CN111751482B - 一种同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速高效同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法，属于痕量环境污染物的检测技术领域。本发明解决了现有检测方法中抗生素检测种类单一、检测水样量大、检出限较高、抗干扰能力差等问题。本发明基于固相萃取‑超高效液相色谱串联质谱技术，通过色谱、质谱、固相萃取及前处理条件的选取，提供了一种同时检测养猪废水中多类抗生素的分析方法。该方法只需要40mL水样，极大地减少了前处理时间；在低、中、高三个水平的加标浓度下，10种抗生素的回收率均在74.1％～118.2％之间，且相对标准偏差在0.14％～11.74％的范围内。此外，本方法检出限低、抗干扰能力强，检测下限达到2.5～10ng/L。

Description

一种同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法

技术领域

本发明涉及一种同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法，具体涉及一种利用固相萃取-超高效液相色谱串联质谱技术同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法，属于痕量环境污染物检测技术。

背景技术

本着预防、治疗及促进动物生长的目的，每年有大量的抗生素被用于畜禽养殖业。其中，四环素类、磺胺类及氟喹诺酮类抗生素是养猪业中使用最为广泛的抗生素类别。然而，绝大多数兽药抗生素被摄入动物体内后仅有少量被机体吸收，大部分药物残留以原型随粪便和尿液排出体外，例如：四环素类约有69％～86％、磺胺类约80％～90％、氟喹诺酮类约30％～83.7％被排出体外。这使得养猪废水成为环境水体中抗生素的重要来源之一。虽然抗生素的半衰期不长，但由于其频繁使用并持续输入环境，导致环境中抗生素的“假持久性”，对环境中的微生物及动植物产生直接或间接的毒害作用，并且诱导抗生素抗性细菌及抗性基因的出现，最终威胁人类健康。因此，充分了解养猪废水中的抗生素残留、建立养猪废水中抗生素的检测分析方法十分必要的。

目前国内外已报道的养殖废水或污水中抗生素残留的检测方法中，部分方法仅适用于单一类别抗生素的检测，如中国专利公开号CN108760956A公开的方法仅适用于养殖废水中氟喹诺酮类抗生素的检测；中国专利公开号CN111157665A公开的方法仅适用于水体中磺胺类抗生素的检测。而对于可实现废水中多种抗生素同时测定的检测方法，部分方法存在着方法检出限偏高的问题，如中国专利公开号CN105929047A公开的可同时测定畜禽养殖废水中磺胺类、四环素类、大环内酯类抗生素的方法，采用高效液相色谱仪(HPLC)作为抗生素的检测装置，受HPLC自身灵敏度的限制，方法检出限偏高；部分方法所需水样量大，如中国专利公开号CN106093220A公开的一种污水和污泥中12种典型抗生素的同步检测方法，需要的检测水样量在100～500mL之间，使得水样所需的预处理时间长、工作量大，此外，高水样量对应着高富集倍数，在富集过程中抗生素不仅易折损，也会导致更多的非目标污染物截留在固相萃取小柱中，极大地影响抗生素检测的准确性。

针对现有的检测方法存在局限性，对抗生素检测种类单一、检测水样量大、检出限较高、抗干扰能力差等问题，提供一种多类抗生素残留量的方法是十分必要的。

发明内容

本发明为了解决现有检测方法中抗生素检测种类单一、检测水样量大、检出限较高、抗干扰能力差等问题，提供一种同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法。

本发明的技术方案：

一种同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一，样品前处理：采集养猪废水水样，离心后取上清液通过微孔滤膜过滤，随后准确吸取40mL滤液，并使用超纯水稀释至200mL，加入0.1g Na₂EDTA，使用6mol/L的盐酸溶液将体系pH调至2.0；

步骤二，固相萃取：使用规格为6cc/200mg的Oasis HLB小柱对步骤一处理后水样进行固相萃取，以实现其富集净化；

步骤三，使用超高液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪进行样品检测；

步骤四，多类抗生素定性和定量分析：通过对照样品谱图与标准物质谱图的保留时间和离子丰度比，对样品中的抗生素进行定性分析；随后，采用外标法进行样品的定量分析，获得样品中各类抗生素的含量。

