CN107490649A - 一种畜禽排泄物中62种抗菌药物的筛查方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种畜禽排泄物中62种抗菌药物的筛查方法，具体包括以下步骤：（1）标准工作溶液的配制；（2）待测样品的分析前处理；（3）基质匹配标准曲线的绘制；（4）对步骤（3）所述的含有一定量的各个药物的试样进行质谱分析，获得各个药物的准分子离子，以及两个特征离子：定性离子和定量离子；（5）定性分析；（6）定量分析。本发明提供的筛查方法精密、准确、灵敏度高，为探明养殖场及其周边环境中抗生素的残留状况，评估排泄物中残留的抗生素的潜在危害和对环境的影响提供了技术支撑，产生巨大社会效益。

Description

一种畜禽排泄物中62种抗菌药物的筛查方法
技术领域
本发明属于生物技术检测技术领域，具体涉及一种畜禽排泄物中62种抗菌药物的筛查方法。
背景技术
随着畜牧业的集约化的发展，在防治动物疫病方面，抗生素的使用越来越广泛，但抗生素进入动物体内后，除一部分被吸收、转化和代谢，残留于动物组织中，大部分以原型或者代谢产物的形式随粪便排出体外，含有抗生素的粪便或者作为有机肥料用于种植业，或者直接排入环境中，从而导致粪便中残留的抗生素进入土壤和水体中，这将对环境的生态系统产生重要影响，并将可能通过食物链对动、植物以及微生物的生命活动产生影响，尤其是可能诱导细菌耐药性的产生，最终对人类的的身体健康产生威胁。而粪便中抗生素的残留的危害以蓄积性和慢性毒性为主，容易被忽视。近几年随着人民对食品安全和环保意识的增强，粪便中抗生素的残留被越来越重视，其残留的检测方法报道也日见增多。
兽药或兽药添加剂经动物代谢后，一些性质稳定的药物随粪便、尿被排泄到环境中后仍能稳定存在，对土壤、水体等生态环境产生直接影响，并通过食物链对生态环境产生毒害作用，最终危害人类的健康。仅对环境而言，残留兽药在排泄到外界环境后，不但通过植物富集作用影响土壤中菌群而影响生态平衡，还对土壤生物的活动，群结构代谢功能，种族元素数量等都产生影响，使土壤生物区系发生改变，微生物的分解作用降低，土壤结构改变，肥力下降，而且细菌收到抗生素抑制后，土壤中真菌取代了细菌，使得土壤微生物群体发生了根本性的改变，造成难以遏制的生物“荒漠”。
环境中存在过量的兽药，加快了环境中病原微生物的变异速度，使得大量的耐药菌群产生与传播对畜牧业自身的疫病防控造成严重障碍，同时对人类健康也形成潜在威胁，对土壤和地表谁及地下水抗生素检测表明，环境中抗生素检测率和检出抗生素危害已接近于农药。某些抗生素在环境中降解缓慢，残留时间达一年以上，甚至二十年以上，即使植物数代的转运、富集、药效依旧。本法利用多种类多药物高通量的检测方法，对畜禽养殖废弃物中抗生素残留提供一种高效精准的检测手段，为生态环境及人类健康提供了安全保障。
发明内容
本发明的目的在于：提供了一种畜禽排泄物中62种抗菌药物的筛查方法，为畜产品安全及生态环境中药物残留提供了一种完整的检测方法，填充了国家行业残留检测标准，增添了抗菌药物筛查技术手段，为国家食品安全及生态平衡提供了安全保障。
本发明的目的是以下述技术方案实现的：
一种畜禽排泄物中62种抗菌药物的筛查方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
所述62种抗菌药物分别为：
(a)磺胺类：磺胺吡啶、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺异恶唑、磺胺甲噻二唑、苯酰磺胺、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺喹噁啉、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、二甲氧苄啶；
(b)喹诺酮类：恶喹酸、氟甲喹、西诺沙星、二氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、那氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、培氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、萘啶酸、依诺沙星、加替沙星；
(c)大环内酯类：泰乐菌素、替米考星、罗红霉素、吉他霉素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素；
(d)喹噁啉类：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹；
(e)呋喃类：呋喃它酮、呋喃唑酮；
(f)四环素类：四环素、金霉素、土霉素、多西环素；
(g)林可胺类：克林霉素、林可霉素；
(h)β-内酰胺类：头孢噻呋、青霉素G、头孢喹肟；
(i)酰胺醇类：氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素；
(j)截短侧耳素类：泰妙菌素；
(k)多肽类：万古霉素；
(1)标准工作溶液的配制：
标准储备液：分别称取62种抗菌药物对照品10mg，置容量瓶中，用二甲基亚砜溶解后用甲醇稀释至刻度，分别配制成1mg/mL的标准储备液；
混合标准中间工作液：分别吸取标准储备液各100μL，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成10μg/mL的混合标准中间工作液；
