CN111707772B - 一种同步高效检测污泥中多类抗生素残留量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明基于高效液相色谱串联质谱检测技术并结合超声萃取及固相萃取前处理方法，提供了一种同时检测污泥中多类抗生素的分析方法，属于痕量环境污染物的检测技术领域。本发明解决了现有检测方法中部分抗生素回收率偏低、检测成本高、检测所需样品量大、检出限较高等问题。本发明的抗生素回收率为75.3～130.1％、方法检出限为1～3μg/kg；在样品检测时，仅需0.1g干污泥样品；采用旋转蒸发的方式降低超声萃取液中有机溶剂的含量，在固相萃取前，将超声萃取液定容至200mL即可，极大地减少了固相萃取过程中萃取液的过柱时间；本发明仅使用HLB小柱用于固相萃取，在提升待测抗生素回收率的同时，减少了检测成本。

Description

一种同步高效检测污泥中多类抗生素残留量的方法
技术领域
本发明涉及一种同步高效检测污泥中多类抗生素残留量的方法，具体涉及一种利用超声萃取-固相萃取-超高效液相色谱串联质谱技术同步检测污泥中多种抗生素残留量的方法，属于痕量环境污染物检测技术。
背景技术
抗生素是由微生物或高等动植物新陈代谢所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，常被用于人或动物体细菌感染性疾病的预防和治疗。然而，多数抗生素药物在人或动物体不能被充分利用，约40％～90％的抗生素以原物或代谢物的形式随排泄物排出并随之进入环境中。抗生素在环境中的残留、累积不仅会对敏感性生物产生急性或慢性的毒害作用，同样会诱导产生抗药菌，从而对生态系统及人类健康构成潜在威胁。
污水处理厂作为多种污染物消除的主要场所，是水体中抗生素进入环境的最后一道防线。然而在污水处理过程中，抗生素不可避免地会被活性污泥所吸附。因不同抗生素生理生化特性的差异，使得其在污泥中出现不同程度的残留。而剩余污泥脱水填埋或堆肥处理后施于农田后，其内残留的抗生素易迁移至土壤或地下水中，造成二次污染。为防止此类现象的发生，在对污泥进行有效的处理处置操作前，首先需充分了解其内抗生素的残留水平。因此，建立一种同时测定污泥中多种抗生素药物残留量的分析方法十分必要。
目前，国内外已有用于污泥中抗生素残留量检测方法的报道，但这些方法均存在着一定的局限性。部分公开方法中某些待测抗生素的回收率偏低，无法满足抗生素检测的要求。例如中国专利公开号CN106093220A公开的检测方法中，诺氟沙星和氧氟沙星的回收率仅为56.13％及32.98％；CN109142572A公开的检测方法中，磺胺喹恶啉、氧四环素、阿奇霉素、头孢噻肟、林可霉素的回收率仅分别为47.2％、36.5％、54.6％、16.4％及50.6％；CN108318613A公开的检测方法中，强力霉素、四环素、氧氟沙星及诺氟沙星的回收率仅在53.0～85.9％之间。多数公开方法如中国专利公开号CN106093220A、CN102998405A、CN108318613A及CN106468691B所公开的检测方法，测定时所需污泥样品量较多，在1～2g之间。污泥样品在经过超声萃取后，为防止在后续固相萃取过程中，超声萃取液中有机溶剂含量过高导致的抗生素穿脱现象，需采取一定的措施以确保萃取液中有机溶剂的含量低于5％。多数方法如CN106093220A、CN108318613A及CN106468691B等直接采用稀释的方式降低有机溶剂的含量，使得萃取液体积增至400～500mL，而大容量的过柱体积无疑会延长固相萃取过程中的样品过柱时间。部分方法，如CN106093220A及CN106468691B公布的测定方法，在固相萃取过程中，在使用HLB小柱的基础上，为预先去除提取溶液中的部分杂质，额外增加了SAX小柱并将其与HLB小柱串联使用，增加了检测成本。除此以外，中国专利公开号CN102998405A公开的一种测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法，采用液相色谱仪作为样品中抗生素的检测器，受仪器自身灵敏度及抗干扰能力的限制，使得该方法检出限偏高，在10～60μg/kg之间；所需样品检测时间较长，共需35min才能完成一个样品的检测。因此，针对现有检测方法的不足，提供一种同步高效检测污泥中多类抗生素残留量的方法是十分必要的。
