CN107561205A

CN107561205A - 一种液质联用检测池塘沉积物中45种兽药的方法

Info

Publication number: CN107561205A
Application number: CN201710734238.0A
Authority: CN
Inventors: 赵东豪; 王强; 王旭峰; 黎智广; 黄珂; 杨宏亮; 蔡楠; 关婉琪; 李刘冬; 柯常亮; 刘奇; 陈洁文; 莫梦松
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2017-08-24
Filing date: 2017-08-24
Publication date: 2018-01-09

Abstract

本发明提供了一种液质联用检测池塘沉积物中45种兽药的方法，包括以下步骤：1)样品的提取；2)固相萃取净化；3)液质联用分析：步骤2)的过滤液经液相色谱‑串联质谱仪测定获得待测物的峰面积，将峰面积代入对应的标准曲线分析计算，定量获取沉积物样品中45种兽药的含量。本发明采用超高效液相色谱串联质谱仪，根据各种化合物的极性差别，色谱柱选用柱效较高的粒度为1.7μm的Kinetex C₁₈色谱柱，正负离子同时扫描，一次实验即可实现45种兽药的同时分析，能够满足高通量、高灵敏度的快速检测要求。

Description

一种液质联用检测池塘沉积物中45种兽药的方法

技术领域

本发明涉及一种45种兽药的检测方法，特别涉及一种液质联用检测池塘沉积物中45种兽药的方法。

技术背景

水产养殖过程中，为预防或治疗鱼、虾等动物的细菌性疾病，减少经济损失，相关从业人员经常会使用磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类等抗菌药物，甚至硝基呋喃类和氯霉素类等违禁药物在水产品中也屡有检出。与畜禽养殖不同，水产养殖不管是将药物混合在饲料中饲喂，还是直接往池塘中泼洒，药物都会溶于水体，继而在沉积物中蓄积，随着外界环境的变化进一步向水体中缓慢释放，产生二次污染，而水中残留的药物会在换水时污染周围的河流、湖泊等自然水域由此导致的质量安全问题亟待解决。在现有的文献中，王丹等研究结果表明，在中国地表水环境中已检出磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类等68种抗菌药物(王丹,隋倩,赵文涛,等.中国地表水环境中药物和个人护理品的研究进展[J].科学通报,2014(9):743–751)。虽然如此种类众多的抗菌药物残留并不完全与水产养殖业相关，但水产养殖过程中抗菌药物的不合理使用，仍是其中一种不容忽略的因素。水体和沉积物等养殖环境中抗菌药物较高浓度的残留，会影响生态环境的平衡，还可能诱导细菌耐药性，危害人类健康。

目前，硝基呋喃类、磺胺类、氟喹诺酮类、和氯霉素类等禁限用药物的残留检测方法主是以高效液相色谱法(HPLC)或液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)为主，测定某类药物，或者同时测定少数几类药物，检测样本多为畜禽水产品或水体。而针对池塘沉积物中多种药物残留的同时监测，尚缺乏相关的国标方法和有效技术指导。沉积物样品中的药物与生物基质结合较少，也相对比较容易提取。因此，一次样品处理，建立沉积物中多种类药物的残留检测方法成为可能。鉴于目前水产养殖过程存在的药物滥用情况，为了更加方便、有效地监控多种类药物的使用，评估水产养殖环境对水产品的质量安全风险，有必要建立准确、可靠的检测方法，从源头上对水产品的养殖环境进行安全监控。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种池塘沉积物中45种兽药的液质联用检测方法，该方法灵敏度高、重现性好，操作简单，适用于同时测定沉积物中残留的多种类药物。其具体的技术方案如下：

一种液质联用检测池塘沉积物中45种兽药的方法，包括以下步骤：

1)样品的提取：取适量沉积物样品，在滤纸上均匀涂抹一层，置于阴凉干燥处，避光晾干然后收集样品并粉碎，准确称取2.00g样品于50mL塑料离心管中，加入0.4gNa₂.EDTA，以及20mL混合提取试剂，旋涡震荡2min，超声波提取20min，4000r/min离心10min，准确量取上清液10mL，加入蒸馏水稀释至50mL，用甲酸调节pH至2.8～3.0后待净化；

2)固相萃取净化：500mg/6mL的HLB固相萃取小柱依次用6mL甲醇、6mL水和6mLNa₂.EDTA溶液活化，将步骤1)所得的50mL待净化液全部以1mL/min的速率上柱，弃流出液，用6mL水淋洗后压干，再用8mL乙腈洗脱，洗脱液于40℃水浴下氮气吹干，用体积比为乙腈：0.1％甲酸水溶液＝10:90混合定容至1mL，经0.22μm滤膜过滤后上机测定；