混合标准工作液：取混合标准中间工作液，用10％乙腈水溶液稀释，制得浓度为5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的系列标准工作液；
(2)待测样品的分析前处理：
1)样品准备：
粪便样品：取空白或供试粪便样品，冷冻干燥后研磨，过0.45mm孔径的分析筛；取研磨的供试样品，作为供试试料；取研磨的空白样品，作为空白试料；取研磨的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料；
水体样品：取空白或供试水体样品，混合均匀；取均质的供试样品，作为供试试料；取均质的空白样品，作为空白试料；取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料；
2)提取：
粪便：称取试样2.00±0.02g于50mL离心管中，加入乙腈10.0mL和Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液10.0mL，涡旋30s，振荡20min，以8000r/min转速离心5min，移取上清液至另一离心管中，加入10mL正己烷，振荡5min，8000r/min离心5min，移取下层溶液至250mL烧杯中，加水稀释至200mL，玻璃纤维滤纸过滤后，备用；
水体样品：称取试样1mL，玻璃纤维滤纸过滤，加入Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液20.0mL，采用氢氧化钠溶液调节调pH至6.0±0.05，备用；
3)净化：Strata-X固相萃取柱依次用甲醇5mL、水5mL活化，移取全部备用液过柱，水10mL淋洗，抽干，甲醇8mL洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮气吹干，加入10％乙腈1.00mL溶解残余物，超声2min，混匀后20000r/min离心5min，上清液供液相色谱-串联质谱仪测定；
(3)基质匹配标准曲线的绘制：取6份空白样品，按步骤(2)操作，洗脱液氮气吹干后，分别移取5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的混合标准工作液各1.00mL溶解残余物，20000r/min离心5min，得上清液为基质匹配标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定，以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线；
(4)对步骤(3)所述的含有一定量的各个药物的试样进行质谱分析，获得各个药物的准分子离子，以及两个特征离子：定性离子和定量离子，如下表1所示：
表1药物的保留时间和质谱信息
(5)定性分析：对经过步骤2)所述方法处理的待测样品选择1个母离子和2个子离子，进行一次性液相色谱分析，在相同试验条件下，待测样品中待测物质的保留时间与基质匹配标准溶液中对应的保留时间偏差在±2.5％之内，且样品中目标化合物两个子离子的相对丰度与浓度接近的基质匹配标准溶液相对丰度进行比较，偏差不超过下表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物；
表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度(％) >50 >20～50 >10～20 ≤10
允许的最大偏差(％) ±20 ±25 ±30 ±50
(6)定量分析：取经过步骤(2)所述方法处理的待测样品和基质匹配标准溶液进行质谱分析，得到色谱峰面积响应值，作单点或多点校准，用外标法定量，待测样品溶液中待测物的响应值和基质匹配标准溶液中各待测物的特征离子的响应值均应在仪器测定的线性范围内；若试样溶液浓度超过线性范围时，稀释后重新测定；
试样中待测物的含量以质量分数X表示，单位为微克每千克(μg/kg)，按下列公式进行计算：
公式中：
X—试样中待测物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
A—试样溶液中待测物的峰面积；
As—标准溶液中待测物峰面积；
Cs—标准溶液中待测物浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
m—样品的质量，单位为克(g)；
V—溶解残余物的体积，单位为毫升(mL)；
V1—过固相萃取柱的提取液体积，单位为毫升(mL)；
V2—总提取液体积，单位为毫升(mL)；
n—稀释倍数；
试样中待测物的含量以浓度C表示，单位为纳克每升(ng/L)，按下列公式进行计算：
公式中：
C—试样中待测物的浓度，纳克每升(ng/L)；
A—试样溶液中待测物的峰面积；
As—标准溶液中待测物峰面积；
Cs—标准溶液中待测物浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
m—样品的质量，单位为克(g)；
V—样品的体积，单位为毫升(mL)；
V1—溶解残余物的体积，单位为毫升(mL)；
测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