发明内容
本发明针对现有污泥中抗生素检测方法存在的问题，提供一种同步高效检测污泥中多类抗生素残留量的方法。
本发明的技术方案：
一种同步高效检测污泥中多类抗生素残留量的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一，样品前处理：将污泥样品冷冻干燥后，研磨过筛；称取一定量的污泥样品，向其中先后加入有机提取剂及无机提取剂，混合均匀后，进行超声萃取；萃取完成后，离心并收集上清液；随后，将上清液进行旋转蒸发处理，收集剩余液体和圆底烧瓶冲洗液，在使用超纯水定容后，用6mol/L的盐酸溶液调节pH至2.0；
步骤二，固相萃取：使用规格为6cc/200mg的Oasis HLB小柱对步骤一处理后所得萃取液进行固相萃取，以实现其富集净化；
步骤三，使用超高液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪进行步骤二处理后所得样品的检测；
步骤四，多类抗生素的定性和定量分析：通过对照样品谱图与标准物质谱图的保留时间和离子丰度比，对样品中的抗生素进行定性分析；随后采用外标法进行定量分析，获得样品中各类抗生素的含量。
进一步限定，所述的步骤一的具体操作过程为：
(1)冷冻干燥：将污泥样品在真空条件下冷冻干燥24小时后，研磨过40目筛，获得干污泥颗粒；
(2)超声萃取：称取0.1g干污泥颗粒，置于50mL离心管中并加入15mL有机提取剂和15mL无机提取剂，涡旋混匀5min，置于超声波浴中萃取20min，然后在6000rpm条件下离心5min，收集上清液，共重复三次超声波浴萃取，合并上清液；
(3)旋转蒸发：将(2)收集的上清液置于250mL圆底烧瓶中，在50℃、100rpm条件下旋转蒸发13min，收集旋转蒸发后的剩余溶液，并使用适量超纯水重复冲洗圆底烧瓶三次，合并剩余溶液和冲洗液，使用超纯水定容至200mL，然后使用6mol/L的盐酸溶液调节pH至2.0。
更进一步限定，有机提取剂为体积比为1:1:2的甲醇、乙腈和乙酸乙酯的混合液。
更进一步限定，无机提取剂为pH为3.0的Na2EDTA-NaH2PO4缓冲溶液，其中Na2EDTA的含量为0.009mol/L，NaH2PO4的含量为0.2mol/L。
进一步限定，步骤二的具体操作过程为：
Step 1，使用5mL甲醇和10mL超纯水对HLB小柱进行活化，活化次数为3次；
Step 2，将经过前处理后所得萃取液在重力流的作用下通过HLB小柱；
Step 3，溶液完成过柱后，依次使用5mL体积浓度为5％的甲醇水溶液和5mL超纯水淋洗HLB小柱，并将HLB小柱在负压条件下真空干燥处理30min；
Step 4，使用10mL洗脱液缓慢洗脱HLB小柱，洗脱液收集至10mL玻璃离心管中，并于45℃氮气作用下吹脱至近干，获得残渣；
Step 5，加入50％的甲醇水溶液复溶残渣，并将样品补足至1mL，漩涡混匀5min后，通过0.22μm有机滤膜，收集滤液置于2mL棕色色谱瓶中，在-20℃条件下避光保存，待上机检测。
更进一步限定，Step 2中经过前处理后所得萃取液在重力流的作用下通过HLB小柱，过柱流速为1mL/min。
更进一步限定，Step 4中洗脱液是体积比为4:3:3的甲醇、乙腈和乙酸乙酯的混合液。
