CN110514767A - 固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法 - Google Patents

固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种固相萃取‑高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法，水样经HLB固相萃取柱富集净化，通过对比不同水样PH和金属络合剂Na2EDTA加入量等条件下目标分析物的回收率确定了最佳前处理方法。采用Agilent Zorbax Rrhd Eclipse Plus C18(2.1×50mm，1.8μm)色谱柱，正离子模式下采用0.2％甲酸‑2mmol乙酸铵水溶液和甲醇‑乙腈(v/v，1:1)体系作为流动相，负离子模式采用纯水和甲醇‑乙腈(v/v，1:1)体系作为流动相，梯度洗脱进行色谱分离，在HPLC‑MS/MS多重反应监测模式下分析，内标法定量。应用该方法对贵阳市南明河地表水水样进行检测，共检出34种抗生素，检出总浓度在47.2ng/L～1740ng/L，其中大环内酯类检出浓度最高，平均浓度为257ng/L。

Description

固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种 抗生素的方法
技术领域
本发明涉及一种水样检测方法，更具体的，涉及一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法。
背景技术
抗生素是一类可有效抑制微生物活性的化合物，具有预防和治疗人类和动物疾病、促进生长等作用，被广泛地应用于医疗、农业生产和畜牧养殖业。逐年增长的抗生素产量和销量引发的抗生素乱用滥用现象不容忽视。研究表明抗生素使用后不能完全被机体吸收代谢，约有60％～90％随着尿液或粪便进入环境，环境中的抗生素通过迁移转化进入水环境。水环境中抗生素残留在食物链中累计放大效应对水生生物存在潜在风险。其形成的抗性基因已经被世界卫生组织列为对公众健康和生态环境造成危害的三大威胁之一。抗生素种类众多，水环境中抗生素的残留现状受到广泛关注，目前我国水环境中已报道抗生素约68种，并且抗生素的单体性质差异大，实现同时高灵敏准确分析较困难，目前尚没有可参考的水中多种抗生素同时分析的标准方法。现有技术的抗生素检测方法普遍存在着检出数量少，灵敏度不高的问题，例如，Iglesias,A等采用小柱利用SPE富集净化技术同时分析地表水中12种抗生素，回收率为73.0～142％，远不能满足水中多种抗生素同时检测分析的需要。
发明内容
本申请实施例提供一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法，采用SPE-HPLC-MS/MS技术，通过优化色谱、质谱条件以及前处理方法，建立了同时测定地表水中多种抗生素的分析方法，方法灵敏度高、准确性好，具有较强的实用价值。
本发明提供一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法，包括以下步骤：
1)液相条件：选取Agilent Zorbax Rrhd Eclipse Plus C18色谱柱，所述色谱柱的规格为2.1×50mm，1.8μm；设置所述色谱柱的进样量为5μL；流速0.2mL/min；柱温40℃；
其中，氯霉素类化合物在负离子模式下进行分析检测，流动相A为超纯水，流动相B为体积比1:1的甲醇：乙腈，流动相梯度为0-2min，25-60％B；2-4min，60-80％B；4-5min，100％B，保持2min，7-7.01，100—25％B，7.01-9min，25％B；
其他化合物均在正离子模式下分析检测，无机相为0.2％甲酸水含2mmoL乙酸铵，流动相梯度为：0-0.5min，5％B；0.5-5min，5-20％B；5-10min，20-40％B，10-14min，40-70％B，14-17min，70-100％B，保持3min，20-20.01min，100-5％B，20.01-23min，5％B。
2)质谱条件：ESI+/ESI-切换；多重反应监测模式(MRM)，载气温度：325℃，载气流速6L/min，锥口电压45psi，鞘气温度370℃，鞘气流速12L/min，毛细管电压3500V；
3)样品前处理方法
