CN108181408B - 一种利用液质联用快速检测万古霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于色谱检测技术领域，具体涉及一种利用液质联用快速检测万古霉素的方法。本发明将待测样品粉碎后加入提取试剂，混匀；然后超声提取，离心，得到上清液；采用水饱和正己烷对上清液进行萃取，得到待净化液；MCX固相萃取柱活化后，取待净化液上样，用甲醇淋洗除杂，然后用氨化甲醇洗脱，收集洗脱液；浓缩，定容液定容，过滤，得到净化液；采用高效液相色谱‑串联质谱仪对净化液进行检测。本发明很好地改进了现有技术检测动物源食品尤其是脂肪含量高的动物源食品过程中存在基质效应大、灵敏度低等问题，具有理想的回收率和精密度，方法最低检测限为0.3μg/kg，有效保证分析结果的重复性和重现性。

Description

一种利用液质联用快速检测万古霉素的方法

技术领域

本发明属于色谱检测技术领域，具体涉及一种利用液质联用快速检测万古霉素的方法。

背景技术

万古霉素(Vancomycin，分子式：C₆₆H₇₅Cl₂N₉O₂₄)是一种抗革兰氏阳性菌的三环糖肽类抗生素，其药力较强，号称“抗生素最后的王牌”，是人类目前对付顽固性耐药菌株的最后一道防线，用来治疗所有抗生素均无效的严重细菌感染。但万古霉素又有一定副作用，它可引起耳、肾毒性，皮肤过敏反应，神经系统毒性和器官功能紊乱。如果万古霉素被违规于动物养殖，很可能因其耐药性问题而影响动物性食品的安全、公共卫生以及进出口贸易，人若长期食用有万古霉素残留的食品，不仅会危及人体健康，而且会增加细菌产生抗药性的风险，导致消费者产生更严重的抗生素耐药性。

目前，万古霉素的主要检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、化学发光免疫法和荧光偏振免疫法等，测定对象多为人体或动物血液、脑脊液样品，而关于动物源食品中万古霉素的分析方法报道较少。林维宣、刘佳佳等采用液质联用法检测了牛奶中万古霉素的含量。王玉琴、卢剑、梁玉禧等采用液质联用法检测了猪肉等肌肉组织中万古霉素的含量。通过前处理方法的优化能有效降低基质复杂性，减少大量待检样品同时分析对液质系统造成的污染，但由于基质效应的干扰，为实现准确定量，一般都需要采用基质标准溶液进行定量，增加了检测工作的复杂性。綦艳、杜业刚等研究了采用液质联用法检测动物源食品中万古霉素残留量的方法，方法检出限为0.5μg/kg，方法灵敏度相对较低，而且定量离子与定性离子的选择尚不统一。

我国农业部第560号公告规定万古霉素为禁用兽药。卫生部2010年03月22日公布的第四批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》(整顿办函〔2010〕50号)中，将万古霉素列为可能违法添加的非食用物质，并注明“需要研制动物性食品中测定万古霉素的液相色谱-串联质谱法”。

目前，我国还没有与动物源食品中万古霉素残留量相关的检验标准及发明专利。为了给食品风险预警和食品安全监管提供技术支撑，建立一种检测动物源食品中万古霉素的方法势在必行。

发明内容

为了克服现有技术中万古霉素检测方法基质效应大、灵敏度低等缺点和不足，本发明的目的在于提供一种利用液质联用快速检测万古霉素的方法，该方法适于检测脂肪含量高的动物源食品中万古霉素含量，具有前处理简单，分析时间短，成本低，准确度高，检出限低，稳定性好等优点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用液质联用快速检测万古霉素的方法，包括下列步骤：