进一步限定，步骤三的液相色谱检测条件为：BEH C18色谱柱，2.1mm×50mm，柱温25℃，流速0.25mL/min，进样体积10μL，流动相A为乙腈，B为体积分数为0.2％的甲酸水溶液；梯度洗脱条件为：0～7min，10％～20％A；7～11min，20％～40％A；11～12min，40％～95％A，保持2min；14～14.5min，95％～10％A；保持2.5min；各个阶段洗脱剂中流动相A与流动相B合计100％；
步骤三的质谱检测条件为：采用电喷雾离子源，以多反应离子监测模式，在正离子模式下扫描离子对；离子源温度150℃；毛细管电压4000V；锥孔气流量50L/h；干燥气采用氮气，干燥气温度350℃，干燥气流速550L/h；碰撞气为氩气。
进一步限定，抗生素种类为四环素类、磺胺类和氟喹诺酮类抗生素；所述的四环素类抗生素包括金霉素、四环素、土霉素和强力霉素；所述的磺胺类抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺甲噁唑；所述的氟喹诺酮类抗生素包括诺氟沙星和氧氟沙星。
进一步限定，步骤四的外标法的操作过程为：通过检测系列浓度的抗生素标准溶液，以浓度为横坐标，抗生素定量离子对的峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，将样品谱图中各抗生素的峰面积代入标准工作曲线，进而获得样品中抗生素的含量。
本发明具有以下有益效果：本发明利用高效液相色谱串联质谱检测技术并结合超声萃取及固相萃取前处理方法，建立一种不使用SAX小柱且适用于污泥中多类抗生素的痕量定量分析方法。该方法具有如下优点：
(1)本发明提供的方法抗生素回收率高(75.3％～130.1％)、方法检出限低(1～3μg/kg)，待测抗生素在9min内可全部出峰，快速高效；
(2)本发明采用旋转蒸发的方式降低超声萃取液中有机溶剂的含量，因此在固相萃取前，超声萃取液仅需定容至200mL即可，极大地减少了固相萃取过程中超声萃取液的过柱时间；
(3)本发明检测时所需污泥样品量少，仅需0.1g干污泥即可实现其内抗生素的有效测定；
(4)现有的部分检测技术在测定污泥中的抗生素含量时，在固相萃取过程中会使用SAX-HLB串联柱，SAX小柱主要用于超声萃取液内杂质的去除。但在本发明方法的建立过程中，发现SAX小柱的使用会导致部分待测抗生素的大量损失。因此本发明方法仅使用HLB小柱用于固相萃取，在提升待测抗生素回收率的同时，减少了检测成本。
附图说明
图1为超声萃取时间对目标抗生素回收率的影响；
图2为超声萃取无机提取剂pH值分别在酸性(3.0)、中性(7.0)及碱性(9.0)条件下，目标抗生素的回收率；
图3为超声萃取有机提取剂分别为体积比为1:1、1:2、2:1的甲醇及乙腈的混合液，以及体积比为4:3:3的甲醇、乙腈及乙酸乙酯的混合液时，目标抗生素的回收率；
图4为超声萃取无机提取剂中Na2EDTA含量对目标抗生素回收率的影响；
图5为超声萃取提取剂总量对目标抗生素回收率的影响；
图6为超声萃取有机提取剂中甲醇:乙腈:乙酸乙酯的比例分别为4:3:3、1:2:1及1:1:2时，目标抗生素的回收率；
图7为超声萃取有机提取剂中甲醇:乙腈:乙酸乙酯的比例分别为4:3:3及1:1:2，以及在固相萃取过程中使用或不使用SAX小柱的情况下，目标抗生素的回收率；
图8为在固相萃取过程中不使用SAX小柱，且超声萃取无机提取剂pH值分别为2.0、3.0及4.0时，目标抗生素的回收率；
图9为在固相萃取过程中不使用SAX小柱，且超声萃取有机提取剂中甲醇:乙腈:乙酸乙酯的比例分别为1:1:2及1:1:3时，目标抗生素的回收率。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1：
利用下述方法对城市生活污水处理厂(WWTP)二沉池污泥、序批式活性污泥预处理反应器(SBR)及升流式微氧活性污泥反应器(UMSR)内污泥中的抗生素的残留量进行检测。
检测方法：
(1)冷冻干燥
将污泥样品置于真空状态下冷冻干燥24小时，随后使用研钵和研杵均质化，过40目筛以获得直径小于0.425mm的颗粒。随后取0.1g过筛干污泥置于50mL离心管中。