所述动畜禽排泄物为畜禽排泄粪便、养殖环节畜禽饮用水或畜禽养殖污水。
所述步骤(3)和步骤(5)中的液相色谱分析条件为：色谱柱：C18柱，柱长100mm，柱内径2.1mm，粒度1.7μm；流动相系统1：A相：甲醇，B相：0.1％甲酸溶液，梯度洗脱，梯度见表3；流动相系统2：A相：甲醇，B相：水，梯度洗脱，梯度见表4；流速：0.30mL/min；进样量：5μL；柱温：35-40℃；
所述步骤(4)和步骤(6)中的质谱分析条件为：
表5质谱分析条件
所述步骤(2)中冷冻干燥温度为-20℃，真空度为20pa，玻璃纤维滤纸孔径为0.45nm。
所述步骤(2)中Mcllvaine缓冲溶液为：取0.1mol/L柠檬酸溶液1 000mL、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液625mL，混匀，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至4.0±0.05。
所述步骤(2)中Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液为：取乙二胺四乙酸二钠60.5g，加Mcllvaine缓冲溶液1625mL，溶解，混匀。
本发明针对我国畜禽养殖过程中常用的磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、喹噁啉类、呋喃类、四环素类、林可胺类、β-内酰胺类、酰胺醇类、截短侧耳素类、多肽类等药物，基于超高效液相色谱串联质谱具有的高效分离性和可同时准确定性定量的特点，建立了同时测定畜禽粪便、水样中磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、喹噁啉类、呋喃类、四环素类、林可胺类、β-内酰胺类、酰胺醇类、截短侧耳素类、多肽类等药物残留的UPLC-MS/MS方法，可为畜禽养殖预防动物疾病及药物乱填乱加提供了有利可控的手段，为生态环境人类生活健康方面有了更高的安全保障。
本发明建立了多种类多药物高通量的筛查方法，测定粪便和水样中抗生素的含量粪便和水体样品中62种抗生素的含量。该方法基本涵盖了畜禽产品养殖环节常用的药物，操作简单、快速，与常规的单药物或单种类方法相比，极大提高了工作效率，检测成本约为原有的十分之一，检测周期大大缩短。并且该方法精密、准确、灵敏度高，为探明养殖场及其周边环境中抗生素的残留状况，评估排泄物中残留的抗生素的潜在危害和对环境的影响提供了技术支撑，产生巨大社会效益。
附图说明
图1是萘啶酸的色谱图。
图2是磺胺吡啶的色谱图。
图3是磺胺嘧啶的色谱图。
图4是磺胺甲恶唑的色谱图。
图5是磺胺噻唑的色谱图。
图6是二甲氧苄啶的色谱图。
图7是恶喹酸的色谱图。
图8是氟甲喹的色谱图。
图9是西诺沙星的色谱图。
图10是磺胺甲嘧啶的色谱图。
图11是磺胺二甲唑、磺胺异恶唑的色谱图。
图12是磺胺甲噻二唑的色谱图。
图13是苯酰磺胺的色谱图。
图14是磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲异嘧啶的色谱图。
图15是磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶的色谱图。
图16是磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪的色谱图。
图17是甲氧苄啶的色谱图。
图18是磺胺喹噁啉的色谱图。
图19是喹烯酮的色谱图。
图20是磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶的色谱图。
图21是诺氟沙星的色谱图。
图22是依诺沙星的色谱图。
图23是环丙沙星的色谱图。
图24是培氟沙星的色谱图。
图25是洛美沙星的色谱图。
图26是恩诺沙星的色谱图。
图27是那氟沙星的色谱图。
图28是氧氟沙星的色谱图。
图29是加替沙星的色谱图。
图30是沙拉沙星的色谱图。
图31是二氟沙星的色谱图。
图32是林可霉素的色谱图。
图33是克林霉素的色谱图。
图34是多西环素的色谱图。
图35是四环素的色谱图。
图36是土霉素的色谱图。
图37是金霉素的色谱图。
图38是泰妙菌素的色谱图。
图39是头孢噻呋的色谱图。
图40是万古霉素的色谱图。
图41是红霉素的色谱图。
图42是克拉霉素的色谱图。
图43是阿奇霉素的色谱图。
图44是吉他霉素的色谱图。
图45是罗红霉素的色谱图。
图46是替米考星的色谱图。
图47是泰乐菌素的色谱图。
图48是乙酰甲喹的色谱图。
图49是呋喃唑酮的色谱图。
图50是卡巴氧的色谱图。
图51是喹烯酮的色谱图。
图52是呋喃它酮的色谱图。
图53是头孢喹肟的色谱图。
图54是氯霉素的色谱图。
图55是甲砜霉素的色谱图。
图56是氟苯尼考的色谱图。
图57是阳性样品中氟苯尼考的色谱图。
图58是阳性样品中泰妙菌素的色谱图。
图59是阳性样品中恩诺沙星的色谱图。
具体实施方式
所检药物共11类62种抗菌药物，分别为：
(a)磺胺类：磺胺吡啶、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺异恶唑、磺胺甲噻二唑、苯酰磺胺、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺喹噁啉、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、二甲氧苄啶；