(1)待测样品粉碎后加入提取试剂，混匀；然后超声提取，离心，得到上清液；采用水饱和正己烷对上清液进行萃取，得到待净化液；

(2)MCX固相萃取柱活化后，取待净化液上样，用甲醇淋洗除杂，然后用体积分数为1～6％的氨化甲醇洗脱，收集洗脱液；浓缩，定容液溶解定容，过滤，得到净化液；

(3)采用超高效液相色谱-串联质谱仪对步骤(2)制得的净化液进行检测；

步骤(1)中所述的待测样品优选为动物源食品待测样品；

步骤(1)中所述的待测样品进一步优选为脂肪含量高的动物源食品待测样品；

步骤(1)中所述的待测样品的用量优选为1～2g；

步骤(1)中所述的待测样品和提取试剂的质量体积比(g：mL)优选为(1～2)：(10～30)；

步骤(1)中所述的提取试剂优选为体积比为(8～24)：(2～6)的0.1％(V/V)甲酸水溶液和乙腈的混合物；

步骤(1)中所述的混匀优选为涡旋振荡5～20min；

步骤(1)中所述的超声提取的条件优选为超声频率60～120Hz，提取10～30min；

步骤(1)中所述的离心的条件优选为3000～7000r/min离心2～10min；

步骤(1)中所述的上清液与水饱和正己烷的体积比优选为(8～20)：20；

步骤(1)中所述的萃取的具体操作优选为：将上清液加入水饱和正己烷中，涡旋混匀后，离心，得到待净化液(下清液)；

所述的离心的条件优选为转速4000～7000r/min离心5～15min；

步骤(2)中所述的活化的具体操作优选为依次用5mL甲醇、5mL 0.05～0.3mol/mL盐酸溶液活化MCX固相萃取柱；

步骤(2)中所述的待净化液的上样量优选为步骤(1)中提取试剂体积的一半；

步骤(2)中所述的甲醇的用量优选为5mL；

步骤(2)中所述的体积分数为1～6％的氨化甲醇用量优选为5mL；

步骤(2)中所述的浓缩优选为40℃氮气吹干；

步骤(2)中所述的定容液为体积比为90：10的0.1％(V/V)甲酸水溶液和乙腈的混合物；

步骤(2)中所述的定容优选为定容至1mL；

步骤(2)中所述的过滤优选为过0.22μm微孔滤膜；

步骤(3)中所述的检测的条件优选为：

色谱条件：色谱柱Poroshell 120EC-C₁₈(2.1mm×100mm，2.7μm)；柱温35℃；进样量10.0μL；流动相梯度洗脱程序如下所示：

质谱条件：电喷雾离子源；正离子模式；多反应监测(multiple reactionmonitoring，MRM)；干燥气温度300℃，干燥气流速6L/min；毛细管电压4000V；

步骤(3)中所述的检测的条件进一步优选为：

其他质谱参数为：

万古霉素定量离子对725.4/144.2(m/z)，碰撞能10V，碎裂电压120V，驻留时间120ms，碰撞池加速电压3V；

万古霉素定性离子对1：725.4/1307(m/z)，碰撞能10V，碎裂电压120V，驻留时间120ms，碰撞池加速电压1V；

万古霉素定性离子对2：725.4/100(m/z)，碰撞能15V，碎裂电压120V，驻留时间120ms，碰撞池加速电压3V；

步骤(3)中所述的检测优选为采用外标法以峰面积定量待测样品万古霉素含量；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明采用合适的超声条件对待测样品进行提取，避免超声对万古霉素的破坏，促进了万古霉素的溶出，可一次提取完全，避免多次提取带来的误差。

(2)本发明针对于脂肪含量高的动物源食品待测样品，采用合适的溶脂剂水饱和正己烷对待测样品进行脱脂处理，有效降低基质复杂性。

(3)本发明采用合适的固相萃取柱MCX固相萃取柱净化效果好。

(4)本发明很好地改进了现有技术检测动物源食品尤其是脂肪含量高的动物源食品过程中存在基质效应大、灵敏度低等问题，具有理想的回收率和精密度，方法最低检测限为0.3μg/kg，有效保证分析结果的重复性和重现性。

(5)本发明待测样品用量少、操作简单、灵敏度好、准确度高、成本低、省时高效，能够快速、准确地对动物源食品中万古霉素进行定量测定，具有通用性，可较好地满足实际工作的需要。

附图说明

图1是万古霉素标准曲线图。

图2是加标为50.0μg/kg的阴性进口冻猪背膘总离子流图。

图3是进口冻猪背膘阴性样品总离子流图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中涉及的实验仪器及实验试剂如下所示：

