CN106841429A - 一种牛奶中抗菌类药物的高通量筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品中抗菌药物残留检测技术领域,具体涉及牛奶中抗菌类药物高通量筛选方法。涉及牛奶中120种抗菌药物残留同时检测的方法。所述检测方法包括:(1)建立牛奶中抗菌类药物前处理技术;(2)建立牛奶中抗菌类药物检测方法;(3)建立空白牛奶谱图库;(4)建立牛奶中抗菌类药物残留谱图库;(5)将空白牛奶谱图库与牛奶中抗菌类药物残留谱图库进行比对,得到待测牛奶样品中抗菌类药物种类和含量。本发明牛奶样品中抗菌类药物残留检测方法,操作简便、快速、有机试剂用量少,灵敏度高。本发明可以快速、准确地鉴别出牛奶样品中抗菌类药物种类和含量,适用于牛奶中抗菌类药物残留监控。
Description
技术领域
本发明属于牛奶中抗菌药物残留检测技术领域,具体涉及一种牛奶中抗菌类药物的高通量筛选方法,本发明可以对牛奶中120种抗菌药物残留进行高通量的筛选。
背景技术
兽药作为发展现代畜牧业的物质基础,在降低畜禽的发病率与死亡率、促进动物生长、改善动物产品品质和提高饲料利用率方面起到了重要的作用。在奶牛的饲养中抗菌药物的使用非常普遍,例如各种抗生素及磺胺药物就被广泛用于预防和治疗牛乳腺炎等疾病。随着公众对食品安全越来越关注,牛奶中的抗菌类药物残留问题也越来越得到重视。兽用抗微菌类药物种类较多,主要包括β-内酰胺类、四环素类、酰胺醇类、大环内酯类、林可胺类、多肽类、磺胺类、喹诺酮类及硝基咪唑等药物。但是由于在奶牛饲养中不合理的使用药物,会导致牛奶中的药物残留。因此研究牛奶中抗菌类药物的残留的快速、简便的检测方法是十分必要的。
目前,牛奶中抗菌类药物的检测方法主要是针对单一类药物或少数几类药物,检测方法时间较长,检测成本较高。因此,针对目前牛奶样品中抗菌类药物检测不足,发明了高通量的牛奶样品中抗菌类药物残留检测方法,检测速度快、成本低,适用于日常牛奶样品中多类多种抗菌类药物残留监控。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛奶中抗菌药物残留高通量筛选方法,为了克服现有样品检测技术的缺陷,提供一种快速、简便、成本低、灵敏度高等优点的牛奶中多种多类抗菌药物残留高通量的筛选方法。
一种适用于牛奶中抗菌类药物残留高通量筛选方法,其特征在于该方法的具体步骤为:
(1)牛奶样品前处理
向牛奶样品中,加入10mL提取乙腈-水(体积比为90:10)和0.5g的Na2EDTA进行提取,于35℃下旋转至体积约为0.5mL,用流动相定容至1.0mL;
(2)液相色谱-串联质谱检测
色谱条件:高效液相色谱柱:Hypersil GoldenC18色谱柱(150mm×2.1mm,5μm);流速:0.2mL/min;流动相:A:乙腈,B:0.1%甲酸水溶液;梯度洗脱(t,min):t0′,A=5%;t5′,A=5%;t10′,A=25%;t25′,A=25%;t40′,A=50%;t45′,A=80%;t50′,A=80%;t50.5′,A=5%;t60′,A=5%。
质谱条件:采用电喷雾离子源测定,在多反应监测模式下,用正、负离子模式同时进行扫描,喷雾电压为5000V;鞘气压力35arb;A辅助气压力5arb;毛细管温度350℃。
(3)建立空白牛奶标准谱图库
按照步骤(1)和(2)对空白牛奶进行提取和测定,得到空白牛奶样品标准谱图库;
(4)建立抗菌类药物残留的标准谱图库。
待空白牛奶添加抗菌类药物残留后,按照步骤(1)和(2)进行提取和测定,得到含有抗菌类药物的牛奶样品标准谱图库;
(6)牛奶样品中抗菌类药物含量测定
将待测定的牛奶样品,按照步骤(1)和(2)进行提取和测定,与空白牛奶标准谱图库和抗菌类药物残留的标准谱图库进行比对,得到牛奶样品中抗菌类药物的种类和含量信息。