进一步限定，微孔滤膜规格为0.7μm。

进一步限定，步骤二的具体操作过程为：

Step 1，使用5mL甲醇和10mL超纯水对HLB小柱进行活化，活化次数为3次；

Step 2，将水样在重力流的作用下通过HLB小柱；

Step 3，水样完成过柱后，依次使用5mL体积浓度为5％的甲醇水溶液和5mL超纯水淋洗HLB小柱，并将HLB小柱抽真空干燥处理30min；

Step 4，使用10mL洗脱液缓慢洗脱HLB小柱，洗脱液收集至10mL玻璃离心管中，并于45℃氮气作用下吹脱至近干，获得残渣；

Step 5，加入50％的甲醇水溶液复溶残渣，并将样品补足至1mL，漩涡混匀5min后，通过0.22μm针式滤器，收集滤液置于2mL棕色色谱瓶中，在-20℃条件下避光保存，待上机检测。

更进一步限定，Step 2中水样在重力流的作用下通过HLB小柱，过柱流速为1mL/min。

进一步限定，Step 4中洗脱液为体积比为4:3:3的甲醇、乙腈和乙酸乙酯的混合液。

进一步限定，步骤三的液相色谱检测条件为：BEH C18色谱柱，2.1mm×50mm，柱温25℃，流速0.25mL/min，进样体积10μL，流动相A为乙腈，B为体积分数为0.2％的甲酸水溶液；梯度洗脱条件为：0～7min，10％～20％A；7～11min，20％～40％A；11～12min，40％～95％A，保持2min；14～14.5min，95％～10％A；保持2.5min；各个阶段洗脱剂中流动相A与流动相B合计100％。

进一步限定，步骤三的质谱检测条件为：采用电喷雾离子源，以多反应离子监测(MRM)模式，在正离子模式下扫描离子对；离子源温度150℃；毛细管电压4000V；锥孔气流量50L/h；干燥气采用氮气，干燥气温度350℃，干燥气流速550L/h；碰撞气为氩气。

进一步限定，抗生素种类为四环素类、磺胺类和氟喹诺酮类抗生素。

更进一步限定，四环素类抗生素包括土霉素和强力霉素；磺胺类抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺甲噁唑；氟喹诺酮类抗生素包括恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星和氧氟沙星。

进一步限定，步骤四中外标法的操作过程为：通过检测系列浓度的抗生素标准溶液，以浓度为横坐标，抗生素定量离子对的峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，将样品谱图中各抗生素的峰面积代入标准工作曲线，进而获得样品中抗生素的含量。

本发明具有以下有益效果：本发明利用高效液相色谱串联质谱检测技术并结合固相萃取前处理方法，建立一种适用于养猪废水中多类抗生素的痕量定量分析方法，以满足养猪废水中常见抗生素残留量的快速筛查和检测要求，该方法具有如下优点：

(1)本发明能够同时检测养猪废水中属于3个不同的抗生素类别的10种抗生素，且在9分钟内能有效分离，克服了当前方法检测成本高、检测抗生素种类少的不足；

(2)本发明通过质谱条件的优化，降低了信噪比，与现有的其他方法相比，方法检出限低、灵敏度高、抗干扰能力强，检测下限达到2.5～10ng/L；

(3)在样品前处理方面，本发明只需要40mL水样，极大地减少了前处理时间。

附图说明

图1为样品pH值对10种抗生素回收率的影响图；

图2为甲醇、乙腈、异丙醇和乙酸乙酯分别作为洗脱溶剂时10种抗生素的回收率；

图3为甲醇、甲醇与乙腈的混合液(v/v＝1:1)、甲醇与乙酸乙酯的混合液(v/v＝1:1)、甲醇与乙腈及乙酸乙酯的混合液(v/v/v＝4:3:3)分别作为洗脱溶剂时10种抗生素的回收率；