(b)喹诺酮类：恶喹酸、氟甲喹、西诺沙星、二氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、那氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、培氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、萘啶酸、依诺沙星、加替沙星；
(c)大环内酯类：泰乐菌素、替米考星、罗红霉素、吉他霉素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素；
(d)喹噁啉类：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹；
(e)呋喃类：呋喃它酮、呋喃唑酮；
(f)四环素类：四环素、金霉素、土霉素、多西环素；
(g)林可胺类：克林霉素、林可霉素；
(h)β-内酰胺类：头孢噻呋、青霉素G、头孢喹肟；
(i)酰胺醇类：氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素；
(j)截短侧耳素类：泰妙菌素；
(k)多肽类：万古霉素。
1.标准工作溶液的配制：
分别精密称取62种抗菌药物对照品10mg，置容量瓶中，用少量二甲基亚砜溶解后用甲醇稀释至刻度，分别配制成1mg/mL的标准储备液。
混合标准中间工作液(10.0μg/mL)：分别准确吸取标准储备液各100μL，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成10μg/mL的混合标准中间工作液。于5℃避光保存，有效期1个月。
混合标准工作液：准确量取混合标准中间工作液5mL，用10％乙腈水溶液稀释，制得浓度为5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的系列标准工作液，现配现用。
2.待测样品的分析前处理：
2.1样品准备：
2.1.1粪便样品：取空白或供试粪便样品，冷冻干燥后研磨，过0.45mm孔径的分析筛；取研磨的供试样品，作为供试试料；取研磨的空白样品，作为空白试料；取研磨的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料；粪便样品-20℃以下保存。
2.1.2水体样品：取空白或供试水体样品，混合均匀；取均质的供试样品，作为供试试料；取均质的空白样品，作为空白试料；取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料；水体样品4℃以下保存。
2.2提取：
2.2.1粪便样品：称取试样2.00g于50mL离心管中，加入乙腈10.0mL和Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液10.0mL，涡旋30s，振荡20min，以8000r/min转速离心5min，移取上清液至另一离心管中，加入10mL正己烷，振荡5min，8000r/min离心5min，移取下层溶液至250mL烧杯中，加水稀释至200mL，玻璃纤维滤纸过滤后，备用；
2.2.2水体样品：称取试样1mL，玻璃纤维滤纸过滤，加入Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液20.0mL，采用氢氧化钠溶液调节调pH至6.0，备用；
62种药物性质差异较大，单纯用水相或有机相提取粪便样品中的待测物回收率较低，因此选择水相和有机相混合提取。四环素类药物具有较强的极性，易与金属离子螯合形成配合物，又容易与生物样品中的蛋白质形成共轭物而造成提取困难，回收率低。所以，提取生物样品时往往需加入金属络合剂和强酸或酸性去蛋白试剂，但四环素类药物在pH<2时易发生消去反应而生产脱水物，碱性条件下易生成异构体，为了提高四环素类药物的回收率，水相拟采用含金属络合剂的弱酸性溶液-Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液。有机相比较了甲醇、乙腈、0.1％甲酸乙腈等溶剂，最终选择回收率较高的乙腈作为提取液。
粪便样品基质复杂，提取液很浑浊，尝试使用乙酸铅作为沉淀剂，但加入乙酸铅后各药物的提取回收效率有所降低。考虑到乙腈也具有一定沉淀蛋白杂质的作用，并且可以提高一些药物的回收率，故选择加大乙腈用量，使用10.0mL乙腈和10.0mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液作为提取液。
水样不需要进行提取，前处理则采用玻璃纤维滤纸过滤，去除水体中的固体杂质后加入Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液20.0mL。
2.3净化：Strata-X固相萃取柱依次用甲醇5mL、水5mL活化，移取全部备用液过柱，水10mL淋洗，抽干，甲醇8mL洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮气吹干，加入10％乙腈1.00mL溶解残余物，超声2min，混匀后20000r/min离心5min，上清液供液相色谱-串联质谱仪测定；