6470型超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Agilent公司)；VX-Ⅲ型涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司)；5810R型离心机(德国Eppendorf公司)；5982-9110型固相萃取装置(美国Agilent公司)；N-EVAP型氮吹仪(美国Organomation公司)；KQ 5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XPE 205型分析天平(感量0.01mg)(瑞士Mettler-Toledo公司)；Milli-Q Advantage A10型超纯水器(德国达姆施塔特默克集团)等。

万古霉素标准品(纯度94.1％)(德国Dr.Ehrenstorfer公司)；60mg/3mL，粒径30μmMCX固相萃取柱(美国Waters公司)；甲酸(质谱纯)、乙腈、甲醇(均为色谱纯)(美国FisherScientific公司)；其他试剂均为国产分析纯。

实施例1

在本实施例中，用万古霉素标准品摸索并确定最佳的色谱条件和质谱条件；用确定的最佳的色谱条件和质谱条件测定待测进口冻猪背膘，确定其是否含有万古霉素；在阴性进口冻猪背膘中添加万古霉素标准品，测定方法的回收率、精密度以及最低检测限，具体实验方法如下：

(1)标准溶液配制：分别精密称取10.63±0.01mg 94.1％的万古霉素标准品，用纯水溶解并定容至100mL，配成浓度为100μg/mL的标准储备溶液，4℃下保存。

(2)配制2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL六个浓度的万古霉素标准溶液，采用6470型超高效液相色谱-串联质谱仪上机检测；具体液相色谱条件为：色谱柱：Poroshell 120EC-C₁₈(2.1mm×100mm，2.7μm)；柱温：35℃；进样量：10.0μL；流动相梯度洗脱程序见表1；质谱条件：电喷雾离子源；正离子模式；多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)；干燥气温度300℃，干燥气流速6L/min；毛细管电压4000V；其他质谱参数见表2。

表1流动相梯度洗脱程序

表2万古霉素的质谱参数

注：*.定量离子。

(3)样品制备：随机抽取进口冻猪背膘可食部分500g，分割成小块后使用绞肉机彻底粉碎，备用；

(4)加标样品制备：准确称取(2.00±0.01)g粉碎好的阴性进口冻猪背膘于聚丙烯离心管中，分别加入浓度为10.0μg/kg、20.0μg/kg、50.0μg/kg、100.0μg/kg万古霉素标准工作液，开口静置过夜，待工作液中溶剂完全挥发，然后按照样品处理步骤进行提取和净化；

(5)样品预处理：

①在步骤(4)制得的阴性进口冻猪背膘加标样品中加入10mL提取试剂(8mL 0.1％(V/V)甲酸水溶液+2mL乙腈)，涡旋振荡5min；然后超声频率60Hz，提取30min；3000r/min离心10min，得到上清液；取全部上清液转移至另一洁净离心管中，在上清液中加入20mL水饱和正己烷，涡旋混匀后，4000r/min离心15min，得到待净化液(下清液)；

②依次用5mL甲醇、5mL 0.05mol/mL盐酸溶液活化MCX固相萃取柱，然后取5mL步骤①制得的待净化液上样，用5mL甲醇淋洗除杂，最后用5mL1％(V/V)氨化甲醇洗脱，收集洗脱液；40℃氮气吹干，用0.1％(V/V)甲酸水溶液+乙腈(90+10，V/V)定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜，得到净化液；

(6)采用6470型超高效液相色谱-串联质谱仪上机检测步骤②制得的净化液(具体方法同步骤(2))；

结果分析：

(1)标准曲线方程及相关系数

配制2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL六个浓度的万古霉素标准溶液，根据上述液相色谱-质谱条件上机，测定，得到万古霉素的线性方程为：y＝301.899326x-1.398541(y：色谱峰面积，x：浓度(ng/mL))，相关系数R²≥0.99994(图1)，进一步对粉碎后的待测进口冻猪背膘进行预处理，制备得到净化液，上机检测，确定不含有万古霉素(图3)。

(2)回收率和精密度

对添加了10.0μg/kg、20.0μg/kg、50.0μg/kg、100.0μg/kg万古霉素标准工作液的阴性进口冻猪背膘进行重复性试验(图2)。每个浓度取3份平行样，根据测定结果计算回收率和精密度，结果见表3。

表3万古霉素的回收率和精密度(n＝6)