图4为复溶溶剂中甲醇含量对仪器响应值的影响；

图5为复溶溶剂中甲醇含量对抗生素氮吹回收率的影响；

图6为洗脱液氮吹程度对抗生素回收率的影响；

图7为过柱流速对抗生素萃取回收率的影响。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

实施例1：

从哈尔滨某养猪场分三批采集养猪废水，利用下述方法检测废水内抗生素的残留量。

检测方法：

(1)样品前处理：采集养猪废水水样，8000r/min离心5min后，取上清液过0.7μm的微孔滤膜。随后，准确吸取40mL滤液，并用超纯水稀释至200mL，在水样中准确加入0.1gNa₂EDTA后，并采用6mol/L的盐酸溶液将pH调至2。然后，用规格为6cc/200mg的Oasis HLB小柱进行水样的富集净化，HLB小柱在使用前，需依次用5mL甲醇和10mL超纯水进行活化，并反复活化3次。随后将水样在重力流的作用下通过HLB小柱，过柱流速控制在1mL/min左右。水样完成过柱后，使用5mL 5％(v/v)的甲醇水溶液及5mL超纯水淋洗HLB小柱，并将HLB柱在负压条件下抽真空干燥30min。之后，用10mL体积比为4:3:3的甲醇、乙腈及乙酸乙酯的混合液作为洗脱液缓慢洗脱目标物，洗脱液收集至10mL玻璃离心管中，并于45℃氮气作用下吹脱至近干。随后，加入50％的甲醇水溶液复溶残渣，并将样品补足至1mL。将样品漩涡混匀5min后，通过0.22μm针式滤器，收集滤液至2mL棕色色谱瓶中，于-20℃避光保存至上机检测。

(2)UPLC-MS/MS分析：用超高液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪对检测样品进行定性定量分析。液相色谱检测条件为：选用BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm,1.7μm,Waters,USA)；进样体积10μL；柱温25℃；流动相A为乙腈，B为0.2％(v/v)的甲酸水溶液，流速0.25mL/min；梯度洗脱程序：0～7min，10％～20％A；7～11min，20％～40％A；11～12min，40％～95％A，保持2min；14～14.5min，95％～10％A；保持2.5min；各个阶段洗脱剂中流动相A与流动相B合计100％。质谱检测条件为：采用电喷雾离子源(ESI)，以多反应离子监测(MRM)模式，在正离子模式下扫描离子对；离子源温度150℃；毛细管电压4000V；锥孔气流量50L/h；干燥气采用氮气，干燥气温度350℃，干燥气流速550L/h；碰撞气采用氩气。

通过对照样品谱图与标准物质谱图的保留时间和离子丰度比，对样品中的抗生素进行定性分析。定量分析则采用外标法，主要通过检测系列浓度的抗生素标准溶液，以浓度为横坐标，定量离子对的峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，将样品谱图中各抗生素的峰面积代入标准工作曲线，进而获得样品中抗生素的含量。

上述过程所使用仪器、试剂和溶液的配制：

仪器：Aquity超高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用仪(Xevo TQ MS,Waters公司)、BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm,1.7μm,Waters公司)、RE-52型旋转蒸发仪(上海光学仪器厂)、TG16-WS型台式高速离心机(湖南湘仪试验仪器有限公司)、Milli-Q超纯水机(Millipore公司)、JC-220A-12型氮吹仪(青岛聚创环保设备有限公司)、固相萃取小柱(Oasis HLB，6cc/200mg，Waters公司)、12孔固相萃取装置(Supelco公司)。

试剂：磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲嘧啶(SMD)、磺胺甲噁唑(SMX)、磺胺甲基嘧啶(SMT)、恩诺沙星(ENR)、诺氟沙星(NOR)、土霉素(OTC)及环丙沙星(CIP)的标准品购自阿拉丁公司；强力霉素(DXC)及氧氟沙星(OFC)的标准品购自sigma公司。甲醇、乙腈、异丙醇、乙酸乙酯、甲酸均为HPLC级，购自Merck(Darmstadt,Germany)公司。Na₂EDTA、氢氧化钠，盐酸均为分析纯，实验所用超纯水(电导率18.2MΩ)由Milli-Q系统制取。

标准储存溶液：精确称取抗生素标准品0.01g，将标准品用少量0.1mol/L的氢氧化钠溶液溶解后，用甲醇定容至10mL，配制成1000mg/L的标准储备液，于-20℃避光保存。