本发明比较了Strata-X柱、PLEXA和HLB固相萃取柱，发现喹烯酮过PEP-2固相萃取柱后无回收，Strata-X和HLB固相萃取柱对大部分药物都有保留，而Strata-X柱上各药物的回收率更均衡。尝试将SAX和Strata-X柱串联使用，发现串联柱子后个别药物回收率有所提高，但氟甲喹、磺胺氯吡嗪、磺胺喹恶啉、黄案件二甲氧嘧啶、那氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、培氟沙星、萘啶酸等回收率都有不同程度下降。因此，选择Strata-X作为净化柱。
Strata-X为反相柱，溶液中有机相含量太高会影响药物在萃取柱上的保留，因此，粪便样品的提取液需用水稀释，降低有机相比例。
溶液的PH值对回收率也有影响，考察了当溶液PH值为2、4、6、8、10、12时62种药物的回收率，发现当PH为6.0时，大部分药物的回收率最理想。因此水样在过柱前需调节PH至6.0±0.05。
3.液相色谱条件：
多种类多组分药物同时分析时，为了增大各药物间的分离度，常采用大梯度洗脱方式。本方法以Waters C18(100mm×2.1mm，1.7μm)为色谱柱，考察了多种流动相，由于一些药物药物为两性物质，色谱峰易出现拖尾现象。采用0.1％甲酸水溶液作为流动相的组成部分，大部分药物的响应明显提高，而且多数药物能得到对称、尖锐的峰形。选择乙腈和含0.1％甲酸水溶液作流动相时，大部分化合物的响应值比用甲醇和0.1％甲酸水溶液时低，故选择甲醇和0.1％甲酸水溶液作为流动相系统1。
由于磺胺类药物中有很多是同分异构体，这些药物的定性离子对及定量离子对完全相同，在质谱上无法区分，只能通过液相色谱进行分离，选择合适的流动相梯度非常重要。磺胺类药物中，有很多药物为同分异构体，特别是磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪及磺胺对甲氧嘧啶，这3种药物液相色谱上的保留时间也很相近，需要对流动相梯度进行调整以保证3种药物能够完全分离。
由于酰胺醇类药物为负离子模式下检测，0.1％甲酸水作为流动相会影响电离，喹烯酮、卡巴氧、呋喃它酮等药物虽然是在正离子模式下检测，但是在水-甲醇流动相体系下响应更好，所以选择水-甲醇作为流动相系统2。
经试验，最终确定液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，柱长100mm，柱内径2.1mm，粒度1.7μm；流动相系统1：A相：甲醇，B相：0.1％甲酸溶液，梯度洗脱，梯度见表1；流动相系统2：A相：甲醇，B相：水，梯度洗脱，梯度见表2。流速：0.1-0.30mL/min；进样量：5μL；柱温：35-40℃。
表1流动相梯度洗脱条件1
时间 A相(％) B相(％) 曲线
/ 2 98 6
0.5 2 98 6
4.0 25 75 6
7.0 60 40 6
7.1 95 5 6
8.0 95 5 6
10.0 2 98 1
表2流动相、流速及梯度洗脱条件2
时间 A相(％) B相(％) 曲线
/ 10 90 6
3.5 90 10 6
5.0 90 10 6
7.0 10 90 1
4.质谱条件离子源参数、质谱方法参数：
将一定浓度的标准溶液流动注射进样，在m/z80～1000扫描范围内分别以正、负离子模式进行一级质谱图扫描，确定各个药物的母离子峰，酰胺醇类药物在负离子模式下响应较高，因此母离子为[M+H]-，其余均是正离子模式下测定，选择[M+H]+作为母离子。进行子离子扫描，选择丰度最强的碎片离子作为定量离子，次强的碎片离子作为定性离子。选择正离子模式多反应监测，优化锥孔电压、碰撞能量等质谱参数，经过优化后的条件为：
离子源：电喷雾离子源(ESI+/ESI-)。
检测方式：多反应监测(MRM)。
电离电压：4.0kV(ESI+)；3.0kV(ESI-)。
源温：150℃。
雾化温度：500℃。
锥孔气流速：150L/h。
雾化气流速：1000L/h。
5.基质匹配标准曲线的绘制：
取6份空白样品，按步骤(2)操作，洗脱液氮气吹干后，分别移取5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的混合标准工作液各1.00mL溶解残余物，20000r/min离心5min，得上清液为基质匹配标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定，以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线，如图1-56所示；
对步骤上述的含有一定量的各个药物的试样进行质谱分析，获得各个药物的准分子离子，以及两个特征离子：定性离子和定量离子，如表3所示：
表3 62种药物保留时间和质谱信息
*为定量离子对。
6.定性分析：待测物选择1个母离子和2个子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质匹配标准溶液中对应的保留时间偏差在±2.5％之内，且样品中目标化合物两个子离子的相对丰度与浓度接近的基质匹配标准溶液相对丰度进行比较，偏差不超过下表4规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
表4定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度(％) >50 >20～50 >10～20 ≤10