3)液质联用分析：步骤2)的过滤液经液相色谱-串联质谱仪测定获得待测物的峰面积，将峰面积代入对应的标准曲线分析计算，定量获取沉积物样品中45种兽药的含量。

优选的，步骤1)沉积物样品厚度为0～5cm，每个样品的重量不少于500g。

优选的，所述混合提取试剂是体积比为磷酸盐缓冲液，pH＝3：乙腈＝1:1的混合液。

优选的，步骤3)中45种兽药包括：磺胺类：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲基异噁唑、磺胺多辛、磺胺喹噁啉、磺胺间甲氧嘧啶、甲氧苄啶；氟喹诺酮类：诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、达氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、麻保沙星、奥比沙星；四环素类：多西环素、四环素、土霉素、土霉素；大环内酯类：螺旋霉素、红霉素、克拉霉素、吉他霉素、麦迪霉素、交沙霉素、罗红霉素、替米考星、泰乐菌素；硝基呋喃类：呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因；喹噁林类：喹乙醇、喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹；氯霉素类：氯霉素和氟苯尼考、甲基睾丸酮、林可霉素、沃尼妙林。

优选的，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取35.8g Na₂HPO₄·12H₂O，用980mL蒸馏水溶解，并用盐酸调节pH至3.0，加水定容至1000mL。

优选的，步骤1)中超声波的功率为250W，频率为4kHz。

优选的，步骤2)中Na₂.EDTA溶液的配制方法为：称取0.1g Na₂.EDTA，用水溶解并定容至100mL，用甲酸调节溶液pH至3.0。

优选的，步骤3)中色谱柱：Phenomenex Kinetex C₁₈柱，100mm×2.1mm，1.7μm；柱温：40℃；进样量：10μL；流速：0.3mL/min；流动相：乙腈和0.1％甲酸水溶液B，梯度洗脱程序：0～5min，10％～50％A；5～7.5min，50％～95％A；7.5～9min，95％A；9～9.5min，95％～10％A；9.5～11min，10％A。

优选的，步骤3)中质谱条件为：电喷雾电离；扫描方式：正负离子同时扫描；离子源温度：150℃；毛细管电压：3.0kV；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：750L/h；碰撞气流速：0.15mL/min，锥孔反吹气流量：150L/h；监测方式：多时段-多反应监测。

本发明的有益效果：

(1)本发明检测方法采用乙腈-磷酸盐缓冲液超声波提取，提取液稀释后经HLB固相萃取柱净化，进行池塘沉积物中45种兽药的液质联用检测。操作简便，样品处理后基质干扰小、净化效果强、灵敏度高。

(2)本发明采用超高效液相色谱串联质谱仪，根据各种化合物的极性差别，色谱柱选用柱效较高的粒度为1.7μm的Kinetex C₁₈色谱柱，正负离子同时扫描，一次实验即可实现45种兽药的同时分析，能够满足高通量、高灵敏度的快速检测要求。

附图说明

图1是45种化合物中代表性药物的MRM离子流图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步的说明，这些具体实施案例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明采用的技术方案为：

以下是本发明的实施例

1仪器与试剂的选取：

Acquity UPLC I-Class/Xevo TQS超高效液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪(配备电喷雾离子源及Masslynx数据处理软件，美国Waters公司)；5810型台式离心机(德国Eppendorf公司)；MS3旋涡混合器(德国IKA公司)；N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司)。

磺胺类、氟喹诺酮类等多种兽药标准品，纯度≥95％(Dr.Ehrenstorfer)；WatersOasis HLB固相萃取小柱(500mg/6mL)；沉积物样品：从水产养殖场池塘底部采集，厚度为0-5cm，每个样品不少于500g。

2仪器条件

2.1色谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex C₁₈柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：40℃；进样量：10μL；流速：0.3mL/min；流动相：乙腈(A)和0.1％甲酸水溶液(B)。梯度洗脱程序：0～5min，10％～50％A；5～7.5min，50％～95％A；7.5～9min，95％A；9～9.5min，95％～10％A；9.5～11min，10％A。

2.2质谱条件

离子源：电喷雾电离(ESI)；扫描方式：正负离子同时扫描；离子源温度：150℃；毛细管电压：3.0kV；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：750L/h；碰撞气流速：0.15mL/min，锥孔反吹气流量：150L/h；监测方式：多时段-多反应监测(multiple-period MRM)，离子对及条件如表1所示。

驻留时间对化合物的峰形影响很大。通常情况下，每个峰至少需要采集12个数据点，才能使其具有良好的重现性，否则易因峰形失真，影响峰面积而使定量结果偏差较大。当待测物数量较少时，每个通道的采集方式对检测结果可能影响不大，但本研究同时测定45种药物，同一时间段监测的离子数量较多，为提高定量分析的准确度和精密度，在梯度洗脱的基础上，根据每个目标峰的保留时间，采用分段采集的方式进行MRM扫描，软件自动分配驻留时间，尽可能使每个色谱峰都能采集较多的数据点。