(3)最低检测限

根据仪器响应值与噪音的比值为3来计算方法的检出限，万古霉素的最低检测限为0.5μg/kg。

(4)样品净化

本实施例在对待净化液净化时，比较了不同固相萃取柱的净化效果，其中，MCX固相萃取柱净化效果最佳，由于本发明针对的是脂肪含量高的动物源食品，HLB固相萃取柱对基质净化效果不理想，目标保留能力差。

实施例2

本实施例用实施例1中已确定的方法测定待测进口冻猪去骨前腿肉，确定其是否含有万古霉素；在阴性进口冻猪去骨前腿肉中添加万古霉素标准品，测定方法的回收率、精密度以及最低检测限。具体实验方法如下：

(1)标准溶液配制：分别精密称取10.63±0.01mg 94.1％的万古霉素标准品，用纯水溶解并定容至100mL，配成浓度为100μg/mL的标准储备溶液，4℃下保存；

(2)样品制备：随机抽取进口冻猪去骨前腿肉可食部分500g，分割成小块后使用绞肉机彻底粉碎，备用；

(3)加标样品制备：准确称取2.00±0.01g粉碎好的阴性进口冻猪去骨前腿肉于聚丙烯离心管中，分别加入浓度为10.0μg/kg、20.0μg/kg、50.0μg/kg、100.0μg/kg万古霉素标准工作液，开口静置过夜，待工作液中溶剂完全挥发，然后按照样品处理步骤进行提取和净化；

(4)样品预处理：

①在步骤(3)制得的阴性进口冻猪去骨前腿肉加标样品中加入20mL提取试剂(15mL 0.1％(V/V)甲酸水溶液+5mL乙腈)，涡旋振荡15min，超声频率100Hz，提取20min；5000r/min离心5min，得到上清液；取全部上清液转移至另一洁净离心管中，在上清液中加入20mL水饱和正己烷，涡旋混匀后，5000r/min离心10min，得到待净化液(下清液)；

②依次用5mL甲醇、5mL 0.2mol/mL盐酸溶液活化MCX固相萃取柱，然后取10mL步骤①制得的待净化液上样，用5mL甲醇淋洗除杂，最后用5mL 3％(V/V)氨化甲醇洗脱，收集洗脱液；40℃氮气吹干，用0.1％(V/V)甲酸水溶液+乙腈(90+10，V/V)定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜，得到净化液；

(5)采用6470型超高效液相色谱-串联质谱仪上机检测步骤②制得的净化液(具体方法同实施例1)；

结果分析：

(1)待测进口冻猪去骨前腿肉的检测

对粉碎后的待测进口冻猪去骨前腿肉进行预处理，制备得到净化液，上机检测，结果表明不含有万古霉素。

(2)回收率和精密度

对添加了10.0μg/kg、20.0μg/kg、50.0μg/kg、100.0μg/kg万古霉素标准工作液的阴性进口冻猪去骨前腿肉进行重复性试验。每个浓度取3份平行样，根据测定结果计算回收率和精密度，结果见表4。

表4万古霉素的回收率和精密度(n＝6)

(3)最低检测限

根据仪器响应值与噪音的比值为3来计算方法的检出限，则万古霉素的最低检测限为0.3μg/kg。

实施例3

本实施例用实施例1中已确定的方法测定待测进口冻猪去骨前腿皮，确定其是否含有万古霉素；在阴性进口冻猪去骨前腿皮中添加万古霉素标准品，测定方法的回收率、精密度以及最低检测限。具体实验方法如下：

(1)标准溶液配制：分别精密称取10.63±0.01mg 94.1％的万古霉素标准品，用纯水溶解并定容至100mL，配成浓度为100μg/mL的标准储备溶液，4℃下保存；

(2)样品制备：随机抽取进口冻猪去骨前腿皮可食部分500g，使用菜刀剁碎(由于肉皮韧性大，用绞肉机等目前的粉碎仪无法完全粉碎)，备用；

(3)加标样品制备：准确称取(2.00±0.01)g粉碎好的阴性进口冻猪去骨前腿皮于聚丙烯离心管中，分别加入浓度为10.0μg/kg、20.0μg/kg、50.0μg/kg、100.0μg/kg万古霉素标准工作液，开口静置过夜，待工作液中溶剂完全挥发，然后按照样品处理步骤进行提取和净化；