允许的最大偏差(％) ±20 ±25 ±30 ±50
7.定量分析：取经过步骤2所述方法处理的待测样品和基质匹配标准溶液进行质谱分析，得到色谱峰面积响应值，作单点或多点校准，用外标法定量，待测样品溶液中待测物的响应值和基质匹配标准溶液中各待测物的特征离子的响应值均应在仪器测定的线性范围内；若试样溶液浓度超过线性范围时，
稀释后重新测定；
试样中待测物的含量以质量分数X表示，单位为微克每千克(μg/kg)，按下列公式进行计算：
公式中：
X—试样中待测物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
A—试样溶液中待测物的峰面积；
As—标准溶液中待测物峰面积；
Cs—标准溶液中待测物浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
m—样品的质量，单位为克(g)；
V—溶解残余物的体积，单位为毫升(mL)；
V1—过固相萃取柱的提取液体积，单位为毫升(mL)；
V2—总提取液体积，单位为毫升(mL)；
n—稀释倍数；
试样中待测物的含量以浓度C表示，单位为纳克每升(ng/L)，按下列公式进行计算：
公式中：
C—试样中待测物的浓度，纳克每升(ng/L)；
A—试样溶液中待测物的峰面积；
As—标准溶液中待测物峰面积；
Cs—标准溶液中待测物浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
m—样品的质量，单位为克(g)；
V—样品的体积，单位为毫升(mL)；
V1—溶解残余物的体积，单位为毫升(mL)；
测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
8.方法学验证：
8.1线性：
取6份空白样品，按前处理步骤操作，洗脱液氮气吹干后，分别移取5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的混合标准工作液各1.00mL溶解残余物，20000r/min离心5min，上清液供液相色谱-串联质谱仪测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线。粪便和水样中62种药物的标准曲线和相关系数见表5和表6，从表中可以看出，62种药物的标准曲线线性良好，相关系数均大于0.99。
8.2检测限和定量限：
检测限：添加一定量的混合标准溶液于空白样品中，经过提取净化并测定，药物的信噪比S/N≥3时，即可得到药物的检测限，粪便样品的检测限为5μg/kg，水体样品的检出限为5ng/L。
定量限：添加一定量的混合标准溶液于空白样品中，经过提取净化并测定，药物的信噪比S/N≥10时，即可得到药物的定量限，粪便样品的检测限为10μg/kg，水体样品的检出限为10ng/L。
8.3方法精密度与准确度：
在空白粪便样品中添加10、50、200μg/kg，空白水样中添加10、20、100ng/L三个浓度混合标准溶液，每个浓度做5个平行。粪便和水样中62种药物的平均回收率、变异系数如表5、表6所示。可以看出，62种药物的回收率在31.1％-130.5％之间，批内相对标准偏差均小于20％。
表5粪便中62种药物的标准曲线、相关系数、平均回收率及RSD
表6水样中62种药物的标准曲线、相关系数、平均回收率及RSD
9.小结
9.1方法灵敏度：
本发明粪便样品的检出限为5μg/kg，定量限为10μg/kg；水体样品的检出限为5ng/L，定量限为10ng/L。
9.2准确度：
本发明在空白粪便样品中添加10、50、200μg/kg，空白水样中添加10、20、100ng/L三个浓度，回收率在31.1％-130.5％之间。
9.3精密度：
本发明的批内相对标准偏差≤20％，批间相对标准偏差≤20％。
10.实际样品检测数据：
在养殖场及附近河流抽取了5份粪便样品和6份水体样品进行检测，检测结果见表7，样品1、3、9的液相色谱图如图57-59所示。
表7实际样品检测结果
样品编号 样品类型 来源 检测结果
1 粪便 畜舍 氟苯尼考(19.3μg/kg)
2 粪便 畜舍 未检出
3 粪便 畜舍 泰妙菌素(70.12μg/kg)
4 粪便 畜舍 未检出
5 粪便 畜舍 未检出
6 水样 畜舍 未检出
7 水样 水源 未检出
8 水样 化粪池 未检出
9 水样 化粪池 恩诺沙星(62.7ng/L)
10 水样 化粪池 未检出
11 水样 河流 未检出
本发明建立了粪便和水体样品中62种抗生素的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的检测方法。该方法覆盖面广，基本涵盖了畜禽产品养殖环节常用的药物，通量高，能够同时完成62种药物的检测，操作简单，可以节省大量人力、物力、财力。并且该方法精密、准确、灵敏度高，可以很好的满足实际样品检测的需要，为监测养殖场用药情况，掌握养殖业对环境的影响提供了重要的技术支撑。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种畜禽排泄物中62种抗菌药物的筛查方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
所述62种抗菌药物分别为：