标准混合溶液：精密量取10种抗生素的标准储备溶液各500μL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容，配制成10mg/L的混合标准中间溶液。混合标准工作液现用现配，用50％甲醇逐级稀释混合标准中间液而成。

三批样品的采集及检测时间分别为2019年的4月20日(春季)、7月19日(夏季)及11月21日(秋季)。养猪废水中10种抗生素残留量的检测结果如表4所示。

表4养猪废水中10种抗生素的残留量

注：表中N.D.表示未检出

由上表可知，秋季时养猪废水中的抗生素残留量明显高于春夏两季，且ENR、NOR及OTC分别是春、夏、秋季养猪废水中主要的抗生素残留。

实施例2：

本实施例为液相色谱检测条件的建立过程。

(1)液相色谱流动相的选取

甲醇及乙腈为反相色谱常用的有机溶剂，本发明对比甲醇及乙腈的体积比分别为100:0、80:20、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80及0:100时，10种待测抗生素色谱峰的分离效果。结果发现，随着有机相中乙腈所占比例的增加，10种抗生素色谱峰的分离度逐渐增大。因此，选用纯乙腈作为有机相。

然后，以乙腈为有机相，对比水相中分别添加0.1％甲酸、0.2％甲酸、0.3％甲酸、0.4％甲酸、5mmol/L乙酸铵、67mmol/L磷酸、67mmol/L磷酸二氢铵、50mmol/L柠檬酸、10mmol/L草酸时，10种化合物的色谱峰形、色谱峰的分离效果以及仪器响应值。结果发现，水相中添加0.2％甲酸时，能获得最佳的对称峰形状及分离效果、最高的峰值强度及响应值信号。因此，本方法选用乙腈-0.2％甲酸作为液相色谱的流动相。

(2)梯度洗脱程序的建立

梯度洗脱程序建立时，首先运行一次全范围梯度，即在60min内，乙腈由初始的5％线性变化为100％，流速采用0.2mL/min，观察10种抗生素的出峰情况，发现10种抗生素在乙腈比例为10％～40％的范围内均可洗出，确定10％～40％为初始和终止的流动相比例。随后通过改变梯度线性变化的速率，以改善各色谱峰的分离度。发现各物质的分离度随梯度变化速率的降低而增加，但却会造成色谱峰峰高的降低以及运行时间的增加。此外，柱温的改变同样会影响样品的分离度及出峰时间。通过对比色谱柱温分别为25℃、30℃、35℃、40℃及50℃条件下，样品色谱峰的分离效果。发现随着色谱柱温度的升高，各物质的保留时间降低，出峰时间提前，各色谱峰分离度减低。由此选择运行柱温为25℃。与此同时，在逐级提升流动相流速由0.1mL/min至0.4mL/min的过程中，发现流速的改变对样品分离度没有较大的影响，但却可以调整样品的保留时间，从而优化运行时间。随着流速的增加，样品出峰时间缩短，峰高变高，但柱压会上升。因此在尽可能缩短运行时间，且防止柱压过高损坏色谱柱的前提下，选择0.25mL/min为最佳的流动相流速。为防止待测样品之间的干扰，在每个洗脱程序间，均设置2min 95％有机相的冲洗时间。此外，为保证在检测下一个样品时，色谱柱条件的恢复至初始状态，在洗脱程序的最后，当有机相比例恢复至10％时，设置2.5min的平衡时间。

(3)最终建立的液相色谱条件

通过以上步骤，最终建立的色谱条件为：柱温25℃；流动相A为乙腈，B为0.2％(v/v)的甲酸水溶液，流速0.25mL/min；梯度洗脱程序：0～7min，10％～20％A；7～11min，20％～40％A；11～12min，40％～95％A，保持2min；14～14.5min，95％～10％A；保持2.5min；各个阶段洗脱剂中流动相A与流动相B合计100％。采用上述的色谱条件，抗生素混合标准液经液相色谱梯度洗脱后，10种抗生素的保留时间如表1所示。