水样静置，取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤除去悬浮颗粒物，准确量取500mL水样调pH值至5，加入20ng内标指示物摇匀，准确加入0.25g Na2EDTA，然后用规格为6cc/500mg的Oasis HLB小柱进行富集净化，HLB柱先依次用5mL甲醇和5mL超纯水进行活化，上样流速控制在2.0-5.0mL/min左右；上样后先用10mL超纯水清洗HLB小柱，并抽干，然后用6mL体积比为5:95的氨水：甲醇溶液作为洗脱液进行洗脱；洗脱液在35℃用N2吹干浓缩至近干，最后用1:9甲醇水定容至0.5mL，12000r/min离心10min后取上层清液上机分析，内标法定量。
进一步地，所述内标指示物包括SMA-D4、SMX-D4、LIN-D3、THI-D4、TRI-D3、OFL-D3、SAR-D8、ERY-13C,D3、CAP-D5。
进一步地，所述抗生素有6类，包括：磺胺类(SAs)，喹诺酮类(QNs)，大环内酯类(MCs)，四环素类(TCs)，氯霉素类(CAPs)和其他类(CLOX、LIN、MON、SAL)。
进一步地，鞘气温度为370℃，EMV(+)和EMV(-)分别为400V、200V。
进一步地，还包括：
4)标准溶液的配制：准确称量标准品0.004g，用甲醇制成1.00g/L的标准储备液，于4℃保存，使用时用初始流动相稀释。
进一步地，调节待测定样品的PH为5。
本研究采用SPE-HPLC-MS/MS技术，通过重点优化目标分析物的色谱、质谱条件、样品的PH值以及金属络合剂Na2EDTA加入量等，建立了地表水中6类共40种抗生素同时分析测定方法，该方法灵敏高、准确度好，为地表水中典型抗生素的分析提供了又一准确可靠的分析方法，具有较强的实用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法的甲酸对MAR峰型的影响图；
图2-a为本发明实施例提供的一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法的40种抗生素标准溶液色谱图(ESI+)；
图2-b为本发明实施例提供的一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法的40种抗生素标准溶液色谱图(ESI-)；
图3为本发明实施例提供的一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法的不同PH下40种抗生素的平均回收率和相对标准偏差。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本研究结合我国抗生素使用特征，选择环境中检出率高、检出浓度大的化合物，确定6类抗生素，包括：15种磺胺类(SAs)，9种喹诺酮类(QNs)，7种大环内酯类(MCs)，3种四环素类(TCs)，2种氯霉素类(CAPs)和4种其他类(CLOX、LIN、MON、SAL)共40种抗生素为目标分析物，采用SPE-HPLC-MS/MS技术，通过优化色谱、质谱条件以及前处理方法，建立了同时测定地表水中40种抗生素的分析方法，方法灵敏度高、准确性好，并成功应用于贵阳市南明河地表水中抗生素的分析测定，具有较强的实用价值，为地表水中多种类抗生素同时分析提供了又一可靠的分析方法。
仪器与试剂
仪器：高效液相色谱串联-三重四极杆质谱仪：Agilent 1260-6460C，Masshunter色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)、N-EVMPTM112氮吹仪(美国Organomation公司)、24孔固相萃取装置(美国Waters公司)、TG16W高速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)、Oasis HLB固相萃取柱小柱(6cc/500mg，美国Waters公司)、Zorbax Rrhd Eclipse PlusC18色谱柱(2.1×50mm，1.8μm，美国安捷伦科技有限公司)。
试剂：甲醇与乙腈(色谱纯，德国默克公司)、甲酸与氨水(色谱纯，天津科密欧试剂有限公司)、乙酸铵(色谱纯，美国fisher公司)、乙二胺四乙酸二钠盐(Na2EDTA)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)