(a)磺胺类：磺胺吡啶、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺异恶唑、磺胺甲噻二唑、苯酰磺胺、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺喹噁啉、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、二甲氧苄啶；
(b)喹诺酮类：恶喹酸、氟甲喹、西诺沙星、二氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、那氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、培氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、萘啶酸、依诺沙星、加替沙星；
(c)大环内酯类：泰乐菌素、替米考星、罗红霉素、吉他霉素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素；
(d)喹噁啉类：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹；
(e)呋喃类：呋喃它酮、呋喃唑酮；
(f)四环素类：四环素、金霉素、土霉素、多西环素；
(g)林可胺类：克林霉素、林可霉素；
(h)β-内酰胺类：头孢噻呋、青霉素G、头孢喹肟；
(i)酰胺醇类：氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素；
(j)截短侧耳素类：泰妙菌素；
(k)多肽类：万古霉素；
(1)标准工作溶液的配制：
标准储备液：分别称取62种抗菌药物对照品10mg，置容量瓶中，用二甲基亚砜溶解后用甲醇稀释至刻度，分别配制成1mg/mL的标准储备液；
混合标准中间工作液：分别吸取标准储备液各100μL，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成10μg/mL的混合标准中间工作液；
混合标准工作液：取混合标准中间工作液，用10％乙腈水溶液稀释，制得浓度为5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的系列标准工作液；
(2)待测样品的分析前处理：
1)样品准备：
粪便样品：取空白或供试粪便样品，冷冻干燥后研磨，过0.45mm孔径的分析筛；取研磨的供试样品，作为供试试料；取研磨的空白样品，作为空白试料；取研磨的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料；
水体样品：取空白或供试水体样品，混合均匀；取均质的供试样品，作为供试试料；取均质的空白样品，作为空白试料；取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料；
2)提取：
粪便：称取试样2.00±0.02g于50mL离心管中，加入乙腈10.0mL和Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液10.0mL，涡旋30s，振荡20min，以8000r/min转速离心5min，移取上清液至另一离心管中，加入10mL正己烷，振荡5min，8000r/min离心5min，移取下层溶液至250mL烧杯中，加水稀释至200mL，玻璃纤维滤纸过滤后，备用；
水体样品：称取试样1mL，玻璃纤维滤纸过滤，加入Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液20.0mL，采用氢氧化钠溶液调节调pH至6.0±0.05，备用；
3)净化：Strata-X固相萃取柱依次用甲醇5mL、水5mL活化，移取全部备用液过柱，水10mL淋洗，抽干，甲醇8mL洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮气吹干，加入10％乙腈1.00mL溶解残余物，超声2min，混匀后20000r/min离心5min，上清液供液相色谱-串联质谱仪测定；
(3)基质匹配标准曲线的绘制：取6份空白样品，按步骤(2)操作，洗脱液氮气吹干后，分别移取5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的混合标准工作液各1.00mL溶解残余物，20000r/min离心5min，得上清液为基质匹配标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定，以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线；
(4)对步骤(3)所述的含有一定量的各个药物的试样进行质谱分析，获得各个药物的准分子离子，以及两个特征离子：定性离子和定量离子，如下表1所示：
表1 药物的保留时间和质谱信息
(5)定性分析：对经过步骤2)所述方法处理的待测样品选择1个母离子和2个子离子，进行一次性液相色谱分析，在相同试验条件下，待测样品中待测物质的保留时间与基质匹配标准溶液中对应的保留时间偏差在±2.5％之内，且样品中目标化合物两个子离子的相对丰度与浓度接近的基质匹配标准溶液相对丰度进行比较，偏差不超过下表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物；