表1目标抗生素保留时间和相关的UPLC-MS/MS参数

化合物	分子式	保留时间	母离子(m/z)	子离子(m/z)	锥孔电压(V)	碰撞能	电离模式
								OTC	C<sub>22</sub>H<sub>24</sub>N<sub>2</sub>O<sub>9</sub>	3.65	461.25	426.27*,201.1	18	20,35	ES+
DXC	C<sub>22</sub>H<sub>24</sub>N<sub>2</sub>O<sub>8</sub>	8.90	445.31	428.21*,154	22	16,24	ES+
								SD	C<sub>10</sub>H<sub>10</sub>N<sub>4</sub>O<sub>2</sub>S	1.71	251.12	156.06*,92.2	22	16,24	ES+
SMX	C<sub>10</sub>H<sub>11</sub>N<sub>3</sub>O<sub>3</sub>S	6.19	254.12	156.06*,108.0	26	16,24	ES+
								SMT	C<sub>11</sub>H<sub>12</sub>N<sub>4</sub>O<sub>2</sub>S	2.45	265.14	156.09*,91.9	24	18,24	ES+
SMD	C<sub>12</sub>H<sub>14</sub>N<sub>4</sub>O<sub>2</sub>S	3.21	279.17	186.16*,124.2	28	16,24	ES+
								CIP	C<sub>17</sub>H<sub>18</sub>FN<sub>3</sub>O<sub>3</sub>	4.17	332.24	314.28*,288.3	30	20,20	ES+
ENR	C<sub>19</sub>H<sub>22</sub>FN<sub>3</sub>O<sub>3</sub>	5.08	360.26	316.30*,342.4	32	18,20	ES+
								OFC	C<sub>18</sub>H<sub>20</sub>FN<sub>3</sub>O<sub>4</sub>	3.89	362.24	318.28*,261.5	32	18,24	ES+
NOR	C<sub>16</sub>H<sub>18</sub>FN<sub>3</sub>O<sub>3</sub>	3.87	320.23	276.29*,302.2	28	16,14	ES+

注：带*为定量离子

实施例3：

本实施例为质谱条件的建立过程。由于其高灵敏度，电喷雾离子源选择正离子模式对目标抗生素进行监测。分子离子的质子化加合物[M+H]⁺被用作定量每种抗生素的前体离子(母离子)。将抗生素分别配成1mg/L的标准溶液作为调谐液，利用Masslynx软件的Intellistart功能进行自动调谐，以针对各种抗生素的锥形电压、监测离子对及碰撞能进行优化，选择响应高且稳定的产物离子(子离子)作为定量离子，响应较低的产物离子为定性离子，用于MRM模式的监测。调谐后所得目标抗生素相关的质谱参数见表1。

实施例4：

本实施例为样品前处理及固相萃取条件的选取过程。

(1)固相萃取前，水样pH值的选取

在固相萃取前，用6mol/L的盐酸溶液将水样的pH调至2.0、3.0、4.0、5.0，并进行加标回收实验，每组三个样品，加标浓度为10μg/L，结果如图1所示。由图1可知，pH的调整对磺胺类抗生素的回收率影响不大，SD、SMT、SMD及SMX的回收率均在67％～84％之间；但氟喹诺酮类及四环素类抗生素的回收率受到较大程度的影响，即水样pH值越低，回收效果越佳。因此，综合考虑水样pH值对目标抗生素回收率的影响，在固相萃取前，将水样pH值调节为2.0。

(2)洗脱溶剂的选取

分别采用10mL甲醇、乙腈、异丙醇、乙酸乙酯4种有机溶剂作为洗脱溶剂，研究洗脱溶剂类型对目标抗生素回收率的影响，测试结果如图2所示。由图2可知，甲醇、乙腈及乙酸乙酯分别作为洗脱溶剂时，对于不同种类的抗生素，其洗脱效果各占优势。其中，甲醇对磺胺类抗生素的洗脱效果较佳，乙腈对喹诺酮类抗生素的洗脱效果较佳，而乙酸乙酯对四环素类抗生素有着更好的洗脱效果。