(2)超声萃取
向离心管中依次加入15mL有机提取剂(体积比为1:1:2的甲醇、乙腈及乙酸乙酯的混合液)以及15mL无机提取剂(pH为3.0的Na2EDTA-NaH2PO4缓冲溶液，其中Na2EDTA的含量为0.009mol/L，NaH2PO4的含量为0.2mol/L)，涡旋混匀5min后，置于超声波浴中萃取20min，随后将离心管以6000rpm离心5min，收集上清液，备用，并再次重复两次上述萃取过程。
(3)旋转蒸发
合并三次超声萃取所得上清液，置于250ml圆底烧瓶中，并于100rpm、50℃条件下旋转蒸发13min。随后，收集旋转蒸发后的剩余溶液，并用适量超纯水重复冲洗圆底烧瓶三次。此后，合并收集所得剩余溶液及冲洗液，并用超纯水定容至200mL后，用6mol/L的盐酸溶液将其pH值调至2.0。
(4)固相萃取
用规格为6cc/200mg的Oasis HLB小柱进行上述过程所得超声萃取液的富集净化。HLB小柱在使用前，需依次用5mL甲醇和10mL超纯水进行活化，并反复活化3次。随后将超声萃取液在重力流的作用下通过HLB小柱，过柱流速控制在1mL/min左右。过柱完成后，使用5mL 5％(v/v)的甲醇水溶液及5mL超纯水淋洗HLB小柱，并将HLB柱在负压条件下抽真空干燥30min。之后，用10mL体积比为4:3:3的甲醇、乙腈及乙酸乙酯的混合液作为洗脱液缓慢洗脱目标物，洗脱液收集至10mL玻璃离心管中，并于45℃氮气作用下吹脱至近干。随后，加入50％的甲醇水溶液复溶残渣，并将样品补足至1mL。将样品漩涡混匀5min后，通过0.22μm有机滤膜，并收集滤液至2mL棕色色谱瓶中，于-20℃避光保存至上机检测。
(5)UPLC-MS/MS分析
用超高液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪进行待测样品的定性定量分析。其中，液相色谱的分析条件为：选用BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm,1.7μm,Waters,USA)；进样体积10μL；柱温25℃。流动相A为乙腈，B为0.2％(v/v)的甲酸水溶液，流速0.25mL/min。梯度洗脱程序：0～7min，10％～20％A；7～11min，20％～40％A；11～12min，40％～95％A，保持2min；14～14.5min，95％～10％A；保持2.5min；各个阶段洗脱剂中流动相A与流动相B合计100％。质谱的分析条件为：采用电喷雾离子源(ESI)，以多反应离子监测(MRM)模式，在正离子模式下扫描离子对；离子源温度150℃；毛细管电压4000V；锥孔气流量50L/h；干燥气采用氮气，干燥气温度350℃，干燥气流速550L/h；碰撞气采用氩气。仪器测定时，目标抗生素的保留时间、母离子、定性子离子、定量子离子、锥孔电压、碰撞能及电离模式等参数条件如表1所示。
表1目标抗生素相关的UPLC-MS/MS参数
Figure BDA0002526286190000061
注：带*为定量离子
通过对照样品谱图与标准物质谱图的保留时间和离子丰度比，对样品中的抗生素进行定性。随后，采用外标法进行抗生素的定量分析，即主要通过检测系列浓度的抗生素标准溶液，以浓度为横坐标，定量离子对的峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，将样品谱图中各抗生素的峰面积代入标准工作曲线，进而获得样品中抗生素的含量。
上述过程所使用仪器、试剂和溶液的配制：