本发明所述抗菌类药物包括,硝基咪唑类(例如:羟基异丙硝唑、异丙硝唑、甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、盐酸特硝唑、氯甲硝唑);林可霉素类(例如:林可霉素、克林霉素、吡利霉素);β-内酰胺类(例如:头孢拉定、头孢噻呋钠、头孢喹肟、头孢羟氨苄、头孢呋辛钠、头孢唑啉钠、头孢克洛、头孢哌酮钠、头孢噻肟钠、头孢西丁、头孢匹林钠、羧苄西林钠、萘夫西林钠、苯唑西林钠、阿莫西林、青霉素V钾、青霉素G钾、氯唑西林、双氯西林、头孢噻吩、头孢氨苄、氨苄西林、去呋喃甲基头孢噻呋);喹诺酮类(例如:司帕沙星、甲磺酸达氟沙星、诺氟沙星、盐酸洛美沙星、盐酸二氟沙星、氟甲喹、萘啶酸、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、奥比沙星、培氟沙星、恶喹酸、依诺沙星、氟罗沙星、麻保沙星、吡哌酸、左氧氟沙星、沙拉沙星、西诺沙星、环丙沙星、加替沙星);四环素类:(例如:四环素、土霉素、金霉素、多西环素、去甲金霉素、米诺环素);酰胺醇类(例如:氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺);磺胺类(例如:磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺甲氧嗪、磺胺喹恶林、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺索嘧啶、磺胺噻唑、氨苯磺胺、磺胺脒、磺胺苯酰、磺胺硝苯、磺胺恶唑、磺胺苯唑、磺胺甲恶唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺二甲嘧啶);大环内酯类(例如:罗红霉素、替米考星、交沙霉素、磷酸竹桃霉素、螺旋霉素、阿奇霉素、玻乙红霉素、柱晶白霉素、那他霉素、克拉霉素、红霉素、酒石酸泰乐菌素、维吉尼亚霉素、麦迪霉素)。
本发明有益效果是:
(1)本发明建立了一种可以同时测定牛奶品中抗菌类药物残留的高通量筛选方法。
(2)采用有机试剂和螯合剂提取牛奶中抗菌类药物,满足了多种抗菌类药物的提取回收率,本发明的样品前处理方法简便和快速。
(3)本发明建立牛奶中抗菌类药物残留谱图库,待测样品测定后,与谱图库比较,可以准确、快速地鉴别牛奶中抗菌类药物的种类和含量,适用于牛奶样品中抗菌类药物残留监控。
附图说明
图1:牛奶添加四环素类药物(添加量5.0μg/kg)特征离子质量色谱图。
图2:牛奶添加β-内酰胺类药物(7.5μg/kg)特征离子质量色谱图;附图标记说明:图2中图2A、图2B、图2C的图为仪器出图的同一个表征的β-内酰胺类药物。
图3:牛奶添加硝基咪唑类药物(2.5μg/kg)特征离子质量色谱图。
图4:牛奶添加磺胺类药物(5.0μg/kg)特征离子质量色谱图;附图标记说明:图4中图4A、图4B、图4C的图为仪器出图的同一个表征的磺胺类药物。
图5:牛奶添加喹诺酮类药物(4.0μg/kg)特征离子质量色谱图;附图标记说明:图5中图5A、图5B、图5C的图为仪器出图的同一个表征的喹诺酮类药物。
图6:牛奶添加酰胺醇类药物(1.5μg/kg)和林可胺类药物(7.5μg/kg)特征离子质量色谱图。
图7:牛奶添加大环内脂类药物(5.0μg/kg)特征离子质量色谱图;附图标记说明:图7中图7A、图7B、图7C的图为仪器出图的同一个表征的大环内脂类药物。
具体实施方式
下面结合具体具体实施实例对本发明作进一步详细说明,但本发明并不局限于具体实施在实施例中有的表征药物是3张小图,都是下面标注的一类药物,只是仪器出图时,只能几个药物一起出图,所以药物多时,就会存在同时出现3张小图的情形,可结合《附图说明》予以说明。
实施例1:抗菌类药物残留的标准谱图库的建立
(1)牛奶中抗菌类药物前处理
向牛奶样品中,加入10mL提取乙腈-水(90:10,V/V)和0.5g Na2EDTA进行提取,在35℃旋转至体积约为0.5mL,用流动相定容至1.0mL。
(2)牛奶中抗菌类药物检测
色谱条件:高效液相色谱柱:Hypersil GoldenC18色谱柱(150mm×2.1mm,5μm);流速:0.2mL/min。流动相:A:乙腈,B:0.1%甲酸水溶液;梯度洗脱(t,min):t0′,A=5%;t5′,A=5%;t10′,A=25%;t25′,A=25%;t40′,A=50%;t45′,A=80%;t50′,A=80%;t50.5′,A=5%;t60′,A=5%。
质谱条件:采用电喷雾离子源测定,在多反应监测模式下,用正、负离子模式同时进行扫描,喷雾电压为5000V;鞘气压力35arb;A辅助气压力5arb;毛细管温度350℃
(3)建立抗菌类药物标准谱图库