进一步对比甲醇、甲醇与乙腈的混合液(v/v＝1:1)、甲醇与乙酸乙酯的混合液(v/v＝1:1)、甲醇与乙腈及乙酸乙酯的混合液(v/v/v＝4:3:3)分别作为洗脱溶剂时，10种抗生素的回收效果，结果如图3所示。由图3可知，甲醇与乙腈及乙酸乙酯的混合液作为洗脱溶剂时，10种抗生素的回收率明显优于其他三种洗脱溶剂。因此，选用体积比为4:3:3的甲醇、乙腈及乙酸乙酯的混合液作为抗生素的洗脱溶剂。

(3)复溶溶剂的选取

样品经固相萃取柱富集净化后，可得10mL包含目标抗生素的洗脱液。为进一步浓缩样品，在上机测定前，需采用缓和的氮气流吹脱掉洗脱液中的有机溶剂，并采用复溶溶剂重新溶解残渣并定容。

复溶溶剂即为上机测定时的样品溶剂。当直接采用纯甲醇溶解氮吹后的残渣，上机测定时，发现存在着峰值失真的现象。为解决该问题，考虑使用甲醇水溶液作为样品的复溶溶剂。然而，复溶溶剂中甲醇含量不同时，则会对仪器的响应值产生影响。如图4所示为混合抗生素标准液(浓度为400ug/L)的样品溶剂中，甲醇含量从10％逐渐增至90％时，抗生素峰面积的变化。可以看出，随着样品溶剂中甲醇含量的增加，10种抗生素的峰面积基本呈现出了先增加后减少的趋势。当样品溶剂的有机相比例为50％时，仪器响应值较高，10种抗生素均可以得到较高的峰面积。

其次，为研究复溶溶剂中甲醇含量对氮吹过程中抗生素回收率的影响，将10mL含有10ug/L混合抗生素的甲醇、乙腈及乙酸乙酯的混合液氮吹至干，并分别采用10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％及90％的甲醇水溶液作为复溶溶剂，最终可得抗生素的氮吹回收率如图5所示。由图5可知，除20％及90％的甲醇水溶液作为复溶溶剂时，抗生素的氮吹回收率较低外，其他条件下抗生素的氮吹回收率相差不大。因此，综合考虑仪器响应值及抗生素的氮吹回收率，选择50％的甲醇水溶液作为氮吹后的残渣复溶溶剂。

(4)洗脱液氮吹程度的确定

为探究洗脱液的氮吹程度对目标抗生素萃取回收率的影响，将空白加标实验分为两组，一组实验的洗脱液被氮吹至完全干燥；而另一组洗脱液被氮吹至近干，每组三个样品，加标浓度为10μg/L，所得加标回收结果如图6所示。可以看出，除OTC的回收率不受氮吹程度影响外，其他抗生素的回收率在洗脱液被氮吹至近干时，明显优于洗脱液被氮吹至完全干燥时的情况，其中以磺胺类抗生素最为明显。因此，在使用氮气吹脱洗脱液中的有机溶剂时，将洗脱液吹至近干即可。

(5)过柱流速的选取

过柱流速决定着样品在固相萃取柱内的停留时间，即柱内填料对目标抗生素的吸附时间。过柱流速分别为3mL/min及1mL/min，空白加标浓度为20μg/L时，目标抗生素的回收率，如图7所示。可以看出，过柱流速对磺胺类抗生素回收率的影响较小。在两种流速条件下，磺胺类抗生素的回收率均在85.4％～114.1％之间。但对于四环素类及氟喹诺酮类抗生素，当过柱流速为1mL/min时，其回收率明显优于过柱流速为3mL/min时的情况。因此，在水样样品通过HLB小柱时，将其流速控制在1mL/min。

实施例5：

本实施例为抗生素的线性关系和方法检出限。

抗生素采用外标法进行定量，分别配制浓度为1、5、10、20、50、100、200μg/L的混合抗生素标准工作液，按照优化后的色谱条件依次进样分析。以物质浓度(x)为横坐标，目标分析物定量离子对应的峰面积(y)为纵坐标，建立标准曲线。此外，以三倍信噪比对应的样品浓度为目标分析物的检出限(LOD)，十倍信噪比对应的样品浓度为目标分析物的定量限(LOQ)。表2所示即为10种目标抗生素的工作曲线回归方程、线性范围、相关系数(R²)、检出限和定量限。