表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度(％) >50 >20～50 >10～20 ≤10 允许的最大偏差(％) ±20 ±25 ±30 ±50
(6)定量分析：取经过步骤(2)所述方法处理的待测样品和基质匹配标准溶液进行质谱分析，得到色谱峰面积响应值，作单点或多点校准，用外标法定量，待测样品溶液中待测物的响应值和基质匹配标准溶液中各待测物的特征离子的响应值均应在仪器测定的线性范围内；若试样溶液浓度超过线性范围时，稀释后重新测定；
试样中待测物的含量以质量分数X表示，单位为微克每千克(μg/kg)，按下列公式进行计算：
<mrow> <mi>X</mi> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <mi>A</mi> <mo>&amp;times;</mo> <mi>C</mi> <mi>s</mi> <mo>&amp;times;</mo> <mi>V</mi> <mo>&amp;times;</mo> <msub> <mi>V</mi> <mn>2</mn> </msub> </mrow> <mrow> <mi>A</mi> <mi>s</mi> <mo>&amp;times;</mo> <mi>m</mi> <mo>&amp;times;</mo> <msub> <mi>V</mi> <mn>1</mn> </msub> </mrow> </mfrac> <mo>&amp;times;</mo> <mi>n</mi> </mrow>
公式中：
X—试样中待测物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
A—试样溶液中待测物的峰面积；
As—标准溶液中待测物峰面积；
Cs—标准溶液中待测物浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
m—样品的质量，单位为克(g)；
V—溶解残余物的体积，单位为毫升(mL)；
V1—过固相萃取柱的提取液体积，单位为毫升(mL)；
V2—总提取液体积，单位为毫升(mL)；
n—稀释倍数；
试样中待测物的含量以浓度C表示，单位为纳克每升(ng/L)，按下列公式进行计算：
<mrow> <mi>C</mi> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <mi>A</mi> <mo>&amp;times;</mo> <mi>L</mi> <mi>s</mi> <mo>&amp;times;</mo> <msub> <mi>V</mi> <mn>1</mn> </msub> </mrow> <mrow> <mi>A</mi> <mi>s</mi> <mo>&amp;times;</mo> <mi>V</mi> </mrow> </mfrac> </mrow>
公式中：
C—试样中待测物的浓度，纳克每升(ng/L)；
A—试样溶液中待测物的峰面积；
As—标准溶液中待测物峰面积；
Cs—标准溶液中待测物浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
m—样品的质量，单位为克(g)；
V—样品的体积，单位为毫升(mL)；
V1—溶解残余物的体积，单位为毫升(mL)；
测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
2.根据权利要求1所述的畜禽排泄物62种抗菌药物的筛查方法，其特征在于：所述动畜禽排泄物为畜禽排泄粪便、养殖环节畜禽饮用水或畜禽养殖污水。
3.根据权利要求1所述的畜禽排泄物62种抗菌药物的筛查方法，其特征在于：所述步骤(3)和步骤(5)中的液相色谱分析条件为：色谱柱：C18柱，柱长100mm，柱内径2.1mm，粒度1.7μm；流动相系统1：A相：甲醇，B相：0.1％甲酸溶液，梯度洗脱，梯度见表3；流动相系统2：A相：甲醇，B相：水，梯度洗脱，梯度见表4；流速：0.30mL/min；进样量：5μL；柱温：35-40℃；
4.根据权利要求1所述的畜禽排泄物62种抗菌药物的筛查方法，其特征在于：所述步骤(4)和步骤(6)中的质谱分析条件为：
表5 质谱分析条件
5.根据权利要求1所述的畜禽排泄物62种抗菌药物的筛查方法，其特征在于：所述步骤(2)中冷冻干燥温度为-20℃，真空度为20pa，玻璃纤维滤纸孔径为0.45nm。
6.根据权利要求1所述的畜禽排泄物62种抗菌药物的筛查方法，其特征在于：所述步骤(2)中Mcllvaine缓冲溶液为：取0.1mol/L柠檬酸溶液1 000mL、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液625mL，混匀，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至4.0±0.05。
7.根据权利要求6所述的畜禽排泄物62种抗菌药物的筛查方法，其特征在于：所述步骤(2)中Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液为：取乙二胺四乙酸二钠60.5g，加Mcllvaine缓冲溶液1625mL，溶解，混匀。
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