(4)样品预处理：

①在步骤(3)制备好的阴性进口冻猪去骨前腿皮加标样品中加入30mL提取试剂(24mL 0.1％(V/V)甲酸水溶液+6mL乙腈)，涡旋振荡20min，超声频率120Hz，提取10min；7000r/min离心2min，得到上清液；取20mL上清液转移至另一洁净离心管中。在上清液中加入20mL水饱和正己烷，涡旋混匀后，7000r/min离心5min，得到待净化液(下清液)；

②依次用5mL甲醇、5mL 0.3mol/mL盐酸溶液活化MCX固相萃取柱，然后取15mL步骤①制得的待净化液上样，用5mL甲醇淋洗除杂，最后用5mL 6％(V/V)氨化甲醇洗脱，收集洗脱液；40℃氮气吹干，用0.1％(V/V)甲酸水溶液+乙腈(90+10，V/V)定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜，净化液；

(5)采用6470型超高效液相色谱-串联质谱仪上机检测步骤②制得的净化液(具体方法同实施例1)；

结果分析：

(1)待测进口冻猪去骨前腿皮的检测

对剁碎后的待测进口冻猪去骨前腿皮进行预处理，制备得到净化液，上机检测，结果表明不含有万古霉素。

(2)回收率和精密度

对添加了10.0μg/kg、20.0μg/kg、50.0μg/kg、100.0μg/kg万古霉素标准工作液的阴性进口冻猪去骨前腿皮进行重复性试验。每个浓度取3份平行样，根据测定结果计算回收率和精密度，结果见表5。

表5万古霉素的回收率和精密度(n＝6)

(3)最低检测限

根据仪器响应值与噪音的比值为3来计算方法的检出限，则万古霉素的最低检测限为0.3μg/kg。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种利用液质联用快速检测万古霉素的方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)待测样品粉碎后加入提取试剂，混匀；然后超声提取，离心，得到上清液；采用水饱和正己烷对上清液进行萃取，得到待净化液；

(2)MCX固相萃取柱活化后，取待净化液上样，用甲醇淋洗除杂，然后用体积分数为1～6％的氨化甲醇洗脱，收集洗脱液；浓缩，定容液溶解定容，过滤，得到净化液；

(3)采用超高效液相色谱-串联质谱仪对步骤(2)制得的净化液进行检测；

步骤(1)中所述的待测样品的用量为1～2g；

步骤(1)中所述的提取试剂为体积比为(8～24)：(2～6)的0.1％V/V甲酸水溶液和乙腈的混合物；

步骤(1)中所述的待测样品和提取试剂的质量体积比为(1～2)：(10～30)；

步骤(1)中所述的上清液与水饱和正己烷的体积比为(8～20)：20；

步骤(3)中所述的检测的条件为：

色谱条件：色谱柱Poroshell 120EC-C₁₈ 2.1mm×100mm，2.7μm；柱温35℃；进样量10.0μL；流动相梯度洗脱程序如下所示：

质谱条件：电喷雾离子源；正离子模式；多反应监测；干燥气温度300℃，干燥气流速6L/min；毛细管电压4000V。

2.根据权利要求1所述的利用液质联用快速检测万古霉素的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的超声提取的条件为超声频率60～120Hz，提取10～30min。

3.根据权利要求1所述的利用液质联用快速检测万古霉素的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的活化的具体操作为依次用5mL甲醇、5mL 0.05～0.3mol/mL盐酸溶液活化MCX固相萃取柱。

4.根据权利要求1所述的利用液质联用快速检测万古霉素的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的待净化液的上样量为步骤(1)中提取试剂体积的一半。

5.根据权利要求1所述的利用液质联用快速检测万古霉素的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的检测的条件为：

其他质谱参数为：

万古霉素定量离子对725.4/144.2m/z，碰撞能10V，碎裂电压120V，驻留时间120ms，碰撞池加速电压3V；

万古霉素定性离子对1：725.4/1307m/z，碰撞能10V，碎裂电压120V，驻留时间120ms，碰撞池加速电压1V；

万古霉素定性离子对2：725.4/100m/z，碰撞能15V，碎裂电压120V，驻留时间120ms，碰撞池加速电压3V。

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