仪器：Aquity超高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用仪(Xevo TQ MS，美国Waters公司)、BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm，美国Waters公司)、RE-52型旋转蒸发仪(上海光学仪器厂)、TG16-WS型台式高速离心机(湖南湘仪试验仪器有限公司)、Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)、JC-220A-12型氮吹仪(青岛聚创环保设备有限公司)、固相萃取小柱(Oasis HLB，6cc/200mg，美国Waters公司)、12孔固相萃取装置(美国Supelco公司)、E-1010型冷冻干燥机(日本HITACHI公司)、KQ-500DE型超声水浴锅(昆山市超声仪器有限公司)、Vortex-Genie2涡旋振荡器(美国Scientific Industries公司)。
试剂：磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲嘧啶(SMD)、磺胺甲噁唑(SMX)、磺胺甲基嘧啶(SMT)、诺氟沙星(NOR)及土霉素(OTC)的标准品购自阿拉丁公司；强力霉素(DXC)、盐酸四环素(TC)、盐酸金霉素(CTC)及氧氟沙星(OFC)的标准品购自sigma公司。甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸均为HPLC级，购自Merck(Darmstadt,Germany)公司。Na2EDTA、氢氧化钠、盐酸、磷酸二氢钠均为分析纯，实验所用超纯水(电导率18.2MΩ)由Milli-Q系统制取。
标准储存溶液：精确称取抗生素标准品0.010g，将标准品用少量0.1mol/L的氢氧化钠溶液溶解后，用甲醇定容至10mL，配制成1000mg/L的标准储备液，于-20℃避光保存。
标准混合溶液：精密量取10种抗生素的标准储备溶液各500μL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容，配制成10mg/L的混合标准中间溶液。混合标准工作液现用现配，用50％甲醇逐级稀释混合标准中间液而成。
WWTP二沉池污泥、SBR及UMSR内活性污泥中抗生素残留量的测定结果如表2所示。由表2可知，不同的污泥中抗生素的残留量差别较大，以金霉素为例，其在SBR污泥中的残留量最大，残留量可达16533.9μg/kg；UMSR的污泥中残留量次之，为8434.8μg/kg；而在WWTP二沉池污泥中的残留量最少，仅为232.0μg/kg。此外，4种磺胺类抗生素的残留量在检测的三种污泥中均明显低于其他6种抗生素，这可能与磺胺类抗生素自身的物理生化特性有关，使得其不易被污泥吸附。
表2污泥中10种抗生素的残留量
Figure BDA0002526286190000081
实施例2：
本实施例为样品前处理条件的选取过程。
(1)超声时间的选取
本实施例与实施例1不同处为，选用的固相萃取条件为：以SAX-HLB串联柱作为固相萃取柱，萃取液过柱流速为1mL/min；在提取液过柱完成后，弃去SAX柱，对HLB小柱进行淋洗、干燥及洗脱；淋洗液选用5mL 5％(v/v)的甲醇水溶液及5mL超纯水；HLB小柱在负压条件下抽真空干燥的时间为30min；洗脱液选用体积比为4:3:3的甲醇、乙腈及乙酸乙酯的混合液；洗脱液氮吹后的残渣复溶溶剂采用50％的甲醇水溶液。选用的超声萃取的条件为：提取剂总投加量30mL，有机提取剂与无机投加量投加比例为1:1；有机提取剂选用体积比为1:1的甲醇与乙腈的混合液；无机提取剂选用pH为3.0的Na2EDTA-NaH2PO4缓冲溶液，其中Na2EDTA的含量为0.001mol/L，NaH2PO4的含量为0.2mol/L。
对比超声萃取时间分别为20min、30min及40min时，目标抗生素的回收率，进行污泥加标回收实验，所得结果如图1所示。由图1可知，随着超声时间的延长，抗生素的回收率基本呈现出逐步下降的趋势。因此，选择20min作为超声萃取的时间。
(2)无机提取剂pH值的初步选取