标准品：磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺乙酰胺(SCT)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺甲异恶唑(SMX)、磺胺间二甲氧嘧啶钠(SSS)、磺胺噻唑(ST)、醋酸铵甲恶唑(ASMZ)、磺胺二甲异恶唑(SIZ)、磺胺胍(SG)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺对甲氧嘧啶(SM)、磺胺多辛(SDO)、磺胺甲嘧啶(SMR)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、四环素(TC)、土霉素(OTC)、强力霉素(DC)、马波沙星(MAR)、氟罗沙星(FLE)、甲磺酸培氟沙星(PEF)、诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、甲磺酸达诺沙星(DAN)、氧氟沙星(OFL)、沙拉沙星盐酸盐(SAR)、恩诺沙星(ENR)、泰乐菌素酒石酸盐(TYL)、罗红霉素(ROX)、脱水红霉素(ERY)、克拉霉素(CTM)、竹桃霉素(ODM)、交沙霉素(LEU-A3)、螺旋霉素(SPI)、林可霉素(LIN)、氯唑西林(CLOX)、莫能霉素(MON)、盐霉素(SAL)、氯霉素(CAP)、氟苯尼考(FF)。除了TYL和ERY购自美国Sigma-Aldrich，其他均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH；甲氧嘧啶-D3(TRI-d3)、红霉素-13C,D3(ERY-13C,D3)、林可霉素-D3(LIN-D3)、磺胺二甲嘧啶-D4(SMA-D4)、磺胺甲基异恶唑-D4(SMX-D4)、氧氟沙星-D3(OFL-D3)购自美国Andover，氯霉素-D5(CAP-D5)购自德国Dr.EhrenstorferGmbH。
标准溶液的配制：准确称量标准品0.004g，用甲醇制成1.00g/L的标准储备液，于4℃保存，使用时用初始流动相稀释。
仪器条件
液相条件：Agilent Zorbax Rrhd Eclipse Plus C18色谱柱(2.1×50mm，1.8μm)；进样量5μL；流速0.2mL/min；柱温40℃；氯霉素类化合物(CAP、FF)在负离子模式下进行分析检测，流动相A超纯水，流动相B甲醇/乙腈(1：1，V/V)，流动相梯度为：0-2min，25-60％B；2-4min，60-80％B；4-5min，100％B，保持2min，7-7.01，100—25％B，7.01-9min，25％B。其他化合物均在正离子模式下分析，无机相为0.2％甲酸水含2mmoL乙酸铵，流动相梯度为：0-0.5min，5％B；0.5-5min，5-20％B；5-10min，20-40％B，10-14min，40-70％B，14-17min，70-100％B，保持3min，20-20.01min，100-5％B，20.01-23min，5％B。
质谱条件：ESI+/ESI-切换；多重反应监测模式(MRM),载气温度：325℃，载气流速6L/min，锥口电压45psi，鞘气温度370℃，鞘气流速12L/min，毛细管电压3500V。其他参数见表1。
表1目标抗生素主要的MRM MS参数
样品前处理方法
水样静置，取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤除去悬浮颗粒物，准确量取500mL水样调pH值至5，加入20ng内标指示物(SMA-D4、SMX-D4、LIN-D3、THI-D4、TRI-D3、OFL-D3、SAR-D8、ERY-13C,D3、CAP-D5)摇匀，准确加入0.25g Na2EDTA，然后用Oasis HLB小柱(6cc/500mg)进行富集净化。HLB柱先依次用5mL甲醇和5mL超纯水进行活化，上样流速控制在2.0-5.0mL/min左右；上样后先用10mL超纯水清洗HLB小柱，并抽干，然后用6mL氨水-甲醇(5:95，V/V)溶液作为洗脱液进行洗脱。洗脱液在35℃用N2吹干浓缩至近干，最后用1:9甲醇水定容至0.5mL，12000r/min离心10min后取上清液上机分析，内标法定量。
色谱条件的优化
6类抗生素的化学结构不同其质谱行为也不同，CAPs类抗生素在多重反应监测负离子模式下(ESI-)响应较强，而其他几类抗生素在多重反应监测正离子模式(ESI+)下响应较强，为了使目标分析物相应最佳，本方法选择正负离子分开监测。