表1 45种兽药的MRM离子对及质谱条件参数

注：^*表示定量离子。

3样品提取与净化

(1)样品的提取：取适量沉积物样品，在滤纸上薄薄涂抹一层，置于阴凉干燥处避光晾干没然后收集样品并粉碎，准确称取2.00g样品(0.01g)于50mL塑料离心管中，加入0.4gNa₂EDTA，以及20mL混合提取试剂[V(磷酸盐缓冲液，pH＝3)：V(乙腈)＝1:1]，旋涡震荡2min，超声波提取20min，4000r/min离心10min，准确量取上清液10mL，加入蒸馏水稀释至50mL，用甲酸调节pH值至2.8～3.0后待净化。

(2)固相萃取净化：HLB固相萃取小柱(500mg/6mL)依次用6mL甲醇、6mL水和6mLNa₂EDTA溶液活化，将步骤(1)所得的50mL待净化液全部以约1mL/min的速率上柱，弃流出液，用6mL水淋洗后压干，再用8mL乙腈洗脱，洗脱液于40℃水浴下氮气吹干，用乙腈-0.1％甲酸水溶液(10:90，V/V)定容至1mL，经0.22μm滤膜过滤后上机测定。

4方法学验证

配制6个浓度水平的标准溶液，按优化的色谱和质谱条件上机测定。以各个药物的色谱峰面积为纵坐标，以其所对应的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。以标准添加法制备样品，按照上述“样品提取与净化”方法处理，以定量离子信噪比(S/N)大于3得到方法的检出限(LOD)。结果显示，沉积物中45种兽药的检出限为0.1～0.3μg·kg^-1，线性方程相关系数整体大于0.99，加标回收率为66.3％～109％，相对标准偏差<12.7％。

表1 45种兽药的线性方程和检出限

5实际样品测定

本发明实施例从广东省水产养殖场采集池塘沉积物12份，用本发明的方法对样品进行前处理和上机测定。结果表明，2份沉积物样品中中检出了磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲氧苄啶，含量分别为0.24μg·kg^-1和0.78μg·kg^-1。

Claims

1.一种液质联用检测池塘沉积物中45种兽药的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)样品的提取：取适量沉积物样品，在滤纸上均匀涂抹一层，置于阴凉干燥处，避光晾干然后收集样品并粉碎，准确称取2.00g样品于50mL塑料离心管中，加入0.4g Na₂.EDTA，以及20mL混合提取试剂，旋涡震荡2min，超声波提取20min，4000r/min离心10min，准确量取上清液10mL，加入蒸馏水稀释至50mL，用甲酸调节pH至2.8～3.0后待净化；

2)固相萃取净化：500mg/6mL的HLB固相萃取小柱依次用6mL甲醇、6mL水和6mL Na₂.EDTA溶液活化，将步骤1)所得的50mL待净化液全部以1mL/min的速率上柱，弃流出液，用6mL水淋洗后压干，再用8mL乙腈洗脱，洗脱液于40℃水浴下氮气吹干，用体积比为乙腈：0.1％甲酸水溶液＝10:90混合定容至1mL，经0.22μm滤膜过滤后上机测定；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)沉积物样品厚度为0～5cm，每个样品的重量不少于500g。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述混合提取试剂是体积比为磷酸盐缓冲液，pH＝3：乙腈＝1:1的混合液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中45种兽药包括：磺胺类：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲基异噁唑、磺胺多辛、磺胺喹噁啉、磺胺间甲氧嘧啶、甲氧苄啶；氟喹诺酮类：诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、达氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、麻保沙星、奥比沙星；四环素类：多西环素、四环素、土霉素、土霉素；大环内酯类：螺旋霉素、红霉素、克拉霉素、吉他霉素、麦迪霉素、交沙霉素、罗红霉素、替米考星、泰乐菌素；硝基呋喃类：呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因；喹噁林类：喹乙醇、喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹；氯霉素类：氯霉素和氟苯尼考、甲基睾丸酮、林可霉素、沃尼妙林。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取35.8g Na₂HPO₄·12H₂O，用980mL蒸馏水溶解，并用盐酸调节pH至3.0，加水定容至1000mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中超声波的功率为250W，频率为4kHz。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)中Na₂.EDTA溶液的配制方法为：称取0.1g Na₂.EDTA，用水溶解并定容至100mL，用甲酸调节溶液pH至3.0。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中色谱柱：Phenomenex Kinetex C₁₈柱，100mm×2.1mm，1.7μm；柱温：40℃；进样量：10μL；流速：0.3mL/min；流动相：乙腈和0.1％甲酸水溶液B，梯度洗脱程序：0～5min，10％～50％A；5～7.5min，50％～95％A；7.5～9min，95％A；9～9.5min，95％～10％A；9.5～11min，10％A。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中质谱条件为：电喷雾电离；扫描方式：正负离子同时扫描；离子源温度：150℃；毛细管电压：3.0kV；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：750L/h；碰撞气流速：0.15mL/min，锥孔反吹气流量：150L/h；监测方式：多时段-多反应监测。