将超声时间设置为20min，其他条件与(1)相同时，对比无机提取剂pH分别在酸性、中性及碱性条件下，即pH分别为3.0、7.0及9.0时，目标抗生素的回收率，结果如图2所示。结果表明，金霉素、强力霉素、磺胺甲基嘧啶、氧氟沙星及诺氟沙星在酸性条件下有更高的回收率；磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶在中性条件下有更高的回收率；土霉素在碱性条件下的回收率更高；而无机提取剂的pH值对四环素及磺胺嘧啶的回收率无明显影响。由于在无机提取剂pH值为酸性时，有较多的抗生素可获得更佳的回收效果。因此，确定无机提取剂的pH值为3.0。
(3)有机提取剂中有机溶剂类型及比例的选取
在超声时间为20min、无机提取剂pH值为3.0，其他条件与(1)相同时，对比有机提取剂分别为体积比为1:1、1:2、2:1的甲醇及乙腈的混合液，以及体积比为4:3:3的甲醇、乙腈及乙酸乙酯的混合液时，目标抗生素的回收率，结果如图3所示。由图可知，在甲醇及乙腈的混合液作为有机提取剂的情况下，当甲醇及乙腈所占比重一致时，目标抗生素的回收率更高。而在有机提取剂中加入乙酸乙酯后，虽然与甲醇及乙腈的混合液相比，磺胺类抗生素的回收率略有下降，但四环素、土霉素、氧氟沙星及诺氟沙星的回收率得到极为显著的提升。因此，选用体积比为4:3:3的甲醇、乙腈及乙酸乙酯的混合液作为超声萃取时的有机提取剂。
(4)无机提取剂Na2EDTA含量的选取
Na2EDTA作为一种络合剂，可与污泥内的金属阳离子率先结合，从而防止目标抗生素与金属离子的结合，影响萃取效率。为此，在超声时间为20min、无机提取剂pH值为3.0、体积比为4:3:3的甲醇、乙腈及乙酸乙酯混合液作为有机提取剂，其他条件与(1)相同时，对比Na2EDTA在无机提取剂中的含量分别为0.001、0.009、0.1mol/L时，目标抗生素的回收率。由图4可知，无机提取剂中Na2EDTA的含量对目标抗生素回收率的影响不大，因此选择中间值0.009mol/L作为无机提取剂中Na2EDTA的含量。
(5)有机提取剂和无机提取剂总量的选取
在超声时间为20min、无机提取剂pH值为3.0、Na2EDTA含量为0.009mol/L、有机提取剂为甲醇、乙腈及乙酸乙酯混合液(4:3:3，v/v/v)，其他条件与(1)相同时，对比提取剂总量分别为20mL及30mL时，目标抗生素的回收率，结果如图5所示。由图可知，除氧氟沙星及诺氟沙星外，其他抗生素在提取剂总量为30mL的条件下可以得到更好的回收效果。因此，选择30mL作为有机及无机提取剂的总投加量。
(6)有机提取剂中有机溶剂比例的二次选取
当甲醇、乙腈及乙酸乙酯混合液作为有机提取剂时，为对比甲醇、乙腈及乙酸乙酯的体积比分别为4:3:3、1:2:1及1:1:2时，目标抗生素的回收率，在超声时间为20min、无机提取剂pH值为3.0、Na2EDTA含量为0.009mol/L、提取剂总量为30mL，其他条件与(1)相同时，进行抗生素加标回收实验，结果如图6所示。由图可知，甲醇、乙腈及乙酸乙酯的体积比为4:3:3或1:1:2时，均可得到较佳的抗生素回收效果，但整体而言，抗生素回收率仍无法满足抗生素检测的要求。
(7)SAX小柱选用与否的抉择
在超声时间为20min、无机提取剂pH值为3.0、Na2EDTA含量为0.009mol/L、提取剂总量为30mL，甲醇、乙腈及乙酸乙酯混合液作为有机提取剂，其他条件与(1)相同时，对比使用和不使用SAX柱的两种情况下，有机提取剂中甲醇、乙腈及乙酸乙酯的体积比分别为4:3:3或1:1:2时，目标抗生素的加标回收率，实验结果如图7所示。由图可知，无论有机提取剂中不同有机溶剂所占比重如何，在固相萃取过程中未使用SAX小柱的情况下，强力霉素、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲基嘧啶以及磺胺二甲嘧啶的回收率均显著高于使用SAX小柱的情况。这说明这些抗生素在固相萃取的过程中会被SAX小柱吸附，导致抗生素的大量损失。此外，在未使用SAX小柱的情况下，有机提取剂中甲醇、乙腈及乙酸乙酯的体积比为1:1:2时，目标抗生素的回收率明显优于体积比为4:3:3时的情况。因此，选用体积比为1:1:2的甲醇、乙腈及乙酸乙酯的混合液作为有机提取剂。