在ESI+模式下分别考察了Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(2.1×100mm,3.5μm)、Zorbax Hilic Plus C18(2.1×100mm,3.5μm)，Zorbax Rrhd Eclipse Plus C18(2.1×50mm，1.8μm)对抗生素的分离效果，结果显示在最佳色谱条件下，Zorbax Rrhd EclipsePlus C18柱亚2微米的粒径对目标分析物的分离效果最佳，峰型最好，同时分离时间最短。因此最终选择Zorbax Rrhd Eclipse Plus C18色谱柱。
在ESI+模式下，实验对比了甲醇、甲醇/乙腈(1/1，V/V)和乙腈作为有机相对38种正离子的抗生素灵敏度和分离度的影响，结果表明甲醇/乙腈(1:1)作为有机相时目标分析物的分离度最好，响应最高，因此选择甲醇/乙腈(1:1)作为有机相。
同时，实验对比了向无机相中不加甲酸和加入0.2％甲酸对抗生素灵敏度以及峰型的影响。结果表明加入甲酸后可有效改善目标抗生素的峰型，减少拖尾现象同时增加了响应值(以喹诺酮类抗生素MAR为例，见图1)。这是由于流动相中加入甲酸，增加了氢离子浓度，增强目标分析物在ESI+模式下[M+H]+离子的形成，提高了离子化效率和灵敏度。
另外对比了在无机相中不加乙酸铵和加入2mmmol或5mmol乙酸铵对色谱峰的影响。结果表明在无机相中加入2mmol乙酸铵时目标分析物的响应值最高。在流动相中加入乙酸铵的作用主要是使流动相的PH更稳定，同时乙酸铵还具有改善峰型的作用。因此，最终选择0.2％甲酸含2mmmol乙酸铵作为正离子的无机相A，甲醇/乙腈(1:1)作为有机相B。在0.2mL/min流速条件下，梯度洗脱为梯度为：0-0.5min，5％B；0.5-5min，5-20％B；5-10min，20-40％B，10-14min，40-70％B，14-17min，70-100％B，保持3min，20-20.01min，100-5％B，20.01-23min，5％B 23min内实现38种正离子目标分析物实现较好分离，色谱图见图2-a。由于在ESI+模式下2种氯霉素类抗生素响应低，因此选择ESI-模式，无机相A为纯水，目标分析物响应增强，甲醇/乙腈(1/1，V/V)为有机相B。在0.2mL/min流速条件下，梯度洗脱梯度为：0-2min，25-60％B；2-4min，60-80％B；4-5min，100％B，保持2min；7-7.01，100-25％B；7.01-9min，25％B，9min内实现氯霉素类抗生素较好分离，色谱图见图2-b。
质谱条件的优化
分别采用ESI+、ESI-模式对目标分析物进行监测。将目标物和内标分别配成100μg/L标准溶液，采用一级质谱进行母离子全扫，[M+H]+/[M-H]-为分子离子峰，依次优化碎裂电压(Fragmentor)、子离子(Production)、碰撞能量(Collision energy)，选择响应高且稳定的子离子为定量离子，响应较低的为定性离子，进行MRM模式监测，化合物离子质核比见表1。鞘气温度和EMV电子倍增管电压对目标分析物的灵敏度影响较大，其值越大，目标物灵敏度越高，经过实验优化最终鞘气温度为370℃，EMV(+)和EMV(-)分别为400V、200V。
前处理条件的优化
在已报道的固相萃取柱类型、洗脱溶液和洗脱体积等条件基础上，本实验考虑到目标分析物种类较多，性质差异大，选取可适用于酸性、碱性以及中性化合物的通用型Oasis HLB固相萃取小柱。磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类抗生素含有酸性或碱性官能团，溶液的PH值决定化合物的电离状态,因此对样品的PH进行了重点优化。用甲酸和氨水将水样PH调至3、5、7、9进行加标回收试验，每组三个样品，加标浓度为50μg/L，结果如图3。实验结果表明大部分目标分析物在PH为5时，回收率较好，因此综合目标污染物的响应情况确定样品PH为5，这与文献中报道的PH不同，主要因为不同目标抗生素的在固相萃取柱上的保留能力与其本身的PKa值和PH有关，当PH值大于PKa时，大多数分子以亲水离子形式存在，从而不容易被用亲脂性吸收剂填充的SPE柱保留；当样品的PH值低于目标分析物的PKa时，SPE回收率会增加。此外，金属络合剂NA2EDTA的作用是与金属阳离子结合，防止目标分析物与金属离子结合，从而提高SPE富集效率。本实验考察了在不加NA2EDTA、加入0.25g和0.5g NA2EDTA条件下对目标回收率的影响。结果表明NA2EDTA对磺胺类抗生素的回收率影响不大，因为磺胺类抗生素与金属阳离子不形成络合物；其他类抗生素随着NA2EDTA加入量增加，回收率增加。当加入量为0.5g NA2EDTA时，TC和DC的回收率分别为257％、197％；而加入0.25g NA2EDTA时抗生素的回收率在61.7％～147％。因此确定NA2EDTA加入量为0.25g。