表2 10种抗生素的线性方程、回归系数、检出限和定量限

实施例6：

本实施例为本发明方法的准确度和精密度表征。

采用本发明提供的方法检测10种抗生素的加标回收率，对于低、中、高三个浓度水平，即10μg/L、20μg/L、100μg/L的加标量，目标抗生素的回收率均在74.1％～118.2％之间，且相对标准偏差在0.14％～11.74％的范围内，符合精密度要求。具体结果如表3所示。

表3 10种抗生素的回收率与相对标准偏差

Claims (6)

1.一种同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一，样品前处理：采集养猪废水水样，离心后取上清液通过微孔滤膜过滤，随后准确吸取40 mL滤液，并使用超纯水稀释至200 mL，加入0.1 g Na₂EDTA，使用6 mol/L的盐酸溶液将体系pH调至2.0；

步骤二，固相萃取：使用规格为6 cc/200 mg的Oasis HLB小柱对步骤一处理后水样进行固相萃取，以实现其富集净化；

所述的步骤二的具体操作过程为：

Step 1，使用5 mL甲醇和10 mL超纯水对HLB小柱进行活化，活化次数为3次；

Step 2，将经过前处理后的水样在重力流的作用下通过HLB小柱；

Step 3，水样完成过柱后，依次使用5 mL体积浓度为5%的甲醇水溶液和5 mL超纯水淋洗HLB小柱，并将HLB小柱抽真空干燥处理30 min；

Step 4，使用10 mL洗脱液缓慢洗脱HLB小柱，洗脱液收集至10 mL玻璃离心管中，并于45℃氮气作用下吹脱至近干，获得残渣；

Step 5，加入50%的甲醇水溶液复溶残渣，并将样品补足至1 mL，漩涡混匀5 min后，通过0.22 μm针式滤器，收集滤液置于2 mL棕色色谱瓶中，在-20℃条件下避光保存，待上机检测；

所述的Step 4中洗脱液是体积比为4:3:3的甲醇、乙腈和乙酸乙酯的混合液；

步骤三，使用超高液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪进行样品检测；

步骤四，多类抗生素定性和定量分析：通过对照样品谱图与标准物质谱图的保留时间和离子丰度比，对样品中的抗生素进行定性分析；随后，采用外标法进行样品的定量分析，获得样品中各类抗生素的含量；

所述的抗生素种类为四环素类、磺胺类和氟喹诺酮类抗生素；

所述的四环素类抗生素包括土霉素和强力霉素；所述的磺胺类抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺甲噁唑；所述的氟喹诺酮类抗生素包括恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星和氧氟沙星。

2.根据权利要求1所述的一种同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法，其特征在于，所述的微孔滤膜规格为0.7 μm。

3.根据权利要求1所述的一种同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法，其特征在于，所述的Step 2中经过前处理后的水样在重力流的作用下通过HLB小柱，过柱流速为1mL/min。

4.根据权利要求1所述的一种同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法，其特征在于，所述的步骤三的液相色谱检测条件为：BEH C18色谱柱，2.1 mm×50 mm，柱温25℃，流速0.25 mL/min，进样体积10 μL，流动相A为乙腈，B为体积分数为0.2%的甲酸水溶液；梯度洗脱条件为：0~7 min，10%~20% A；7~11 min，20%~40% A；11~12 min，40%~95% A，保持2min；14~14.5 min，95%~10% A；保持2.5 min；各个阶段洗脱剂中流动相A与流动相B合计100%。

5.根据权利要求1所述的一种同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法，其特征在于，所述的步骤三的质谱检测条件为：采用电喷雾离子源，以多反应离子监测模式，在正离子模式下扫描离子对；离子源温度150℃；毛细管电压4000 V；锥孔气流量50 L/h；干燥气采用氮气，干燥气温度350℃，干燥气流速550 L/h；碰撞气为氩气。

6.根据权利要求1所述的一种同步检测养猪废水中多类抗生素残留量的方法，其特征在于，所述的步骤四的外标法的操作过程为：通过检测系列浓度的抗生素标准溶液，以浓度为横坐标，抗生素定量离子对的峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，将样品谱图中各抗生素的峰面积代入标准工作曲线，进而获得样品中抗生素的含量。

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