洗脱液流速如表2中所示。

质谱条件：动态多反应监测(Dynamic MRM)扫描模式。

所得到的猪五花肉中的兽药残留含量的平均回收率和相对标准偏差RSD见表3。

表3实施例1-3中检测各样品中兽药残留含量的平均回收率和相对标准偏差RSD

由表3中数据可以看出，兽药残留在各动物源性食品中的平均回收率均为44～130％，相对标准偏差RSD为1～28％，回收率及相对标准偏差均符合兽药残留检测标准。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种动物源性食品中兽药多残留的快速检测方法，包括如下步骤：

(1)采用乙腈水溶液提取待检测的动物源性食品，得提取液；

(2)采用十八烷基硅烷键合硅胶和乙腈饱和正己烷净化所述提取液，离心后取上清液；所述上清液依次经浓缩、定容和所述乙腈饱和正己烷净化处理；

(3)采用超高液相色谱-串联质谱法检测经步骤(2)处理后的处理液，即实现对所述动物源食品中兽药残留的检测。

2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述乙腈水溶液的用量为：1g所述动物源性食品：1～10ml所述乙腈水溶液；

所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为2～19：1。

3.根据权利要求1或2所述的快速检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述动物源性食品与所述十八烷基硅烷键合硅胶的质量比为2～10：1；

所述乙腈饱和正己烷的用量为：1g所述动物源性食品：1～5ml所述乙腈饱和正己烷。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的快速检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述浓缩采用氮吹浓缩的方式；

采用甲酸乙腈溶液和水进行所述定容。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的快速检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述超高液相色谱-串联质谱法采用下述检测条件：

色谱条件如下：

流动相：A相为摩尔浓度为2～10mM的乙酸铵水溶液，B相为甲醇；

洗脱梯度：0～1.0min，0～90％A相；1.0～2.5min，90％～60％A相；2.5～3.5min，60％～30％A相；3.5～4.0min，30％～20％A相；4.0～5.5min，20％～10％A相；5.5～6.5min，10％A相；6.5～6.51min，10％～90％A相，均指的是体积百分含量；

质谱条件如下：

电喷雾电离负离子模式，多反应监测扫描模式。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的快速检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述超高液相色谱-串联质谱法采用下述检测条件：

色谱条件如下：

流动相：A相为甲酸铵-甲酸溶液，其中，甲酸铵的摩尔浓度为2～10mM，甲酸的体积浓度为0.05～0.2％，B相为甲醇；

洗脱梯度：0～1.0min，0～90％A相；1.0～3.5min，90％～65％A相；3.5～5.5min，65％～55％A相；5.5～6.0min，55％～20％A相；6.0～7.5min，20％～5％A相；7.5～9.5min，5％A相；9.5～9.51min，10％～5％～90％A相，均指的是体积百分含量；

质谱条件如下：

电喷雾电离正离子模式，多反应监测扫描模式。