本研究采用SPE-HPLC-MS/MS技术，通过重点优化目标分析物的色谱、质谱条件、样品的PH值以及金属络合剂Na2EDTA加入量等，建立了地表水中6类共40种抗生素同时分析测定方法，方法成功地应用于贵阳市南明河地表水中抗生素分析，共检出34种抗生素(参见表2)，检出总浓度在47.2ng/L～1740ng/L，其中大环内酯类检出浓度最高，平均浓度为257ng/L。结果表明该方法灵敏高、准确度好，为地表水中典型抗生素的分析提供了又一准确可靠的分析方法，具有较强的实用价值。
表2地表水中抗生素的分析结果
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)液相条件：选取Agilent Zorbax Rrhd Eclipse Plus C18色谱柱，所述色谱柱的规格为2.1×50mm，1.8μm；设置所述色谱柱的进样量为5μL；流速0.2mL/min；柱温40℃；
其中，氯霉素类化合物在负离子模式下进行分析检测，流动相A为超纯水，流动相B为体积比1:1的甲醇：乙腈，流动相梯度为0-2min，25-60％B；2-4min，60-80％B；4-5min，100％B，保持2min，7-7.01，100—25％B，7.01-9min，25％B；
其他化合物均在正离子模式下分析检测，无机相为0.2％甲酸水含2mmoL乙酸铵，流动相梯度为：0-0.5min，5％B；0.5-5min，5-20％B；5-10min，20-40％B，10-14min，40-70％B，14-17min，70-100％B，保持3min，20-20.01min，100-5％B，20.01-23min，5％B。
2)质谱条件：ESI+/ESI-切换；多重反应监测模式(MRM)，载气温度：325℃，载气流速6L/min，锥口电压45psi，鞘气温度370℃，鞘气流速12L/min，毛细管电压3500V；
3)样品前处理方法
水样静置，取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤除去悬浮颗粒物，准确量取500mL水样调pH值至5，加入20ng内标指示物摇匀，准确加入0.25g Na2EDTA，然后用规格为6cc/500mg的Oasis HLB小柱进行富集净化，HLB柱先依次用5mL甲醇和5mL超纯水进行活化，上样流速控制在2.0-5.0mL/min左右；上样后先用10mL超纯水清洗HLB小柱，并抽干，然后用6mL体积比为5:95的氨水：甲醇溶液作为洗脱液进行洗脱；洗脱液在35℃用N2吹干浓缩至近干，最后用1:9甲醇水定容至0.5mL，12000r/min离心10min后取上层清液上机分析，内标法定量。
2.根据权利要求1所述的一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法，其特征在于，所述内标指示物包括SMA-D4、SMX-D4、LIN-D3、THI-D4、TRI-D3、OFL-D3、SAR-D8、ERY-13C,D3、CAP-D5。
3.根据权利要求1或2所述的一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法，其特征在于，所述抗生素有6类，包括：磺胺类(SAs)，喹诺酮类(QNs)，大环内酯类(MCs)，四环素类(TCs)，氯霉素类(CAPs)和其他类(CLOX、LIN、MON、SAL)。
4.根据权利要求1或2所述的一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法，其特征在于，鞘气温度为370℃，EMV(+)和EMV(-)分别为400V、200V。
5.根据权利要求1-4之一所述的一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法，其特征在于，还包括：
4)标准溶液的配制：准确称量标准品0.004g，用甲醇制成1.00g/L的标准储备液，于4℃保存，使用时用初始流动相稀释。
6.根据权利要求1-4之一所述的一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法同时测定地表水中多种抗生素的方法，其特征在于，调节待测定样品的PH为5。
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