向空白牛奶中添加抗菌类药物,按照以上步骤,对牛奶中抗菌类药物进行提取和检测后,得到含有抗菌类药物的标准谱图。
(4)绘制标准曲线,以外标法定量
准确量取适量抗菌类药物混合标准工作液,用空白样品基质溶液作为标准溶液的稀释液,配制成混合标准工作液,依次进行测定,以得到的峰面积为纵坐标,对应的标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线。基质标准曲线线性范围为1.0μg/L~500μg/L,线性相关系数大于0.99。
Claims (2)
1.一种牛奶中抗菌类药物的高通量筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)牛奶样品前处理
向牛奶样品中加入10mL提取溶剂和螯合剂用于提取,在35℃下旋转至体积为0.5mL,用流动相定容至1.0mL;
(2)液相色谱-串联质谱检测
色谱条件:高效液相色谱柱:Hypersil Golden C18色谱柱,150mm×2.1mm,5μm;流速:0.2mL/min。
质谱条件:采用电喷雾离子源测定,在多反应监测模式下,用正、负离子模式同时进行扫描,喷雾电压为5000V;鞘气压力35arb;A辅助气压力5arb;毛细管温度350℃;
(3)建立空白牛奶标准谱图库
用步骤(1)和(2)的方法对空白牛奶进行提取和测定,得到空白牛奶样品标准谱图库;
(4)建立抗菌类药物残留的标准谱图库;
空白牛奶添加抗菌类药物残留后,用步骤(1)和(2)的方法进行提取和测定,得到含有抗菌类药物的牛奶样品标准谱图库;
(5)牛奶样品中抗菌类药物含量测定
待测定的牛奶样品,按步骤(1)和(2)所述的方法进行提取和测定,并与空白牛奶标准谱图库和抗菌类药物残留的标准谱图库进行比对,得到牛奶样品中抗菌类药物的种类和含量信息;
其中
步骤(1)中的提取溶剂为乙腈-乙酸乙酯,体积比为95:5;
步骤(1)中的螯合剂为0.5g的Na2EDTA;
步骤(2)中的流动相为:A:乙腈,B:0.1%浓度的甲酸水-5m mol/L的甲酸胺溶液,采用梯度洗脱。
2.如权利要求1所述的牛奶中抗菌类药物高通量筛选方法,其特征在于,所述抗菌类药物包括,硝基咪唑类:羟基异丙硝唑、异丙硝唑、甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、盐酸特硝唑、氯甲硝唑;林可霉素类:林可霉素、克林霉素、吡利霉素;β-内酰胺类:头孢拉定、头孢噻呋钠、头孢喹肟、头孢羟氨苄、头孢呋辛钠、头孢唑啉钠、头孢克洛、头孢哌酮钠、头孢噻肟钠、头孢西丁、头孢匹林钠、羧苄西林钠、萘夫西林钠、苯唑西林钠、阿莫西林、青霉素V钾、青霉素G钾、氯唑西林、双氯西林、头孢噻吩、头孢氨苄、氨苄西林、去呋喃甲基头孢噻呋);喹诺酮类:司帕沙星、甲磺酸达氟沙星、诺氟沙星、盐酸洛美沙星、盐酸二氟沙星、氟甲喹、萘啶酸、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、奥比沙星、培氟沙星、恶喹酸、依诺沙星、氟罗沙星、麻保沙星、吡哌酸、左氧氟沙星、沙拉沙星、西诺沙星、环丙沙星、加替沙星;四环素类:四环素、土霉素、金霉素、多西环素、去甲金霉素、米诺环素;酰胺醇类:氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺;磺胺类:磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺甲氧嗪、磺胺喹恶林、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺索嘧啶、磺胺噻唑、氨苯磺胺、磺胺脒、磺胺苯酰、磺胺硝苯、磺胺恶唑、磺胺苯唑、磺胺甲恶唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺二甲嘧啶;大环内酯类:罗红霉素、替米考星、交沙霉素、磷酸竹桃霉素、螺旋霉素、阿奇霉素、玻乙红霉素、柱晶白霉素、那他霉素、克拉霉素、红霉素、酒石酸泰乐菌素、维吉尼亚霉素、麦迪霉素。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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