(8)无机提取剂pH值的二次选取
在超声时间为20min、无机提取剂Na2EDTA含量为0.009mol/L、提取剂总量为30mL、甲醇、乙腈及乙酸乙酯混合液(1:1:2，v/v/v)作为有机提取剂、HLB小柱作为固相萃取柱，其他条件与(1)相同时，进一步对比无机提取剂pH值分别为2.0、3.0及4.0时，目标抗生素的回收率。所得结果如图8所示，由图可知，除磺胺甲基嘧啶外，其余抗生素均在无机提取剂pH值为3.0时取得最佳的回收效果。因此，最终确定无机提取剂的最佳pH值为3.0。
(9)有机提取剂中有机溶剂比例的三次选取
在超声时间为20min、无机提取剂pH值为3.0、无机提取剂Na2EDTA含量为0.009mol/L、提取剂总量为30mL、甲醇、乙腈及乙酸乙酯的混合液作为有机提取剂、HLB小柱作为固相萃取柱，其他条件与(1)相同时，进一步对比再次增加有机提取剂中乙酸乙酯的比重后，目标抗生素的回收效果。即对比甲醇、乙腈及乙酸乙酯的体积比分别为1:1:2及1:1:3时，目标抗生素的回收率，结果如图9所示。由图可知，除磺胺甲基嘧啶外，有机提取剂中乙酸乙酯比重的再次增加并不会有效提升目标抗生素的回收率，反而会导致抗生素回收率的降低。因此，最终确定的有机提取剂为体积比为1:1:2的甲醇、乙腈及乙酸乙酯的混合液。
实施例3：
本实施例为抗生素的线性关系和方法检出限。
抗生素采用外标法进行定量，分别配制浓度为1、5、10、20、50、100、200、500、1000μg/L的混合抗生素标准工作液，并依次进样分析。以物质浓度(x)为横坐标，目标分析物定量离子对应的峰面积(y)为纵坐标，建立标准曲线。此外，以三倍信噪比对应的样品浓度为目标分析物的检出限(LOD)，十倍信噪比对应的样品浓度为目标分析物的定量限(LOQ)。10种目标抗生素的工作曲线回归方程、线性范围、相关系数(R2)、检出限和定量限，如表3所示。
表3目标抗生素的线性方程、回归系数、检出限和定量限
Figure BDA0002526286190000111
实施例4：
本实施例为本发明方法的准确度和精密度表征。
采用本发明方法测定10种抗生素的加标回收率，当加标浓度为10mg/kg时，目标抗生素的回收率在75.3％～130.1％之间，且相对标准偏差在0.29％～5.37％的范围内，符合精密度要求，具体结果如表4所示。
表4目标抗生素的回收率与相对标准偏差
Figure BDA0002526286190000112

Claims (5)

1.一种同步高效检测污泥中多类抗生素残留量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一，样品前处理：将污泥样品冷冻干燥后，研磨过筛；称取一定量的污泥样品，向其中先后加入有机提取剂及无机提取剂，混合均匀后，进行超声萃取；萃取完成后，离心并收集上清液；随后，将上清液进行旋转蒸发处理，收集剩余液体和圆底烧瓶冲洗液，在使用超纯水定容后，用6 mol/L的盐酸溶液调节pH至2.0；
所述的有机提取剂为体积比为1:1:2的甲醇、乙腈和乙酸乙酯的混合液；
所述的无机提取剂为pH为3.0的Na2EDTA-NaH2PO4缓冲溶液，其中Na2EDTA 的含量为0.009 mol/L，NaH2PO4的含量为0.2 mol/L；步骤二，固相萃取：使用规格为6 cc/200 mg的Oasis HLB小柱对步骤一处理后所得萃取液进行固相萃取，以实现其富集净化；
所述的步骤二的具体操作过程为：
Step 1，使用5 mL甲醇和10 mL超纯水对HLB小柱进行活化，活化次数为3次；
Step 2，将经过前处理后所得萃取液在重力流的作用下通过HLB小柱；
Step 3，溶液完成过柱后，依次使用5 mL体积浓度为5%的甲醇水溶液和5 mL超纯水淋洗HLB小柱，并将HLB小柱在负压条件下真空干燥处理30 min；
Step 4，使用10 mL洗脱液缓慢洗脱HLB小柱，洗脱液收集至10 mL玻璃离心管中，并于45℃氮气作用下吹脱至近干，获得残渣；
Step 5，加入50%的甲醇水溶液复溶残渣，并将样品补足至1 mL，漩涡混匀5 min后，通过0.22 μm有机滤膜，收集滤液置于2 mL棕色色谱瓶中，在-20℃条件下避光保存，待上机检测；
所述的Step 4中洗脱液是体积比为4:3:3的甲醇、乙腈和乙酸乙酯的混合液；
步骤三，使用超高液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪进行步骤二处理后所得样品的检测；
步骤四，多类抗生素的定性和定量分析：通过对照样品谱图与标准物质谱图的保留时间和离子丰度比，对样品中的抗生素进行定性分析；随后采用外标法进行定量分析，获得样品中各类抗生素的含量；
所述的抗生素种类为四环素类、磺胺类和氟喹诺酮类抗生素；所述的四环素类抗生素包括金霉素、四环素、土霉素和强力霉素；所述的磺胺类抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺甲噁唑；所述的氟喹诺酮类抗生素包括诺氟沙星和氧氟沙星。
2.根据权利要求1所述的一种同步高效检测污泥中多类抗生素残留量的方法，其特征在于，所述的步骤一的具体操作过程为：
（1）冷冻干燥：将污泥样品在真空条件下冷冻干燥24小时后，研磨过40目筛，获得干污泥颗粒；
（2）超声萃取：称取0.1 g干污泥颗粒，置于50 mL离心管中并加入15 mL有机提取剂和15 mL无机提取剂，涡旋混匀5 min，置于超声波浴中萃取20 min，然后在6000 rpm条件下离心5min，收集上清液，共重复三次超声波浴萃取，合并上清液；
（3）旋转蒸发：将（2）收集的上清液置于250 mL圆底烧瓶中，在50℃、100 rpm条件下旋转蒸发13 min，收集旋转蒸发后的剩余溶液，并使用适量超纯水重复冲洗圆底烧瓶三次，合并剩余溶液和冲洗液，使用超纯水定容至200 mL，然后使用6 mol/L的盐酸溶液调节pH至2.0。
3.根据权利要求1所述的一种同步高效检测污泥中多类抗生素残留量的方法，其特征在于，所述的Step 2中经过前处理后所得萃取液在重力流的作用下通过HLB小柱，过柱流速为1 mL/min。
4.根据权利要求1所述的一种同步高效检测污泥中多类抗生素残留量的方法，其特征在于，所述的步骤三的液相色谱检测条件为：BEH C18色谱柱，2.1 mm×50 mm，柱温25℃，流速0.25 mL/min，进样体积10 μL，流动相A为乙腈，B为体积分数为0.2%的甲酸水溶液；梯度洗脱条件为：0~7 min，10%~20% A；7~11 min，20%~40% A；11~12 min，40%~95% A，保持2min；14~14.5 min，95%~10% A；保持2.5 min；各个阶段洗脱剂中流动相A与流动相B合计100%；
所述的步骤三的质谱检测条件为：采用电喷雾离子源，以多反应离子监测模式，在正离子模式下扫描离子对；离子源温度150℃；毛细管电压4000 V；锥孔气流量50 L/h；干燥气采用氮气，干燥气温度350℃，干燥气流速550 L/h；碰撞气为氩气。
5.根据权利要求1所述的一种同步高效检测污泥中多类抗生素残留量的方法，其特征在于，所述的步骤四的外标法的操作过程为：通过检测系列浓度的抗生素标准溶液，以浓度为横坐标，抗生素定量离子对的峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，将样品谱图中各抗生素的峰面积代入标准工作曲线，进而获得样品中抗生素的含量。
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